Ферментний препарат з антибактеріальною дією

Реферат: Винахід належить до медицини та стосується ферментного препарату з антибактеріальною дією, що являє собою суміш двох ферментів: лізоциму і панкреатину у визначеному співвідношенні. UA 99210 C2 (12) UA 99210 C2 UA 99210 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнології, зокрема до медицини, конкретно до ферментного препарату, який має антибактеріальну дію. Відомі сферичні протизапальні і протиракові ферментні гранульовані препарати [Заявка Кореї № 20070012040. А61К 9/16. Spherical anti-inflammatory and anti-cancer enzyme granules and method for preparing the same / H.J. Hwan, K.J. Cheon, K.H. Soo, K.W. Sik- заявл. 22.07.2005; опубл. 25.01.2007], які містять такі ферменти, як трипсин, хімотрипсиноген, дезоксирибонуклеазу, лізоцим, стрептокіназу. Відомі також способи приготування таблетованих сумішей активних компонентів, які мають стійкість до збереження своєї форми [Заявка Японії 61-143316. А61К31/455. Preparation of stable tablet / Terazono Takashi. - заявл. 01.07.1986; опубл. 25.04.1995]. Активні компоненти: лактобацили (Streptococcus faecalis), панкреатин, лізоцим гідрохлорид. Відомі також поліферментні препарати, що окрім лізоциму білка курячих яєць, містять також великий набір інших ферментів: панкреатин, папаїн, бромелайн, трипсин, супероксиддисмутазу, тм -хімотрипсин (препарат "Somazyme" Life plus , США) [http://www.lifeplusvitamins.com/somazyme.htm]. Призначення - підвищення імунного статусу організму в цілому, забезпечення правильної роботи підшлункової залози. Найближчим, з відомих заявнику, є поліферментний препарат "Lysozyme Plus" виробництва Life Extension Institute, Scottsdale, США [http://www.lifeextensionvitamins.com]. Препарат містить панкреатин, папаїн, бромелайн, рутин, трипсин, тимус, амілазу, ліпазу, лізоцим, целюлазу, хімотрипсин. Його дія - міцний протизапальний засіб, який застосовують, наприклад, при артритах, спортивних травмах. Даний препарат вибрано прототипом. Прототип і винахід, що заявляються, мають спільні компоненти: - лізоцим; - панкреатин. Але, як відомі вищенаведені ферментні препарати, так і ферментний препарат за прототипом не виявляють антибактеріальну активність. В основу винаходу поставлено задачу створити новий ферментний препарат, в якому шляхом підбору двох конкретних ферментів та їх співвідношення, забезпечити отримання двокомпонентного ферментного препарату з антибактеріальною дією. Поставлена задача вирішена ферментним препаратом, що містить гідролітичний фермент лізоцим з білка курячих яєць і фермент панкреатин при наступному співвідношенні вказаних компонентів, мас. %: лізоцим 30-70 панкреатин 70-30. Заявлений препарат виявляє бактерицидну дію до таких мікроорганізмів, як Micrococcus luteus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Planococcus citreus. В науково-технічній і патентній літературі не описані ферментні препарати, які містять лізоцим і панкреатин, з антибактеріальною дією, а також суттєве підвищення лізоцимної активності самого лізоциму при суміщенні його з панкреатином. Відомо, що панкреатин не є активним щодо лізоциму як білку, тобто панкреатин не гідролізує лізоцим і останній не втрачає своєї активності. Проведено попередні досліди (табл. 1), за допомогою яких доведено, що додавання трипсину до лізоциму, а також часткове заміщення лізоциму трипсином дозволяє створити бінарні ферментні композиції, які за лізоцимною активністю перевищують власно лізоцим. Також показано, що можливе підвищення лізоцимної активності у випадку часткового заміщення лізоциму сумішшю трипсину і панкреатичної ліпази. В той же час кожен з розглянутих ферментів - трипсин і ліпаза не виявляють окремо антибактеріальної дії, тобто у випадку використання таких композицій імовірно спостерігається синергічний ефект. Це явище можна пояснити, виходячи з будови клітинної стінки бактерій, яка побудована переважно з мукополісахариду, до складу якого входять залишки N-ацетилглюкозаміну і N-ацетилмурамової кислоти, які перехресно зв'язані короткими пептидами. Бактерицидний ефект лізоциму зумовлений його здатністю гідролізувати -D-(14), а також, можливо, -D-(12) глікозидні зв'язки мукополісахариду. Сумісна дія лізоциму, що розщеплює глікозидні зв'язки мукополісахариду, а також трипсину, що додатково розщеплює пептидні зв'язки, ліпази, що гідролізує відповідно складноефірні зв'язки ліпідів, які присутні у складі клітинної стінки деяких бактерій, призводить до підвищення сумарної активності ферментних композицій. Враховуючи, що у складі панкреатину присутні як трипсин, так і ліпаза, а додаткове їх вилучення і очистка супроводжується підвищенням ціни на відповідні ферменти, було досліджено можливість створення двокомпонентних ферментних композицій, що містять лізоцим і панкреатин. 1 UA 99210 C2 5 10 15 20 25 30 Суміщення лізоциму з панкреатином підвищує активність двокомпонентної суміші, хоча самостійно панкреатин не виявляє лізоцимної активності (табл. 2). Ферментний препарат отримували наступним чином. 3 3 Ферменти: лізоцим (5 мг у 50 см дистильованої води) і панкреатин (5 мг у 50 см дистильованої води) швидко змішували у різному співвідношенні при кімнатній температурі 20±2 °C. Одразу після перемішування додавали у реакційну суміш останні компоненти (K-Na3 фосфатний буферний розчин, трилон Б, субстрат (10 мг/см )) і вимірювали лізоцимну активність (у даному випадку, змінення оптичної густини системи) окремо панкреатину, лізоциму і у суміші лізоцим-панкреатин, використовуючи як субстрат Micrococcus luteus загально прийнятим методом згідно патенту Російської Федерації № 2294373. Приклад 1 Отримували ферментний препарат, як наведено вище. Компоненти брали у наступному співвідношенні, мас. %: лізоцим - 30, панкреатин - 70. Приклад 2 Отримували ферментний препарат, як наведено вище. Компоненти брали у наступному співвідношенні, мас. %: лізоцим - 50, панкреатин - 50. Приклад 3 Отримували ферментний препарат, як наведено вище. Компоненти брали у наступному співвідношенні, мас. %: лізоцим - 70, панкреатин - 30. Лізоцимна активність отриманих ферментних сумішей за прикладами 1-3 наведена в табл. 1. Дані, наведені в табл. 1, вказують на те, що найбільш суттєве збільшення лізоцимної активності відносно контролю спостерігається при співвідношенні лізоциму і панкреатину у мас. %: 50÷50, 70÷30, відповідно. Бактерицидний ефект сумішей лізоцим-панкреатин наведено у табл. 3. Дані, наведені в табл. 3, вказують на те, що при співвідношенні лізоциму і панкреатину у мас. %: 70÷30, розширився спектр дії суміші на Гр бактерії (Pseudomonas aeruginosa, Planococcus citreus). Отриманий ферментний препарат застосовували для одержання антибактеріального засобу у формі таблеток, до складу яких увійшли наступні компоненти, мас. %: лізоцим білку курячих яєць 30-70 панкреатин 70-30 фармацевтично допустимий лактози носій моногідрат. Таблиця 1 Зміна оптичної густини сумішей лізоцим-трипсин-ліпаза за Micrococcus luteus № зразка 1 2 3 4 5 6 7 Ферменти Лізоцим (л) (контроль) Трипсин (т) Ліпаза (лп) 70 % л + 30 % лп 100 % л + 40 % т 60 % л + 40 % т + 40 % лп 40 % л + 30 % т + 30 % лп Зміна оптичної густини суміші Збільшення лізоцимної активності за Micrococcus luteus відносно контролю, % 0,455 0 0 0,516 0,541 не активний не активна 13,4 18,9 0,583 28,1 0,522 14,8 Таблиця 2 Зміна оптичної густини сумішей лізоцим-панкреатин за Micrococcus luteus № зразка 1 Ферменти Лізоцим (л) (контроль) Зміна оптичної густини суміші Збільшення лізоцимної активності за Micrococcus luteus відносно контролю, % 0,455 2 UA 99210 C2 Таблиця 2 № зразка 2 3 4 5 Зміна оптичної густини суміші Збільшення лізоцимної активності за Micrococcus luteus відносно контролю, % Ферменти Панкреатин (п) (контроль) 50 % л + 50 % п 70 % л + 30 % п 70 % п + 30 % л не активний 0 0,680 0,635 0,674 49,6 39,7 48,3 Таблиця 3 Бактерицидний ефект сумішей лізоцим-панкреатин № п/п Мікроорганізми 1 Micrococcus luteus 3 Escherichia coli 4 Klebsiella pneumoniae 5 6 Pseudomonas aeruginosa Planococcus citreus Зони лізису, мм Лізоцим білка курячих Панкреатин + лізоцим (70 % + яєць 30 %) 35 35 бактеріостатична дія 25 25 бактеріостатична дія 25 25 20 30 35 42 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Ферментний препарат, що містить лізоцим і панкреатин, який відрізняється тим, що вказані ферменти препарат містить при наступному співвідношенні, мас. %: лізоцим 30-70 панкреатин 70-30. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3