Спосіб визначення катехінів

Спосіб визначення катехінів, що включає відбір проби, виділення катехінів, взаємодію їх з хімічним реагентом і вимір аналітичного сигналу, який відрізняється тим, що виділення катехінів здійснюють сорбцією на сорбенті, виділені таким чином катехіни піддають взаємодії з іонами скандію (III), модифікованими на поверхні сорбенту, а вимір аналітичного сигналу здійснюють в присутності цитрату калію і лаурилсульфату натрію при рН=4,3-4,5. (19) (21) a201005405 (22) 05.05.2010 (24) 26.09.2011 (46) 26.09.2011, Бюл.№ 18, 2011 р. (72) БЕЛЬТЮКОВА СВІТЛАНА ВАДИМІВНА, БИЧКОВА ГАННА ОЛЕКСІЇВНА (73) ОДЕСЬКА НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) US 6333199 B1 25.12.2001 Шафигулин Р.В., Буланова А.В. ВЭЖХ частично ферментированных сортов чая. Вестник СамГУ Естественнонаучная серия. 2007, №2 (52), С. 134139 3 хвилин концентрація ацетонітрилу лінійно збільшувалася з 10 % до 30 %. Ідентифікацію компонентів проводили шляхом порівняння з автентичними зразками речовин. Для кількісного хроматографічного аналізу був використаний метод абсолютного градуювання. При побудові градуювальних залежностей готовили розчини стандартів з концентрацією 500 ppm і вводили у хроматограф різні їхні обсяги - 5, 10, 15, 20 мкл. Будували залежності площі піка від абсолютної маси стандарту катехіну в обсязі проби, що вводиться. Це рішення вибране прототипом. Прототип і винахід, що заявляється мають такі спільні операції: 1. відбір проби; 2. виділення катехінів; 3. взаємодія виділених катехінів з реагентом; 4. реєстрація аналітичного сигналу. Однак, спосіб за прототипом вимагає подвійну екстракцію - попереднє очищення катехінів шляхом екстракції хлороформом та екстракцію катехінів з водної фази етилацетатом. Розділення катехінів проводять на спеціальній колонці. Спосіб вимагає використання органічних токсичних розчинників - хлороформу й етилацетату, а також дорогу апаратуру. Усе це значно ускладнює виконання аналізу. В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб визначення катехінів, в якому за рахунок застосування реакції взаємодії катехінів з іонами скандію (ІІІ), реєстрації аналітичного сигналу у фазі сорбенту, забезпечити спрощення проведення аналізу та апаратурного оформлення аналізу, виключити токсичні розчинники. Поставлена задача вирішена в способі визначення катехінів, що включає відбір проби, виділення катехінів, взаємодію їх з хімічним реагентом і вимір аналітичного сигналу тим, що відокремлення катехінів здійснюється сорбцією на сорбенті й катехіни піддають взаємодії з іонами скандію (III), модифікованими на поверхні сорбенту, а вимір аналітичного сигналу здійснюється в присутності цитрату калію й аніонної поверхнево-активної речовини - лаурилсульфату натрію при рН=4,3-4,5. Новим у винаході, що заявляється, є використання реакції взаємодії катехінів з іонами Sc (III), яка проходить у фазі сорбенту - Sephadex G-75, з метою виділення катехінів з розчину й підсилення власної люмінесценції катехінів з іонами Sc (III) у присутності цитрат-іонів та аніонної поверхневоактивної речовини - лаурилсульфату натрію при рН=4,3-4,5. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, і досягненням технічного результату полягає в наступному. Спрощення виконання аналізу та апаратурного оформлення, виключення токсичних розчинників стало можливим завдяки наступним прийомам: 1. Застосуванню сорбції комплексів катехінів з іонами Sc (III) на сорбенті Sephadex G-75. Застосування такого прийому дозволяє поєднувати стадію попереднього відокремлення катехінів з отриманням сорбатів комплексів, які володіють люмінесцентними властивостями у твердій фазі 96074 4 сорбенту, що дозволяє проводити тест-визначення катехінів, що виключає стадію їх очищення хлороформом з наступною екстракцією етилацетатом. Це виключає використання токсичних розчинників - хлороформу й етилацетату, й, відповідно, спрощує виконання аналізу. 2. Використання твердофазної люмінесценції катехінів в присутності іонів скандію (III), які утворюють комплексну сполуку з катехінами на поверхні сорбенту. Застосування такого прийому дозволяє проводити визначення катехінів шляхом порівняння І люм. проби з І люм. стандартних зразків безпосередньо у фазі сорбенту, що виключає використання дорогого хроматографа. При цьому люмінесценцію збуджують ртутно-кварцовою лампою СВД-120А з світлофільтром УФС-2. Розчин катехінів при опромінюванні Уфсвітлом ртутної лампи з мaкc.=365 нм проявляє люмінесцентні властивості (изл.=471 нм), але інтенсивність її люмінесценції невелика. Власна люмінесценція катехінів зростає у 12,5 разу на сорбентах, зрушується при цьому максимум люмінесценції на 17 нм й складає изл.=488 нм. При комплексоутворенні з іонами скандію (III) інтенсивність люмінесценції (І люм.) катехінів посилюється у 2 рази за рахунок того, що зростає жорсткість молекули й зменшуються внутрішньо молекулярні втрати енергії збудження. Максимум люмінесценції сорбату комплексу катехінів зі скандієм при цьому зрушується в область довгих хвиль й складає =507 нм. У присутності цитрату калію й аніонної поверхнево-активної речовини - лаурилсульфату натрію максимум зрушується в область довгих хвиль й складає =516 нм. Вплив різних чинників на інтенсивність люмінесценції комплексу катехінів з іонами скандію (III) наведено на графіках, де: фіг. 1 - залежність інтенсивності люмінесценції комплексів катехінів з іонами скандію (III) від рН розчину; фіг. 2 - залежність інтенсивності люмінесценції комплексів катехінів з іонами скандію (III) від концентрації іонів скандію (III); фіг. 3 - залежність інтенсивності люмінесценції комплексів катехінів з іонами скандію (III) від часу висушування сорбенту. Експериментально були підібрані сорбенти, на яких І люм. катехінів найбільша. Досліджена сорбція комплексу на різних сорбентах: на силікагелі 100/160, 100/400, фосфаті алюмінію, Sephadex G50, G-75, G-150, а також на пінополіуретані, цеолітах (СаА, NaA). Максимальна інтенсивність люмінесценції комплексу спостерігається на Sephadex G-75, який іммобілізований іонами скандію (III), саме тому він був вибраний для подальшого аналізу. Час сорбції катехінів становить 15-20 хвилин. Інтенсивність люмінесценції катехінів залежить від рН розчину, з якого проводиться сорбція. Ця величина становить рН=4,3-4,5 (Фіг. 1). Для створення цього значення рН в розчині використовували ацетатний буферний розчин з рН=4,3. Інтенсивність люмінесценції сорбату залежить від концентрації іонів скандію (III) (Фіг. 2) і часу висушування сор 5 96074 бенту (Фіг. 3). Як видно з рисунка максимальна інтенсивність люмінесценції спостерігається при висушуванні протягом 120 хвилин. Вивчення залежності інтенсивності люмінесценції катехінів від кількості скандію (III) на Sephadex G-75 показало, що інтенсивність люмінесценції збільшується зі збільшенням концентрації скандію (III). Нами обрана концентрація скандію -2 (III) – 110 моль/л. Лінійна межа залежності інтенсивності люмінесценції комплексу від концентрації катехінів спостерігається у діапазоні концентрацій (0,01-0,5) мг/мл. Інтенсивність люмінесценції сорбату комплексу збільшується у 2 рази у присутності цитрату калію й у 1,5 разу у присутності аніонної поверхнево-активної речовини - лаурилсульфату натрію. Приклад. Визначення катехінів у зеленому чаї «Аскольд». Наважку 2 г повітряно-сухої сировини листя чаю - переносять у колбу, додають 150 мл дистильованої води й перемішують на магнітній мішалці протягом 120 хвилин при температурі 50±5 °С. Отриманий екстракт відфільтровують на фільтрі «синя стрічка» і видаляють листя чаю. Наважку 100 мг Sephadex G-75, попередньо обробленої 1 мл водного розчину хлориду скандію -2 (III) (110 моль/л), поміщають у пробірку, перемі 6 шують протягом 5 хвилин до гелеподібного стану. Потім додають 1 мл водного екстракту чаю й 0,2 -2 мл розчину цитрату калію (110 моль/л), 0,2 мл -2 лаурилсульфату натрію (110 моль/л) й 0,3 мл ацетатного буферного розчину з рН=4,3 й перемішують протягом 15 хвилин. Осад відфільтровують і висушують протягом 120 хвилин при 100 °С. Далі розтирають до порошкоподібного стану і реєструють інтенсивність люмінесценції комплексу, іммобілізованого на сорбенті при изл.=516 нм, при збудженні люмінесценції світлом ртутної лампи зі світлофільтром УФС-2 (возб=365 нм). Інтенсивність люмінесценції проби порівнюють з інтенсивністю люмінесценції стандартних зразків, що містять різні кількості катехінів (0,005-2,5) мг/мл і підготовлених так, як описано вище. На підставі порівняльної оцінки роблять висновок про вміст катехінів в зразку. В екстракті зеленого чаю «Аскольд» знайдено 93 мг катехінів у 1 г повітряно-сухого чаю. На основі розробленої методики визначено вміст катехінів у чорних й зелених чаях різних виробників (Табл. 1). Результати визначення катехінів перевірені методом «введено-знайдено» і показана правильність розробленої методики (Табл. 2). Таблиця 1 Вміст катехінів у чаї № 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Чай Вміст катехінів, мг/г сухого чаю «Майский черный среднелистовой «Золотые лепестки», Цейлонская 6,75 коллекция» «Майский черный крупнолистовой байховый «Царська корона» 8,25 «Майский зеленый крупнолистовой «Китайский дракон», Китайская 45 коллекция» «Майский черный среднелистовой байховый, Цейлонская коллек12,8 ция» «Lipton», Yellow label tea, листовой» 27,3 «Lipton», Orange Jajpur» 15 «Элегия», Китайский зеленый листовой байховый» 52,2 «Ahmad Tea», Green Tea» 20,7 «Ahmad Tea», Ceylon Tea» 17,6 «Аскольд», Зеленый GP китайский - Ганн Паудер» 93 «Хэйлис», крупнолистовой цейлонский черный» 36 «Принцесса Ява», китайский зеленый байховый» 262,5 «Майский «Deluxe Quality Riston tea». Selected Premium Leaf» 10,8 «Лисма», зеленый китайский крупнолистовой» 84 Таблиця 2 Результати визначення катехінів у чаї методом «введено-знайдено» Добавка мг 0,150 0,20 Знайдено в пробі з добавкою, мг 0,361 0,44 Знайдено в пробі, мг 0,21±0,02 0,24±0,01 Sr 0,048 0,052 7 96074 8 9 Комп’ютерна верстка Литвиненко Л. 96074 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601