Рекомбінантна молекула днк, яка вказує на присутність трансгенної події mon 87427 маїсу

УКРАЇНА (19) UA (11) 115762 (13) C2 (51) МПК (2017.01) C12N 15/29 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) C12Q 1/68 (2018.01) A01H 5/00 МІНІСТЕРСТВО ЕКОНОМІЧНОГО РОЗВИТКУ І ТОРГІВЛІ УКРАЇНИ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (21) Номер заявки: a 2012 07623 Дата подання заявки: 16.11.2010 (22) (24) Дата, з якої є чинними 26.12.2017 права на винахід: (31) Номер попередньої 61/263,530, 61/263,526 (32) Дата подання 23.11.2009, 23.11.2009 заявки відповідно до Паризької конвенції: попередньої заявки відповідно до Паризької конвенції: (33) Код держави-учасниці US, Паризької конвенції, US до якої подано попередню заявку: (41) Публікація відомостей 25.09.2012, Бюл.№ 18 про заявку: (46) Публікація відомостей 26.12.2017, Бюл.№ 24 про видачу патенту: (86) Номер та дата подання міжнародної заявки, поданої відповідно до Договору PCT PCT/US2010/056853, 16.11.2010 (72) Винахідник(и): Фен Пол К.К. (US), Фонсека Агустін Е. (US), Гарнаат Карл У. (US), Ередіа Оскар (US), Хуан Цзиньтай (US), Келлі Ребекка А. (US), Ци Юлінь (US), Стекер Мартін А. (US) (73) Власник(и): МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЛЛС, 800 North Lindbergh Boulevard, Mail Zone E1NA, St. Louis, MO 63167, United States of America (US) (74) Представник: Мошинська Ніна Миколаївна, реєстр. №115 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: US 2007/0130645 A1, 07.06.2007 US 2003/0106096 A1, 05.06.2003 "Brassica napus clone JBr037K23, *** SEQUENCING IN PROGRESS ***, 9 unordered pieces.", DATABASE ENA, (20090624), Database accession no. AC236899, "OG2AR19TH ZM_0.7_1.5_KB Zea mays genomic clone ZMMBMa0747C14, genomic survey sequence.", DATABASE ENA, (20030825), Database accession no. CG220210, "Oryza sativa Japonica Group transgenic plant p0282 integrated T-DNA(Ds), flanking sequence.", DATABASE ENA, (20030102), Database accession no. AF463856 WO 2009/085982 A1, 09.07.2009 EP 0975778 B1, 13.06.2007 US 2007/130645 A1, 07.06.2007 US 2004/034888 A1, 19.02.2004 UA a200814980, 25.03.2009 (54) РЕКОМБІНАНТНА МОЛЕКУЛА ДНК, ЯКА ВКАЗУЄ НА ПРИСУТНІСТЬ ТРАНСГЕННОЇ ПОДІЇ MON 87427 МАЇСУ (57) Реферат: UA 115762 C2 (12) UA 115762 C2 Винахід належить до трансгенної події MON 87427 маїсу і рослин, клітин рослини та насіння, що містять подію MON 87427. Винахід також належить до нуклеотидів, специфічних для трансгенної події MON 87427. Винахід також стосується відносної шкали розвитку, придатної для моніторингу і визначення репродуктивного розвитку у маїсу, яка узгоджує відмінності в розвитку серед різних сортів маїсу. Дана шкала придатна для визначення оптимального часу схеми обробки, для якої стадія розвитку волоті є важливим фактором, включаючи різні способи отримання гібридного насіння. UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки Дана заявка має пріоритет по попередній заявці США № 61/263526, зареєстрованій 23-го листопада 2009 р., яка, таким чином, повністю включена в даний опис, і по попередній заявці США № 61/263530, зареєстрованій 23-го листопада 2009 р., яка, таким чином, повністю включена в даний опис. Включення списку послідовностей Список послідовностей, який міститься в файлі під назвою "56887-0001_seqlisting. txt", розмір якого становить 19,6 кілобайт (розмір, виміряний в Microsoft Windows®), і який був створений 12-го листопада 2010 р., реєструється при цьому шляхом електронної подачі і, таким чином, повністю включається в цей документ шляхом посилання. Галузь техніки Винахід стосується галузі розведення рослин, їх досліджень і сільського господарства. Більш конкретно, винахід стосується трансгенної події MON 87427 маїсу і нуклеотидних молекул, рослин, частин рослин, насіння рослини, клітин рослини, сільськогосподарських продуктів і способів, пов'язаних з трансгенною подією MON 87427 маїсу. Він також стосується прогнозу розвитку волотей маїсу і використання цього в способах схрещування рослин, досліджень і сільському господарстві, і отриманого за допомогою цього гібридного насіння маїсу. Передумови створення винаходу Зернові культури, що мають нові бажані ознаки, корисні для схрещування рослин, досліджень і сільського господарства. Такі культури можна отримувати з використанням біотехнологічних способів. Однак отримання і відбирання прийнятної для комерційних цілей трансгенної події може вимагати проведення інтенсивних досліджень, аналізу і характеристики великого числа подій трансформації індивідуальних рослин для відбирання події, що має як бажану ознаку, так і оптимальні фенотипічні і агротехнічні характеристики, необхідні для її відповідності комерційним і сільськогосподарським цілям. Для даного процесу відбирання події часто необхідні теплиці і польові випробування з великим числом подій протягом багатьох років, у множині місць і при різних умовах, для того, щоб можна було зібрати достовірну кількість агротехнічних, фенотипічних і молекулярних даних. Отримані в результаті дані і спостереження повинні бути потім проаналізовані командами вчених і агрономів з метою відбирання комерційно придатної події. Винахід стосується такої комерційно придатної події, результатом якої є нова бажана ознака у маїсу. Точне визначення репродуктивної зрілості маїсу також корисне для схрещування рослин, досліджень і сільськогосподарських цілей, наприклад, при отриманні гібридного насіння маїсу. Засоби, що звичайно використовуються в даній галузі для прогнозування і оцінки стадій росту і розвитку маїсу, включають шкали, наприклад, V-стадії, які основані на вегетативних характеристиках, і градусо-одиниці росту (GDU), які основані на числі градусо-днів росту. Однак обидва ці підходи дають оцінку стадії розвитку волоті, яка сильно варіює серед генотипів маїсу. Тому, використання вказаних вимірювань може привести до пропускання оптимально ефективного часу у випадку схем обробки, для яких стадія розвитку є важливим фактором. Винахід стосується Відносної шкали розвитку, основаної на розвитку волоті, узгодженого по генотипах, який корисний для моніторингу і прогнозу розвитку волоті у рослин маїсу з різними генотипами. Короткий виклад суті винаходу Винахід стосується рекомбінантної молекули ДНК, що включає в себе молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-8. Винахід також стосується рекомбінантної молекули ДНК, утвореної з'єднанням вбудованої гетерологічної молекули нуклеїнової кислоти і геномної ДНК рослини маїсу, клітини рослини або насіння. Винахід також стосується рекомбінантної молекули ДНК, отриманої з трансгенної події MON 87427 маїсу, репрезентативний зразок насіння якого був поміщений в Американську колекцію типових культур (АТСС®) під номером доступу № PTA7899. Винахід також стосується рекомбінантної молекули ДНК, яка являє собою амплікон діагностичний відносно присутності ДНК, отриманої з трансгенної події MON 87427 маїсу. Винахід також стосується рекомбінантної молекули ДНК, яка знаходиться в рослині маїсу, клітині рослини, насінні, потомстві рослини, частині рослини або товарному продукті, отриманому з трансгенної події MON 87427 маїсу. Винахід також стосується молекули ДНК, що включає в себе молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність з достатньою довжиною безперервної нуклеотидної послідовності з SEQ ID NO: 10 для функціонування як зонда ДНК, яка гібридизується при жорстких умовах з молекулою ДНК, що включає в себе нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10, і не гібридизується при жорстких умовах з молекулою 1 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК, що не включає в себе нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10. Винахід також стосується пари молекул ДНК, що складається з першої молекули ДНК і другої молекули ДНК, відмінної від першої молекули ДНК, причому кожна з першої і другої молекул ДНК містить молекулу нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність з достатньою довжиною безперервної нуклеотидної послідовності з SEQ ID NO: 10 для функціонування як ДНКпраймери при спільному використанні в реакції ампліфікації з ДНК, отриманої з події MON 87427, щоб отримати амплікон, діагностичний відносно ДНК трансгенної події MON 87427 маїсу в зразку. Винахід також стосується способу детекції присутності молекули ДНК, отриманої з MON 87427, в зразку за допомогою контакту зразка із зондом ДНК, піддавання вказаного зразка і вказаного зонда ДНК жорстким умовам гібридизації і детекції гібридизації зонда ДНК з молекулою ДНК в зразку, причому гібридизація зонда ДНК з молекулою ДНК вказує на присутність молекули ДНК, отриманої з трансгенної події MON 87427 маїсу, в зразку. Винахід також стосується способу детекції присутності молекули ДНК, отриманої з трансгенної події MON 87427 маїсу, в зразку за допомогою контакту зразка з парою молекул ДНК, проведення реакції ампліфікації, достатньої для отримання амплікону ДНК, що містить послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10, і детекції присутності ДНКамплікону в реакції, причому присутність ДНК-амплікону в реакції вказує на присутність молекули ДНК, отриманої з MON 87427, в зразку. Винахід також стосується набору для детекції ДНК, що включає в себе щонайменше одну молекулу ДНК, що містить нуклеотидну послідовність з достатньою довжиною безперервної нуклеотидної послідовності з SEQ ID NO: 10 для функціонування як ДНК-праймер або проба, специфічна для детекції присутності ДНК, отриманої з трансгенної події MON 87427 маїсу, причому детекція ДНК є діагностичною відносно присутності ДНК трансгенної події MON 87427 маїсу в зразку. Винахід також стосується рекомбінантної рослини маїсу, її насіння, клітини або частини, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10. Винахід також стосується рекомбінантної рослини маїсу, насіння, клітини або частини рослини, що мають тканино-вибіркову стійкість до обробки гербіцидом гліфосат. Винахід також стосується рекомбінантної рослини маїсу, насіння, клітини або частини рослини, геном яких продукує амплікон, що містить молекулу ДНК, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10, при тестуванні в способі ДНКампліфікації. Винахід також стосується рослини або насіння маїсу, причому рослина або насіння маїсу отримані з трансгенної події MON 87427 маїсу. Винахід також стосується рослини або насіння маїсу, причому рослина або насіння маїсу є гібридом, що має щонайменше одну батьківську рослину, отриману з трансгенної події MON 87427 маїсу. Винахід також стосується неживого рослинного матеріалу, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10. Винахід також стосується мікроорганізму, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10. Винахід також стосується мікроорганізму, який є рослинною клітиною. Винахід також стосується продукту споживання, що отримується з трансгенної події MON 87427 маїсу і містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 110, причому детекція нуклеотидної послідовності в зразку, отриманому з продукту споживання, визначає те, що продукт споживання отриманий з трансгенної події 87427 маїсу. Винахід також стосується продукту споживання, вибраного з групи, що складається з цілого або переробленого насіння, харчування для тварин, олії, борошна крупного помелу, борошна, пластівців, висівок, біомаси і паливних продуктів. Винахід також стосується способу виготовлення продукту споживання шляхом отримання рослини маїсу або її частини, що включають трансгенну подію MON 87427 маїсу, і виготовлення продукту споживання маїсу з рослини маїсу або її частини. Винахід також стосується способу контролю бур'янів в полі шляхом висаджування рослин MON 87427 в поле і застосування ефективної дози гербіциду гліфосату для контролю бур'янів в полі без ураження рослин трансгенної події MON 87427 маїсу. Винахід також стосується способу контролю бур'янів в полі, в якому ефективна доза гербіциду гліфосату складає від приблизно 0,1 фунта до приблизно 4 фунтів на акр. Винахід також стосується способу отримання рослини маїсу, яка стійка до застосування гербіциду гліфосату в результаті статевого схрещування рослини трансгенної події MON 87427 маїсу, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, 2 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10, з другою рослиною маїсу, таким чином отримуючи насіння, збирання насіння, отриманого в результаті схрещування, вирощування насіння для отримання множини рослин-нащадків, обробки рослин-нащадків гліфосатом і відбирання рослини-нащадка, стійкої до гліфосату. Винахід також стосується способу отримання рослини маїсу, стійкої до застосування гербіциду гліфосату самозапиленням рослини трансгенної події MON 87427 маїсу, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10, в результаті чого виходить насіння, збиранням насіння, отриманого після самозапилення, вирощуванням насіння для отримання множини рослин-нащадків, обробкою рослин-нащадків гліфосатом і відбиранням рослини-нащадка, стійкої до гліфосату. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу за допомогою висаджування насіння трансгенної події MON 87427 маїсу на місцевість, вирощування рослини маїсу з насіння, обробки рослини ефективною дозою гербіциду гліфосату до утворення пилка, для того, щоб зробити чоловічі суцвіття стерильними, не пошкоджуючи рослину, запилення рослини пилком з другої батьківської рослини і збирання насіння від рослини, причому насіння є гібридним насінням маїсу, отриманим схрещуванням рослин трансгенної події MON 87427 маїсу з другою батьківською рослиною. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу, причому ефективна доза гербіциду гліфосату складає від приблизно 0,1 фунта до приблизно 4 фунтів на акр. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу, що додатково включає в себе висаджування насіння другої батьківської рослини на місцевість і вирощування рослини маїсу з другої батьківської рослини. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу, причому друга батьківська рослина є стійкою до гліфосату. Винахід також стосується способу прогнозування часу розвитку волоті маїсу за допомогою вибирання діапазону на Відносній шкалі розвитку, причому діапазон вказує на дозрівання до бажаної стадії розвитку волоті. Винахід також стосується способу прогнозування часу розвитку волоті маїсу, причому бажаною стадією розвитку волоті є стадія розвитку, оптимальна для репродуктивного схрещування, стерилізації волоті, видалення волоті і/або проведення модулюючої розвиток обробки на рослині маїсу. Винахід також стосується способу прогнозування часу розвитку волоті маїсу, в якому певною стадією розвитку квіток, Відносної шкали розвитку, що використовується для створення, є виділення пилка приблизно 50 процентами популяції рослин маїсу, і в якій діапазон складає від приблизно 0,62 і приблизно до 0,75 на Відносній шкалі розвитку. Винахід також стосується способу прогнозування часу розвитку волоті маїсу, що додатково включає в себе проведення модулюючої розвиток обробки на рослині маїсу на бажаній стадії розвитку волоті. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу шляхом висаджування насіння маїсу для першої батьківської рослини на місцевість, вирощування першої батьківської рослини з насіння маїсу, визначення часу розвитку волоті для першої батьківської рослини шляхом вибирання діапазону, який вказує дозрівання до бажаної стадії розвитку волоті на Відносній шкалі розвитку, використання визначення часу розвитку волоті для своєчасного проведення модулюючої розвиток обробки першої батьківської рослини, таким чином попереджаючи самозапилення першої батьківської рослини, проведення модулюючої розвиток обробки першої батьківської рослини, запліднення першої батьківської рослини пилком другої батьківської рослини і збирання насіння першої батьківської рослини, причому насіння є гібридним насінням маїсу, отриманим схрещуванням першої батьківської рослини з другою батьківською рослиною. Винахід також стосується гібридного насіння маїсу, отриманого з використанням даного способу. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу, причому модулюючою розвиток обробкою є обробка гліфосатом, а перша батьківська рослина має тканино-вибіркову стійкість до гліфосату. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу, причому першою батьківською рослиною є рослина трансгенної події MON 87427 маїсу. Винахід також стосується способу отримання гібридного насіння маїсу, причому друга батьківська рослина є стійкою до гліфосату. Нижченаведені і інші аспекти винаходу стануть більш очевидні з наведеного далі докладного опису. Короткий опис креслень На фіг. 1 проілюстрована організація трансгенної події MON 87427 маїсу. На фігурі [A1], [A2] і [A3] відповідають відносній позиції відповідно SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 і SEQ ID NO: 5, які охоплюють геномну ДНК маїсу, фланкуючу 5'кінець трансгенної вставки, і 5'-ділянку ДНК трансгенної вставки; [B1], [B2] і [B3] відповідають відносній позиції відповідно SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 і SEQ ID NO: 6, які охоплюють геномну ДНК маїсу, фланкуючу 3'-кінець 3 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансгенної вставки і 3'-ділянку ДНК трансгенної вставки; [С] відповідає відносній позиції SEQ ID NO: 7, яка включає геномну ДНК маїсу, фланкуючу 5'-кінець трансгенної вставки і ділянку 5'кінця трансгенної вставки; [D] відповідає відносній позиції SEQ ID NO: 8, яка включає геномну ДНК маїсу, фланкуючу 3'-кінець трансгенної вставки і ділянку 3'-кінця трансгенної вставки; [Е] відповідає відносній позиції SEQ ID NO: 9 і різним елементам в трансгенній вставці; а [F] являє собою безперервну послідовність MON 87427, що приведена у вигляді SEQ ID NO: 10 і включає SEQ ID NO: 1-9. На фігурі 2 показана врожайність гібридів MON 87427 при схрещуванні з подією маїсу NK603 і двократній за сезон обробці гліфосатом за допомогою розпилення в кількості 2,25 фунтів (1,02 2 кг) на акр (4047 м ) на кожне розпилення. На фігурі 3 проілюстровані стадії розвитку волоті, що використовуються в створенні Відносної шкали розвитку. Приблизний розмір показаний між квадратними дужками. На фігурі Vg являє собою меристему на вегетативній стадії; Т0 являє собою перехід від вегетативної до репродуктивної стадії; Т1 являє собою видиму репродуктивну точку росту (0,9 мм); Т2 являє собою видимі бічні примордії (1,8 мм); Т3 являє собою видимі примордії колосків (4,1 мм); Т4 являє собою подовження центральної осі і бічної осі (12,9 мм); Т5 являє собою початок диференціювання пильовиків (41,0 мм); Т6 являє собою початок диференціювання пилка (175 мм); і Т7 являє собою розкриття пильовиків і виділення пилка (285,0 мм). На фігурі 4 проілюстрований розкид розміру волотей для трьох генотипів маїсу на двох стадіях розвитку (V8 і V10). На фігурі 5 проілюстрована кореляція між вимогами GDU для стадії Т5 і цими вимогами до Р50 % і більш визначено показана лінія регресії, отримана з використанням кореляції між вимогами GDU до Т5 і до Р50 %. Кожна точка представляє інбредну лінію, усереднену по місцеположенню. На фігурі 6 проілюстрований приклад того, як Відносна шкала розвитку виявляє оптимальне вікно ефективності хімічного агента для отримання стерильних волотей маїсу, що вимірюється ризиком викидання пильовика (АЕризиком (%)), яке знаходиться між 0,62 і 0,75 на Відносній шкалі розвитку, де виконуються 62-75 % загальних вимог GDU для досягнення Р50, і в якій АЕризик мінімізований між інбредними лініями і групами стиглості. Кожна точка являє собою середні значення для 1 ділянки або двох рядів загалом з 32 рослин. N=620. На фігурі 7 проілюстровані Т-стадії як функція від GDU (А) і Відносної шкали розвитку (В). Кожна лінія регресії представляє різну інбредну лінію. На фігурі 8 проілюстрований процент ризику викидання пильовиків (вісь у), виміряний на різних стадіях колосіння маточкових стовпчиків (вісь х) для блоків MON 87427 і CMS. На фігурі 9 проілюстрована генетична чистота і чистота ознаки гібридного насіння, отриманого на MON 87427 з використанням системи гібридизації Roundup® (RHS) і за допомогою CMS-системи, з 95 %-им рівнем достовірності. Чорна лінія на графіку представляє бажані стандарти якості для генетичної чистоти і чистоти ознаки насіння, відповідно. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO: 1 є 20-нуклеотидною послідовністю, що представляє 5'-область з'єднання геномної ДНК маїсу і вбудованої трансгенної експресійної касети. SEQ ID NO: 2 є 20-нуклеотидною послідовністю, що представляє 3'-область з'єднання геномної ДНК маїсу і вбудованої трансгенної експресійної касети. SEQ ID NO: 3 є 60-нуклеотидною послідовністю, що представляє 5'-область з'єднання геномної ДНК маїсу і вбудованої трансгенної експресійної касети. SEQ ID NO: 4 є 60-нуклеотидною послідовністю, що представляє 3'-область з'єднання геномної ДНК маїсу і вбудованої трансгенної експресійної касети. SEQ ID NO: 5 є 100-нуклеотидною послідовністю, що представляє 5'-область з'єднання геномної ДНК маїсу і вбудованої трансгенної експресійної касети. SEQ ID NO: 6 є 100-нуклеотидною послідовністю, що представляє 3'-область з'єднання геномної ДНК маїсу і вбудованої трансгенної експресійної касети. SEQ ID NO: 7 є 5'-послідовністю, фланкуючою вбудовану ДНК MON 87427 до області і включаючи область трансгенної ДНК-вставки. SEQ ID NO: 8 є 3'-послідовністю, фланкуючою вбудовану ДНК в MON 87427 до області і включаючи область трансгенної ДНК-вставки. SEQ ID NO: 9 є послідовністю, що повністю вбудована в геномну ДНК маїсу і містить експресійну ДНК-касету. SEQ ID NO: 10 є нуклеотидною послідовністю, що представляє контіг 5'послідовності, фланкуючої вбудовану ДНК MON 87427 (SEQ ID NO: 7), послідовності, що повністю вбудована в геномну ДНК маїсу і містить експресійну касету (SEQ ID NO: 9), і 3'-послідовності, фланкуючої 4 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вбудовану ДНК MON 87427 (SEQ ID NO: 8), і включає SEQ ID NO: 1-6. SEQ ID NO: 11 є праймером 1 (SQ20052) специфічного до трансгену методу аналізу події, що використовується для ідентифікації MON 87427. ПЛР-амплікон, що отримується в результаті методу аналізу TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) з використанням комбінації праймерів SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12, є позитивним результатом на присутність події MON 87427. SEQ ID NO: 12 є праймером 1 (SQ20053) специфічного до трансгену методу аналізу події, що використовується для ідентифікації MON 87427. SEQ ID NO: 13 є 6FAM-пробій (PB10016) специфічного до трансгену методу аналізу події, що використовується для ідентифікації MON 87427. Ця проба являє собою 6FAM™-мічений синтетичний олігонуклеотид. Вивільнення флуоресцентного сигналу в реакції ампліфікації з використанням праймерів SEQ ID NO: 11-12 в комбінації з 6FAM™-міченою пробою є діагностичним критерієм події MON 87427 в методі аналізу TAQMAN®. SEQ ID NO: 14 є внутрішнім контрольним праймером 1 (SQ1241) специфічного до трансгену методу аналізу події. SEQ ID NO: 15 є внутрішнім контрольним праймером 1 (SQ1242) специфічного до трансгену методу аналізу події. SEQ ID NO: 16 є внутрішньою контрольною VIC-пробою (PB0084) специфічного до трансгену методу аналізу події. SEQ ID NO: 17 є праймером 1 (SQ12763) специфічного до події методу аналізу події, що використовується для ідентифікації MON 87427. ПЛР-амплікон, що отримується в результаті методу аналізу TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) з використанням комбінації праймерів SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18, є позитивним результатом на присутність події MON 87427. SEQ ID NO: 18 є праймером 1 (SQ12886) специфічного до події методу аналізу події, що використовується для ідентифікації MON 87427. SEQ ID NO: 19 є 6FAM-пробій (PB4352) специфічного до події методу аналізу події, що використовується для ідентифікації MON 87427. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Наступні визначення і способи приведені для кращого опису винаходу і як керівництво по застосуванню винаходу на практиці для середніх фахівців в даній галузі. Якщо не вказано інше, то терміни потрібно розуміти відповідно до їх звичайного застосування середніми фахівцями у відповідній галузі. Використовуваний в даному описі термін "маїс" означає "кукурудзу" або Zea mays і включає всі сорти рослин, які можуть бути схрещені з маїсом, включаючи дикі види маїсу, а також рослини, що належать до роду Zea, які дозволяють міжвидове схрещування. "Гліфосат" стосується N-фосфонометилгліцину, який являє собою гербіцид, що є інгібітором енолпірувілшикімат-3-фосфат синтази (EPSPS). Гліфосат порушує синтез ароматичних амінокислот, інгібуючи EPSPS. Гліфосат доступний в продажу як гербіцид Roundup® (Monsanto Company, St. Louis, Mo.). Винахід стосується трансгенної події MON 87427 маїсу (що також називається в цьому документі MON 87427). Використовуваний в даному документі термін "подія" стосується продукту, створеного в результаті вбудовування трансгенної молекули нуклеїнової кислоти в геном рослини, тобто в результаті трансформації рослини для отримання трансгенної рослини. Тому, "подію" отримують в результаті дій людини: (i) трансформації рослинної клітини в лабораторії молекулою нуклеїнової кислоти, яка включає представляючий інтерес трансген, тобто вбудовування в геном рослинної клітини конструкції або молекули нуклеїнової кислоти, (ii) регенерації популяції трансгенних рослин, що виходить в результаті вбудовування молекули нуклеїнової кислоти в геном рослини, і (iii) відбирання конкретної рослини, яка відрізняється вбудовуванням молекули нуклеїнової кислоти в певне місцеположення в геномі рослини. Таким чином, подію можна однозначно і визначено описати послідовністю нуклеїнової кислоти, що представляє щонайменше частину безперервної молекули ДНК, яка виходить в події в результаті вбудовування молекули нуклеїнової кислоти в конкретне місцеположення геному рослини, і яка включає ділянку геномної ДНК самої рослини, що фланкує (прилягає) і фізично з'єднаний з вбудованою молекулою ДНК, і вбудовану молекулу нуклеїнової кислоти. Подія є рекомбінантною, отриманою в результаті дії людини і не знайдена в нетрансгенних рослинах. Термін "подія", тому, стосується вихідної трансформованої рослини ("трансформанту"), який включає молекулу нуклеїнової кислоти, вбудовану в конкретне місцеположення в геномі рослини. Термін "подія" також стосується всього потомства від трансформанта, яке включає молекулу нуклеїнової кислоти, вбудовану в конкретне положення в геномі рослини. Таке 5 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потомство є відповідно трансгенним і містить подію. Потомство можна отримати будь-якими засобами, включаючи самозапилення, схрещування з іншою рослиною, яка містить такий же або інший трансген, і/або схрещування з нетрансгенною рослиною, наприклад, рослиною іншого сорту. Навіть після багатьох поколінь в будь-якій рослині, що називається потомством рослини MON 87427, будуть присутні вбудована ДНК і фланкуюча ДНК з вихідної трансформованої рослини, і їх буде легко ідентифікувати. Термін "подія" також стосується безперервної молекули ДНК, створеної у вихідному трансформанті (що містить вбудовану ДНК і фланкуючу геномну ДНК маїсу, що безпосередньо прилягає до країв вбудованої ДНК) або до будь-якої молекули ДНК, що містить цю послідовність нуклеїнової кислоти. Безперервна молекула ДНК була створена в результаті вбудовування трансгенної молекули нуклеїнової кислоти в геном рослини, тобто в результаті дії трансформації, і є специфічною і унікальною для конкретної події. Положення вбудованої ДНК в MON 87427 відносно оточуючої геномної ДНК рослини маїсу, тому, є специфічним і унікальним для MON 87427. Ця молекула ДНК також є невід'ємною частиною хромосоми маїсу MON 87427, і як така є стаціонарною в рослині і може успадковуватися потомством. Рослини трансгенної події MON 87427 маїсу виявляють прийнятну з комерційної точки зору тканино-вибіркову стійкість до гліфосату. У MON 87427 вегетативні частини маїсу і жіночі репродуктивні частини маїсу є стійкими до гліфосату, але ключові чоловічі репродуктивні тканини маїсу, критичні для розвитку пилку маїсу, не стійкі до гліфосату. Тому, оброблені гліфосатом рослини MON 87427 можна використовувати як жіночу батьківську рослину при отриманні гібридного насіння. Використовуваний в цьому документі термін "рекомбінантний" стосується неприродної ДНК і/або білка, і/або організму, які в нормі не виявлені в природі і були створені в результаті втручання людини, тобто руками людини. В результаті такого втручання людини може бути отримана молекула ДНК, і/або рослина або насіння. У контексті цього документа "рекомбінантна молекула ДНК" є молекулою ДНК, що містить комбінацію молекул ДНК, які звичайно не зустрічаються разом, і є результатом втручання людини, наприклад, молекулою ДНК, в якій міститься комбінація щонайменше двох молекул ДНК, гетерологічних одна одній, і/або молекулою ДНК, яка синтезована штучно і має нуклеотидну послідовність, відмінну від нуклеотидної послідовності, звичайно присутньої в природі, і/або молекулою ДНК, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, штучно вбудовану в геномну ДНК клітину-хазяїна і асоційовану фланкуючу ДНК геному клітини-хазяїна. Прикладом рекомбінантної молекули ДНК є молекула ДНК, що містить щонайменше одну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 1-10. В контексті цього документа "рекомбінантна рослина" є рослиною, яка в нормі не існує в природі, є результатом втручання людини, і містить трансген і/або гетерологічну молекулу ДНК, включену в його геном. В результаті такої геномної зміни, рекомбінантна рослина очевидно відрізняється від спорідненої рослини дикого типу. Прикладом рекомбінантної рослини є рослина трансгенної події 87427 маїсу. Використовуваний в даному документі термін "трансген" стосується молекули нуклеїнової кислоти, штучно вбудованої в геном організму в результаті втручання людини. Такий трансген може бути гетерологічним для клітини-хазяїна. Термін "трансгенний" стосується вмісту трансгена, наприклад, "трансгенна рослина" стосується рослини, що містить трансген, тобто, молекулу нуклеїнової кислоти, штучно вбудовану в геном організму в результаті втручання людини. Використовуваний в даному документі термін "гетерологічний" стосується першої молекули, звичайно не знайденої в природі в комбінації з другою молекулою. Наприклад, молекула може бути отримана з першого біологічного виду і вбудована в геном другого виду. Тому, молекула буде гетерологічною молекулою, тобто гетерологічною для організму і штучно вбудованою в геном організму. Використовуваний в даному документі термін "химерний" стосується однієї молекули ДНК, отриманої злиттям першої молекули ДНК з другою молекулою ДНК, де ні перша, ні друга молекули ДНК не знаходяться звичайно в такій конфігурації, тобто, злитими одна з одною. Химерна молекула ДНК, тому, є новою молекулою ДНК, іншим чином не присутньою в природі. Прикладом химерної молекули ДНК є молекула ДНК, що містить щонайменше одну послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 1-10. Винахід стосується молекул ДНК і їх відповідних нуклеотидних послідовностей. Використовуваний в даному документі термін "ДНК", "молекула ДНК", "молекула нуклеїнової кислоти" стосується дволанцюжкової молекули ДНК геномного або синтетичного походження, тобто полімеру з дезоксинуклеотидних основ або нуклеотидної молекулі, що зчитується з 5′ (верхнього) кінця до 3′ (нижнього) кінця. Використовуваний в даному документі термін "послідовність ДНК" або "нуклеотидна послідовність" стосується нуклеотидної послідовності 6 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекули ДНК. Номенклатурою, що використовується в цьому документі є така, що вимагається розділом 37 Звід нормативних документів США, з 1.822 і вказана в таблицях в WIPO Standard ST.25 (1998), додаток 2, таблиці 1 і 3. Як прийнято і в цьому документі, нуклеотидні послідовності за винаходом, такі як приведені як SEQ ID NO: 1-10 і їх фрагменти, приведені відносно тільки одного ланцюга з двох комплементарних ланцюгів нуклеотидної послідовності, але мається на увазі, що комплементарні послідовності (тобто послідовності комплементарного ланцюга), що також називаються в даній галузі зворотними комплементарними послідовностями, входять в об'єм винаходу і, визначено передбачається, що вони входять в об'єм заявленого об'єкта винаходу. Тому, в контексті цього документа посилання на SEQ ID NO: 1-10 і їх фрагменти включають послідовність і стосуються послідовності комплементарного ланцюга і її фрагментів. Термін "фрагмент", що використовується в даному описі, стосується ділянки або неповної меншої частини цілого. Наприклад, фрагменти SEQ ID NO: 10 включали б послідовності, які складають щонайменше 10 нуклеотидів, щонайменше 20 нуклеотидів або щонайменше 50 нуклеотидів повної послідовності SEQ ID NO: 10. Нуклеотидна послідовність, яка відповідає повній нуклеотидної послідовності вбудованої трансгенної ДНК і досить великим сегментам геномної ДНК маїсу, фланкуючим обидва кінці вбудованої трансгенної ДНК, приведена в цьому документі як SEQ ID NO: 10. Частиною даної послідовності є вбудована трансгенна ДНК (що також називається в цьому документі як трансгенна вставка або вбудована ДНК), приведена як SEQ ID NO: 9. Нуклеотидна послідовність геномної ДНК маїсу, фізично з'єднана фосфодіефірним зв'язком і, тому, що фланкує 5′-кінець вбудованої трансгенної ДНК і містить 10 нт трансгенної вбудованої ДНК, викладена в SEQ ID NO: 7. Нуклеотидна послідовність геномної ДНК маїсу, фізично з'єднана фосфодіефірним зв'язком і, тому, фланкуюча 3′кінець вбудованої трансгенної ДНК і що містить 10 нт трансгенної вбудованої ДНК, викладена в SEQ ID NO: 8. MON 87427 додатково містить дві області, що називаються "з'єднаннями". "З'єднання" являє собою ділянку, в якій один кінець вбудованої трансгенної ДНК вбудований в геномну ДНК і з'єднаний з нею. З'єднання охоплює, тобто перекриває, ділянка вбудованої трансгенної ДНК і прилягаючої фланкуючої геномної ДНК, і як таке включає в себе точку з'єднання цих двох елементів у вигляді однієї безперервної молекули. Одне з'єднання знаходиться на 5'-кінці вбудованої трансгенної ДНК, а інше на 3'-кінці вбудованої трансгенної ДНК, які називають в цьому документі як 5’- і 3’-з'єднання, відповідно. "Послідовність з'єднання" або "область з'єднання" стосуються послідовності ДНК і/або відповідної молекули ДНК з'єднання. Фахівець в даній галузі може підібрати послідовності з'єднань в MON 87427, використовуючи SEQ ID NO: 10. Приклади послідовностей з'єднань в MON 87427 приведені як SEQ ID NO: 1-6. SEQ ID NO: 1 являє собою 20-нуклеотидну послідовність, що перекриває з'єднання між геномною ДНК маїсу і 5'-кінцем ДНК трансгенної вставки; SEQ ID NO: 3 являє собою 60-нуклеотидну послідовність, що перекриває з'єднання між геномною ДНК маїсу і 5'-кінцем ДНК трансгенної вставки; SEQ ID NO: 5 являє собою 100нуклеотидну послідовність, що перекриває з'єднання між геномною ДНК маїсу і 5'кінцем ДНК трансгенної вставки. SEQ ID NO: 2 являє собою 20-нуклеотидну послідовність, що перекриває з'єднання між геномною ДНК маїсу і 3'-кінцем ДНК трансгенної вставки; SEQ ID NO: 4 являє собою 60-нуклеотидну послідовність, що перекриває з'єднання між геномною ДНК маїсу і 3'-кінцем ДНК трансгенної вставки; SEQ ID NO: 6 являє собою 100нуклеотидну послідовність, що перекриває з'єднання між геномною ДНК маїсу і 3'-кінцем ДНК трансгенної вставки. На фігурі 1 проілюстроване фізичне розташування SEQ ID NO: 1-10 в напрямку від 5' до 3'. Будь-який сегмент ДНК, отриманий з трансгенного MON 87427, який включає SEQ ID NO: 1-6, входить в об'єм винаходу. Винахід, таким чином, стосується молекули ДНК, яка містить щонайменше одну з нуклеотидних послідовностей, вказаних в SEQ ID NO: 1-6. Послідовності з'єднань події MON 87427 присутні як частини геному рослини, насіння або клітини трансгенної події MON 87427 маїсу. Ідентифікація будь-якої однієї або декількох з SEQ ID NO: 1-6 в зразку, отриманому з рослини маїсу, насіння або частини рослини, визначає, що ДНК отримана з MON 87427 і є діагностичною ознакою присутності в зразку ДНК з MON 87427. Винахід стосується прикладів молекул ДНК, які можна використовувати або як праймери, або як проби для діагностики присутності ДНК, отриманої з рослини події MON 87427, в зразку. Такі праймери або проби специфічні відносно послідовності нуклеїнової кислоти-мішені і, як такі, їх можна використовувати для ідентифікації послідовностей нуклеїнової кислоти MON 87427 способами за винаходом, описаними в цьому документі. "Праймер" є молекулою нуклеїнової кислоти, яка підібрана для використання в способах відпалювання або гібридизації, які включають температурну ампліфікацію. Пару праймерів можна використовувати з матричною ДНК, такою як зразок геномної ДНК маїсу, в температурній 7 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ампліфікації, такій як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), для отримання амплікону, причому амплікон, отриманий в такій реакції, буде мати послідовність ДНК, відповідну послідовності матричної ДНК, розташованої між двома дільницями гібридизації праймерів на матриці. У контексті цього документа "амплікон" є ДНК, яка синтезована з використанням методик ампліфікації. Амплікони за винаходом мають послідовність, що містить одну або декілька з SEQ ID NO: 1-10 або їх фрагменти. Праймер звичайно підбирають для гібридизації з комплементарним ланцюгом ДНК-мішені з утворенням гібрида між праймером і ланцюгом ДНКмішені, і присутність праймера є точкою пізнавання полімеразою для початку подовження праймера (тобто полімеризації додаткових нуклеотидів в нуклеотидну молекулу, що подовжується) з використанням як матриця ланцюга ДНК-мішені. Передбачається, що пари праймерів, які використовуються у винаході, стосуються використання двох праймерів, що зв'язуються з протилежними ланцюгами дволанцюжкового нуклеотидного сегмента для ампліфікації лінійного нуклеотидного сегмента між позиціями, індивідуальних членів пари, що є мішенями зв'язування праймерів. Приклади послідовностей праймерів приведені як SEQ ID NO: 11-12, SEQ ID NO: 14-15 і SEQ ID NO: 17-18. Пара праймерів SEQ ID NO: 14-15 і пара праймерів SEQ ID NO: 17-18, кожна має першу молекулу ДНК і другу молекулу ДНК (яка відрізняється від першої молекули ДНК), причому обидві молекули мають достатню безперервну нуклеотидну ділянку для функціонування як праймери, які при спільному використанні в реакції ампліфікації ДНК з матрицею ДНК, отриманою з MON 87427, дають амплікон, який є діагностичним критерієм присутності в зразку ДНК з MON 87427. "Проба" являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, комплементарного ланцюга нуклеїнової кислоти-мішені, для використання в способах відпалювання або гібридизації. Проби за винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші матеріали проб, які специфічно зв'язують послідовність ДНК-мішені, і детекція такого зв'язування може бути корисна в діагностиці, виділенні, визначенні або підтвердженні присутності послідовності ДНК-мішені в конкретному зразку. Проба може бути з'єднана із звичайною детектованою влучною або репортерною молекулою, наприклад, радіоактивним ізотопом, лігандом, хемілюмінесцентним агентом або ферментом. Приклади послідовностей, які можна використовувати як проби для детекції MON 87427, є SEQ ID NO: 1-2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19. Способи підборання і використання праймерів і проб добре відомі в даній галузі і описані, наприклад, Joseph Sambrook, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) і Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Blackwell. Фахівець в даній галузі може легко підібрати молекули ДНК, що містять фрагменти SEQ ID NO: 1-10 і придатні як праймери і проби для детекції MON 87427, для використання як проб в гібридизаційних способах детекції, наприклад, в способі Саузерн-блота. Молекули ДНК і відповідні нуклеотидні послідовності, приведені в цьому документі, тому, придатні, серед іншого, для ідентифікації MON 87427, відбирання сортів або гібридів рослин, що включає в себе MON 87427, детекції присутності ДНК, отриманої з трансгенного MON 87427, в зразку і моніторингу зразків на присутність і/або відсутність MON 87427 або частин рослини, отриманих з MON 87427. Винахід стосується рослин маїсу, потомства, насіння, клітин рослини, частин рослини і продуктів споживання. Ці рослини, потомство, насіння, клітини рослини, частини рослини і продукти споживання містять детектовану кількість нуклеотиду за винаходом, тобто, такого як молекула нуклеїнової кислоти, що містить щонайменше одну з послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10. Рослини, потомство, насіння, клітини рослини і частини рослини за винаходом можуть також містити один або декілька додаткових трансгенів. Таким трансгеном може бути будь-яка нуклеотидна послідовність, що кодує білок, або молекула РНК, що додають бажаної ознаки, включаючи, але не обмежена цим, підвищеної стійкості до комах, підвищеної ефективності використання води, підвищеної врожайності, підвищеної стійкості до засухи, підвищеної якості насіння, підвищеної поживної якості і/або підвищеної стійкості до гербіцидів, причому бажану ознаку вимірюють відносно рослини маїсу, що не має такого додаткового трансгена. Винахід стосується рослин маїсу, потомства, насіння, клітин рослини і частин рослини, а також листя, отриманого від рослини трансгенної події MON 87427 маїсу. Репрезентативний зразок насіння MON 87427 депонований відповідно до Будапештського договору з метою відтворення винаходу. Сховищем для поміщення депозиту є Американська колекція типових культур (АТСС), що має адресу 10801 University Boulevard, Manassas, Va. USA, Zip Code 20110. У сховищі АТСС насінню події MON 87427 був привласнений номер доступу PTA-7899. Винахід стосується мікроорганізму, що містить молекулу ДНК, що має SEQ ID NO: 1-10, 8 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 присутні в його геномі. Прикладом такого мікроорганізму є клітина трансгенної рослини. Мікроорганізм, такий як рослинна клітина за винаходом, можна використовувати в багатьох промислових застосуваннях, включаючи без обмежень: (i) застосування як дослідницький засіб для наукового пошуку або промислових досліджень; (ii) застосування в культурі для отримання ендогенних або рекомбінантних вуглеводних, ліпідних, нуклеотидних або білкових продуктів або низькомолекулярних сполук, які можуть бути корисні для подальшого наукового дослідження або як промислові продукти; і (iii) застосування в сучасних методиках культивування тканин рослин для отримання трансгенних рослин або культур тканин рослин, які потім можна використовувати для сільськогосподарських досліджень або виробництва. При використанні мікроорганізмів, таких як клітини трансгенних рослин, застосовують сучасні мікробіологічні методики і втручання людини для отримання штучного унікального мікроорганізму. У цьому способі рекомбінантну ДНК вбудовують в геном рослинної клітини для створення трансгенної рослинної клітини, яка відрізняється від і є унікальною серед природних рослинних клітин. Цю трансгенну рослинну клітину потім можна культивувати приблизно також як і бактеріальні і дріжджові клітини з використанням сучасних мікробіологічних методик, і вона може існувати в недиференційованому, одноклітинному стані. Нова генетична композиція і фенотип рослинної клітини є технічним ефектом, створеним в результаті вбудовування гетерологічної ДНК в геном клітини. Іншим аспектом винаходу є спосіб використання мікроорганізму за винаходом. Способи використання мікроорганізму за винаходом, такого як трансгенні рослинні клітини, включають (i) способи отримання трансгенних клітин в результаті вбудовування рекомбінантної ДНК в геном клітини і потім використання цієї клітини для отримання додаткових клітин, що мають таку же гетерологічну ДНК; (ii) способи культивування клітин, які містять рекомбінантну ДНК, з використанням сучасних мікробіологічних методик; (iii) способи отримання і очищення ендогенних або рекомбінантних вуглеводних, ліпідних, нуклеотидних або білкових продуктів з культивованих клітин; і (iv) способи використання сучасних методик культивування тканин рослин з трансгенним рослинними клітинами для отримання трансгенних рослин або культур тканин трансгенних рослин. Рослини за винаходом можуть передавати ДНК події, включаючи трансгенну вставку, потомству. У контексті цього документа "потомство" включає будь-яку рослину, насіння, клітину рослини і/або регенеровану частину рослини, що містить ДНК події, отриману від рослинипопередника, і/або молекулу нуклеїнової кислоти, що має щонайменше одну з послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10. Рослини, потомство і насіння можуть бути гомозиготними або гетерозиготними по трансгену. Потомство можна вирощувати з насіння, продукованого рослиною MON 87427, і/або з насіння, продукованого рослиною, заплідненою пилком від рослини MON 87427. Рослини за винаходом можна отримати самозапиленням або перехресним запиленням, і/або їх можна використовувати в способах самозапилення або перехресного запилення. Тому, в одному варіанті здійснення винаходу рослину MON 87427 можна перехресно запилювати пилком від іншої рослини маїсу для отримання гібридного потомства. Способи схрещування, прийнятні для рослин маїсу MON 87427, відомі в даній галузі. Винахід стосується частини рослини, яка отримана з MON 87427. У контексті цього документа "частина рослини" стосується будь-якої частини рослини, в якій міститься матеріал, отриманий з рослини MON 87427. Частини рослини включають, але не обмежені цим, пилок, насінний зачаток, стручок, квітку, тканину кореня або стебла, волокна і листя. Частини рослини можуть бути живими, неживими, регенерованими і/або не регенерованими. Винахід стосується продукту споживання, який отримують з трансгенної події MON 87427 маїсу і включає в себе молекулу нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1-10. В контексті цього документа "продукт споживання" стосується будь-якої композиції або продукту, в якому міститься матеріал, отриманий з рослини, насіння, рослинної клітини або частини рослини MON 87427. Продукти споживання можуть бути живими або неживими. Неживі продукти споживання включають, але не обмежені цим неживе насіння і зерна; перероблене насіння, частини насіння і частини рослини; дегідратовану тканину рослини, заморожену тканину рослини і перероблену тканину рослини; насіння і частини рослини, перероблені для харчування тварин для споживання наземними і/або водними тваринами, олію, борошно крупного помелу, борошно, пластівці, висівки, клітковину, молоко, сир, папір, вершки, вино і будь-який інший продукт харчування для споживання людиною; і біомасу і паливні продукти. Живі продукти споживання включають, але не обмежені цим, насіння і клітини рослини. Трансгенну подію MON 87427 маїсу, тому, можна використовувати для виготовлення будь-якого продукту споживання, що звичайно отримується з маїсу. Продукт споживання, який отриманий з MON 87427, може містити детектовану кількість специфічної і унікальної ДНК, відповідної MON 87427, і, більш конкретно, може містити 9 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 детектовану кількість молекули нуклеїнової кислоти, що має щонайменше одну з послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10. Детекція однієї або декількох з цих послідовностей в зразку продукту споживання, отриманого з, виготовленого з, що складається з або що містить рослину кукурудзи, насіння кукурудзи, клітину рослини кукурудзи або частину рослини кукурудзи, є такою, що включає і визначає присутність біологічного матеріалу, отриманого з події MON 87427 кукурудзи, в такому продукті споживання, і детекцію такої молекули нуклеїнової кислоти можна використовувати для визначення вмісту і/або джерела продукту споживання. Можна використовувати будь-який стандартний спосіб детекції молекул нуклеїнової кислоти, включаючи способи детекції, розкриті в цьому документі. Рослини, потомство, насіння, рослинні клітини, частини рослини і продукти споживання за винаходом, тому, можна, використовувати, крім іншого, для вирощування рослин з метою отримання насіння і/або частин рослини MON 87427 для сільськогосподарських потреб, отримання потомства MON 87427 для схрещування рослин і дослідницьких цілей, використання з мікробіологічними методиками для промислового і дослідницького застосування, і продажу споживачам. Винахід стосується способів контролю бур'янів з використанням гербіциду гліфосату і MON 87427. Приведений спосіб контролю бур'янів в полі, який складається з висаджування сортових або гібридних рослин MON 87427 в поле і застосування гербицидно-ефективної дози гліфосату на полі для контролю бур'янів на полі без ураження рослин MON 87427. Таке застосування гербіциду гліфосату можна здійснити до сходу насіння, тобто в будь-який час після висівання насіння MON 87427 і перед сходом рослин MON 87427, або після сходу насіння, тобто в будьякий час після сходу рослин MON 87427. Гербіцидно ефективна доза гліфосату при застосуванні на полі для контролю бур'янів повинна знаходитися в діапазоні від приблизно 0,1 фунта до такої кількості, як приблизно 4 фунти на акр протягом вегетаційного періоду. Протягом вегетаційного періоду гліфосату можна застосовувати багато разів, наприклад, два рази (наприклад, до саджання і після сходів або до сходів і після сходів) або три рази (наприклад, до саджання, до сходів і після сходів). Винахід стосується способів отримання толерантної до гербіциду рослини трансгенної події MON 87427 маїсу. Потомство, отримане за допомогою даних способів, може бути сортовими або гібридними рослинами; воно може бути вирощене з насіння, продукованого рослиною MON 87427 і/або з насіння, продукованого рослиною, заплідненою пилком від рослини MON 87427; і воно може бути гомозиготим або гетерозиготним по трансгену. Потомство можна згодом замозапилювати або перехресно запилювати. Рослину маїсу, яка стійка до застосування гербіциду гліфосату, можна отримати в результаті статевого схрещування рослини MON 87427, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить щонайменше одну з послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10, з іншою рослиною маїсу, і, в результаті отримання насіння, яке потім збирає і вирощує з них рослини-потомство. Це потомство можна потім обробити гербіцидом гліфосат, і потомство, стійке до гербіциду гліфосат можна відібрати. У альтернативному варіанті, ці рослинипотомство можна проаналізувати, використовуючи діагностичні способи для відбирання рослин-потомства, які містять ДНК MON 87427. У застосуванні на практиці способів за винаходом стадію статевого схрещування однієї рослини з іншою рослиною, тобто перехресного запилення, можна виконати або забезпечити в результаті втручання людини, наприклад: ручного збирання пилка однієї рослини і контактування цього пилка зі стовпчиком або рильцем другої рослини і потім необов'язково попередження додаткового запліднення заплідненої рослини; ручного і/або автоматичного видалення (наприклад, шляхом видалення волотей), руйнування (наприклад, шляхом використання хімічних агентів) або закривання тичинок або пильовиків рослини, так щоб попередити природне самозапилення, і для запліднення повинно статися перехресне запилення; розміщення людиною запилюючих комах в позиції для "прямого запилення" (наприклад, шляхом поміщення бджолиних роїв в плодові розплідники або поля або шляхом поміщення рослин під сітку із запилюючими комахами); відкривання або видалення людиною частин квітки для поміщення або контакту чужорідного пилка на стовпчик або рильце (наприклад, в маїсі, який в природі має квітки, що перешкоджають або попереджають перехресне запилення, що робить їх природно облігатними самозапилюваними рослинами за відсутності втручання людини); вибірково поміщення рослин в певну область (наприклад, навмисного саджання рослин на відстані, що дозволяє запилення); і/або застосування хімічних сполук для прискорення цвітіння або посилення сприйнятливості (рильця до пилка). При застосуванні на практиці способів за винаходом стадію статевого запліднення рослини маїсу в результаті самозапилення можна виконати або забезпечити шляхом втручання людини, 10 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад: ручного збирання пилка однієї рослини і контактування цього пилка зі стовпчиком або рильцем тієї ж рослини і потім необов'язково попередження додаткового запліднення заплідненої рослини; ручного і/або автоматичного видалення (наприклад, шляхом видалення волотей), руйнування (наприклад, шляхом використання хімічних агентів) або закривання тичинок або пильовиків рослини, так щоб попередити природне самозапилення, і для запліднення повинно статися ручне самозапилення; розміщення людиною запилюючих комах в позиції для "прямого запилення" (наприклад, шляхом поміщення індивідуальної рослини під сітку із запилюючими комахами); проведення маніпуляцій людиною з репродуктивними частинами рослини для забезпечення можливості або посилення самозапилення; вибіркового поміщення рослин в певну область (наприклад, навмисного саджання інших рослин на відстані, що перевищує відстань, яка дозволяє запилення); і/або застосування хімічних сполук для прискорення цвітіння або посилення сприйнятливості (рильця до пилка). Винахід стосується рослин і способів, корисних в продукції гібридного насіння маїсу. Рослина маїсу має роздільні чоловічі і жіночі квітучі частини. Віночок є чоловічою структурою, а початок є жіночою квітковою структурою рослини. Стадія цвітіння у маїсу включає виділення пилка і колосіння маточкових стовпчиків. Пилок маїсу може запліднювати ту ж рослину (самозапилення) або іншу рослину (перехресне запилення). Якщо чоловічі структури рослини не видалені до виділення пилка, то рослина маїсу самозапилюється в деякій мірі. Для продукції гібридного насіння жіночі структури першої рослини маїсу перехресно запилюють пилком від другої рослини маїсу. Тому, для ефективного отримання гібридного насіння необхідно, щоб пилок самої рослини не міг самозапліднювати рослину. Способи збільшення продукції гібридного насіння маїсу, приведені в цьому документі, включають в себе вирощування на місцевості насіння або рослини, які містять MON 87427 і одну або декілька інших рослин маїсу. Рослини події MON 87427 потім обробляють гліфосатом до утворення пилка, таким чином роблячи чоловічі частини рослини події MON 87427 стерильними і нездатними до самозапилення. Рослини події MON 87427 потім запилюють пилком від іншої рослини маїсу, використовуючи будь-який зі способів, описаних в цьому документі. Інші рослини маїсу можуть бути стійкими або нестійкими до гліфосату. Потім збирають насіння маїсу від рослин події MON 87427, причому насіння, зібране від оброблених рослин MON 87427 має більший вихід гібридного насіння маїсу (тобто вищий процент гібридного насіння, що збирається, або більшу чистоту гібридного насіння) відносно насіння маїсу, зібраного від необроблених рослин події MON 87427 або від інших рослин маїсу в таких же умовах. Насіння маїсу, зібране від необроблених рослин події MON 87427 при таких же умовах, буде мати вищий процент негібридного насіння (тобто, інбредного насіння, отриманого в результаті самозапилення) і, тому, менший вихід гібридного насіння маїсу. Рослини і способи за винаходом можна також використовувати для схрещування маїсу з використанням способів, відомих в даній галузі, включаючи використання способів, описаних в патенті США № 7314970, який, таким чином, включений в цей документ шляхом посилання, і патентної публікації США № 20090165166, яка, таким чином, включена в цей документ шляхом посилання. Рослини, потомство і насіння, охоплені цими способами і отримані з використанням цих способів, будуть відрізнятися від інших рослин маїсу. Наприклад, рослини MON 87427, потомство і насіння за винаходом є трансгенними і рекомбінантними, і, як такі, створені в результаті втручання людини і містять детектовану кількість молекули нуклеїнової кислоти, що має щонайменше одну з послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10. Способи за винаходом, тому, корисні серед іншого для контролю бур'янів на полі при вирощуванні рослин для отримання насіння і/або частин рослин MON 87427 для сільськогосподарських або дослідницьких цілей, відбирання потомства MON 87427 для схрещування рослин або дослідницьких цілей і отримання рослинпотомства і насіння MON 87427. Рослини, потомство, насіння, клітини рослини, частини рослини і продукти споживання за винаходом можна оцінити по композиції ДНК, експресії генів і/або експресіям білків. Таку оцінку можна здійснити, використовуючи стандартні способи, такі як ПЛР, Нозерн-блоттинг, Саузернаналіз, Вестерн-блоттинг, імунопреципітація і ELISA, або використовуючи способи детекції і/або набори для детекції, приведені в цьому документі. Винахід стосується способів детекції в зразку присутності матеріалу, специфічного для MON 87427. Присутність молекули нуклеїнової кислоти за винаходом можна детектувати, використовуючи проби і праймери за винаходом з будь-яким способом детекції нуклеїнових кислот, що використовується в даній галузі, таким як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) або гібридизація ДНК. Один спосіб забезпечує приведення зразка ДНК в контакт з парою праймерів, 11 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які здатні продукувати амплікон на ДНК події MON, проведення реакції ампліфікації і, таким чином, отримання ДНК-амплікону, що містить щонайменше одну з нуклеотидних послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10, і потім детекцію присутності або відсутності молекул амплікону і, необов'язково, підтвердження присутності в послідовності амплікону послідовності, що містить щонайменше одну з послідовностей, приведених як SEQ ID NO: 1-10. Присутність такого амплікону є визначальною і/або діагностичною відносно присутності ДНК, специфічною для MON 87427, і, таким чином, присутність біологічного матеріалу MON 87427 в зразку. Інший спосіб стосується приведення зразка ДНК в контакт із зондом ДНК, поміщення проби і зразка ДНК в жорсткі умови гібридизації і, потім, детекції гібридизації між пробою ДНК зразка-мішені. Детекція гібридизації є діагностичною ознакою присутності ДНК, специфічної для MON 87427, в зразку ДНК. Ампліфікацію нуклеїнових кислот, гібридизацію нуклеїнових кислот і секвенування ДНК можна виконувати будь-яким зі способів, відомих в даній галузі. Одним прикладом методик, які можна використовувати в практичному здійсненні даного винаходу, є TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.). Послідовність гетерологічної вставки ДНК, послідовності з'єднань або фланкуючі послідовності з MON 87427 (з репрезентативними зразками насіння, депонованим як ATCC PTA-7899) можна підтвердити (і виправити при необхідності) шляхом ампліфікації таких послідовностей на матриці з події з використанням праймерів, отриманих з послідовностей, приведених в цьому документі, з подальшим стандартним ДНК-секвенуванням амплікону або клонованої ДНК. Винахід стосується наборів для детекції ДНК. Варіанти таких наборів також можна розробити з використанням композицій і способів, розкритих в цьому документі, і способів, добре відомих в галузі детекції ДНК. Набори для детекції ДНК можна використовувати для ідентифікації ДНК MON 87427 DNA в зразку і можна застосовувати для способів схрещування рослин маїсу, що містять ДНК MON 87427. Набори можуть містити ДНК-праймери або проби, які аналогічні або комплементарні SEQ ID NO: 1-10 або їх фрагментам. Набори і способи детекції за винаходом, тому, можна використовувати серед іншого для ідентифікації MON 87427, відбирання сортів або гібридів рослин, що містить MON 87427, детекції присутності ДНК, отриманої з трансгенного MON 87427, в зразку і моніторингу образів на присутність і/або відсутність MON 87427 або частин рослини, отриманих з MON 87427. Винахід стосується Відносної шкали розвитку, придатної для моніторингу і/або визначення репродуктивного розвитку у маїсу. Ця нова Відносна шкала розвитку вирішує проблему відмінностей в розвитку і репродуктивному дозріванні серед різних сортів і інбредних ліній маїсу, забезпечуючи часову шкалу, яка виражає стадії розвитку волоті відносно цвітіння. Відносна шкала розвитку скорочує відмінності, що спостерігаються між генотипами в розвитку і росту волоті. Розвиток волоті в різні стадії дозрівання проілюстровані на фігурі 3. Розвиток маїсу часто визначають по шкалі стадій, основаній на вегетаційних подіях, звичайно відомих як V-стадії. Ці стадії визначають відповідно до самого верхнього листа, у якого видно листовий вузол. VE відповідає проростанню, V1 відповідає першому листу, V2 відповідає другому листу, V3 відповідає третьому листу, V(n) відповідає n-му листу. VT відбувається, коли видно останнє розгалуження волоті, але до колосіння маточкових стовпчиків. При оцінці стадій для поля маїсу, кожну конкретну V-стадію вказують, тільки коли 50 процентів або більше рослин на полі мають цю або вищу стадію. Однак застосування цієї вегетаційної шкали для визначення репродуктивної зрілості може ускладнюватися тим фактом, що вегетативний розвиток не обов'язково корелює з репродуктивним розвитком для всіх генотипів. Крім того, не у всіх інбредних ліній зростає однакове число листя, агрономи не завжди послідовні в своїй оцінці, і перше листя, що розвивається, починає в'янути досить рано в сезон, так що якщо листя не помічено правильно протягом ранніх стадій, то пізніше стає дуже важко правильно ідентифікувати V-стадії. Іншим поширеним засобом прогнозу і оцінки стадій росту і розвитку маїсу є градусо-одиниці росту (GDU). Основоположним фактором росту і розвитку маїсу є тепло. Тепло звичайно вимірюють в одній точці часу і виражають у вигляді температури, але його також можна вимірювати протягом відрізка часу і виражати в теплових одиницях. Ці теплові одиниці звичайно називають GDU. GDU можна визначити, як різницю між середньою денною температурою і вибраною базовою температурою з накладеними деякими обмеженнями. GDU обчислюють, використовуючи наступне рівняння: Градусо-одиниці росту={(H+L)/2}−B, в якому Н є денною максимальною температурою (але не вище ніж 86 °F, L є денним мінімумом (але не нижче ніж 50 °F, а В є базовою температурою 50 °F (10 °C). Оскільки росту маїсу сильно сповільнюється при температурах вищих ніж 86 °F або нижчих ніж 50 °F, то на максимальну і мінімальну денні 12 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 температури, що використовуються в формулі, накладені обмеження. Нижній поріг денної температури також попереджає отримання негативних значень. Тому, якщо денний максимум перевищує 86 °F, то денну максимальну температуру, що використовується в GDU-формулі, вказують як 86 °F. В свою чергу якщо денний мінімум падає нижче ніж 50 °F, то денну мінімальну температуру, що використовується в GDU-формулі, вказують як 50 °F. Якщо денна максимальна температура не перевищує 50 °F, то для цього дня не реєструють GDU. Максимальна величина GDU, яку рослина маїсу може набрати в день, становить 36, а мінімальна дорівнює 0. Оцінку дозрівання рослин маїсу визначають по сумі денних величин GDU за певний проміжок часу. Часовим періодом, який використовують більшість виробників насіння маїсу, є час від точки саджання до фізіологічної стиглості або точки, в якій заповнення зерен практично завершене. В більшості штатів США накопичені дані GDU зберігаються для більшості географічних районів і доступні від Crop Reporting Service (Служби інформації про урожаї USDA) або від State Extension Services (Служб по поширенню досвіду в штатах). Крім того, інструмент отримання інформації про GDU в конкретному місцеположенні також описаний в патенті США № 6967656, який, таким чином, повністю включений в цей документ шляхом посилання. Як і у випадку V-стадій, зміни GDU можуть значно варіювати відносно стадії розвитку волоті серед генотипів і не можуть бути надійним способом прогнозу) розвитку волоті. У контексті цього документа "Відносна шкала розвитку" визначена як шкала, створена діленням GDU на дану стадію розвитку волоті на GDU, необхідну для досягнення певної стадії виділення пилка. Потім, конструюють лінію регресії з цією інформацією для кожного генотипа або інбредного сорту. Відносну шкалу розвитку можна сконструювати, використовуючи способи, описані в цьому документі, і вона основана на кореляції між вимогами GDU, необхідними для досягнення деякої стадії розвитку квіток кукурудзи відносно даної стадії розвитку волоті. Як таку, Відносну шкалу розвитку можна використовувати для прогнозу розвитку волоті у маїсу для різних генотипів і інбредних сортів, і її можна використовувати як альтернативу використанню Vстадій або GDU в схрещуванні рослин і агротехнічних способах. У контексті даного винаходу "стадія розвитку квіток" визначена згідно зі ступенем, до якого популяція рослин виділяє пилок, що називається Р-стадією. Стадію розвитку квіток виражають як Рх, де Р означає "пилок", а "х" вказує на процент рослин в популяції, які виділяють пилок. Відносна шкала розвитку за винаходом основана на регресії, отриманій діленням GDU на даній стадії розвитку волоті на число GDU, необхідне для досягнення конкретної стадії виділення пилка. Це співвідношення виражене наступною формулою: Відносна шкала розвитку = (GDU для Tn/GDU для Px), де "GDU для Tn" є кількістю GDU (градусо-одиниць росту), необхідною для досягнення деякої стадії розвитку волоті, де n може варіювати від 0 до 7, і де "GDU для Px" є кількістю GDU, необхідною для досягнення деякої стадії розвитку квітки або Р-стадії, в якій х може варіювати від 0 до 100 (прикладом є р50, що визначається як 50 % рослин на полі почали виділяти пилок) Регресія може бути основана на кореляційній взаємодії між будь-якою стадією розвитку волоті і стадією розвитку квітки або GDU-вимогами для Р-стадії. Така кореляційна взаємодія виражається діленням GDU, необхідних для досягнення деякої стадії розвитку квіток або Рстадії. У одному варіанті здійснення винаходу стадія розвитку квіток або Р-стадія для регресії є Р50, в якій 50 % популяції рослин маїсу виділяють пилок. У іншому варіанті здійснення винаходу стадія розвитку квіток або Р-стадія виділення пилка для обчислення регресії може складати приблизно від 1 % до 100 %, включаючи приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99 %. Стадія розвитку волоті для регресії може знаходитися між Т0 і Т7, така як T0, T1, T2, T3, T4, T5, T6 і T7. Незалежно від стадії розвитку волоті і стадії розвитку квіток, вибраної для створення регресії, Відносну шкалу розвитку можна отримати побудовою графіка залежності GDU, необхідних для досягнення певної стадії виділення пилка, відносно числа GDU, необхідного для досягнення даної стадії розвитку волоті. Цей аспект проілюстрований на фіг. 5. Використовуваний в даному документі термін "що визначає" стосується дії вимірювання, визначення, оцінки, розрахунку, моніторингу і/або прогнозу. Наприклад, "визначення розвитку волоті" в контексті цього документа включає вимірювання поточної стадії розвитку волоті, моніторинг прогресу розвитку волоті і/або прогноз початку наступної стадії розвитку волоті. Тому, винахід стосується способу отримання Відносної шкали розвитку, що включає в себе вимірювання градусо-одиниць росту, необхідних для досягнення популяцією рослин маїсу 13 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 певної стадії розвитку волоті; вимірювання градусоодиниць росту, необхідних для досягнення вказаною популяцією рослин маїсу певної стадії розвитку квіток; і створення лінії регресії діленням вказаних виміряних градусо-одиниць росту, необхідних для досягнення вказаною популяцією рослин маїсу вказаної певної стадії розвитку волоті, на вказані виміряні градусоодиниці росту, необхідні для досягнення вказаною популяцією рослин маїсу вказаної певної стадії розвитку квіток. Стадію вимірювання можна повторити щонайменше для двох популяцій рослин маїсу. Стадію вимірювання можна повторити для множини стадій розвитку волоті і/або множини стадій розвитку квіток. Певною стадією розвитку квіток може бути виділення пилка приблизно 50 процентами популяції рослин маїсу. Винахід також стосується способу визначення оптимального діапазону в межах Відносної шкали розвитку для схеми обробки, зчепленої з розвитком волоті, що таким чином дозволяє визначити оптимальний час схеми обробки, в якій стадія розвитку є важливим фактором. Прикладом такої обробки є застосування однократної схеми обробки стандартним хімічним агентом для максимальної ефективності в забезпеченні стерильності волотей маїсу серед різних батьківських генотипів при отриманні гібридного насіння маїсу безвідносно генотипа або групи стиглості. Використовуваний в даному документі термін "гібридне насіння" є насінням, що отримується перехресним запиленням двох рослин. Рослини, вирощені з гібридного насіння, можуть мати поліпшені агротехнічні характеристики, такі як велика врожайність, велика однорідність і/або стійкість до захворювань. Гібридне насіння не є чисто лінійним, тобто насіння, отримане в результаті самозапліднення гібридної рослини (рослини, вирощеної з гібридного насіння), не обов'язково дасть в наступному поколінні ідентичну гібридну рослину. Тому, нове гібридне насіння необхідно отримувати з лінійних батьківських рослин для кожного саджання. Оскільки більшість зернових рослин мають як чоловічі, так і жіночі органи гібридне насіння можна отримувати, тільки попереджаючи самозапилення жіночої батьківської рослини і дозволяючи або сприяючи запиленню бажаної пилком. Існує множина способів попередження самозапилення жіночої батьківської рослини, причому в одному способі самозапилення попереджають механічним видаленням органу, який продукує пилок, перед виділенням пилка. Комерційне отримання гібридного насіння маїсу (маїс, Zea mays) звичайно включає в себе саджання бажаних чоловічих і жіночих батьківських ліній, звичайно окремими рядами або блоками на виділеному полі, обробку жіночих батьківських рослин для попередження полінації, гарантії запилення жіночих батьківських рослин тільки пилком призначених чоловічих рослин і збирання гібридного насіння тільки у жіночих батьківських рослин. Гібридне насіння може бути результатом однократного схрещування (наприклад, першим поколінням при схрещуванні між двома інбредними лініями), модифікованого однократного схрещування (наприклад, першим поколінням при схрещуванні між двома інбредними лініями, одна або інша з яких могли бути трохи модифіковані із застосуванням близькоспорідненого схрещування), подвійного схрещування (наприклад, першого покоління схрещування між двома однократними схрещуваннями), потрійного схрещування (наприклад, першого покоління схрещування між однократним схрещуванням і інбредною лінією), лінійного схрещування (наприклад, першим поколінням схрещування між інбредною лінією і сортом-популяцією, або першим поколінням схрещування між однократним схрещуванням і сортом-популяцією) або є сортом-популяцією (наприклад, популяцією рослин, відібраних по стандарту, який може мати варіації, але має характеристики, по яких сорт можна відрізнити від інших сортів). При отриманні гібридного насіння, продукцію і/або виділення пилка жіночою батьківською рослиною можна попередити, для того, щоб сприяти запиленню жіночої батьківської рослини тільки призначеною чоловічою батьківською рослиною і, таким чином, отримати гібридне насіння. Цього можна досягнути будь-яким способом або засобом, відомим досвідченим фахівцям в даній галузі, включаючи без обмежень, ручне видалення (або видалення руками) волотей, механічне видалення волотей, використання генетичних засобів контролю запилення і/або використання хімічного агента. Будь-який з них можна об'єднувати або використовувати індивідуально. Видалення волотей можна здійснювати вручну або руками, і звичайно його виконує людина, обриваючи віночки у рослини маїсу, звичайно відділяючи віночки. При механічному або машинному видаленні волотей звичайно використовують машину для видалення волотей, що називається "косаркою", яка рухається по рядах маїсу і зрізає верхню частину рослин. Потім, через декілька днів машина "витягач" рухається по рядах маїсу і обриває віночки у рослин, захоплюючи їх між двома валками, які рухаються з високою швидкістю. Машини для видалення волотей, придатні в практичному застосуванні способів за даним винаходом, включають ці пристрої, встановлені на машини з високим кліренсом. Косаркою може бути обертове лезо або обертовий ніж, який ріже в різних площинах від горизонтальної до 14 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вертикальної, регульований по висоті, для зрізання або відрізання верхівки рослини маїсу, включаючи віночок. Витягач може являти собою два невеликі колеса або валка, регульованих по висоті, які обертаються в протилежних напрямках і захоплюють віночки і верхнє листя, витягуючи їх вгору, аналогічно ручному видаленню волотей. Витягачі і косарки можна використовувати окремо або спільно і/або в комбінації з іншими способами видалення волотей. Тимчасове вікно для видалення волотей звичайно є найбільш критичним і важким в організації періодом при продукції гібридного насіння маїсу. У даній галузі також використовують хімічні агенти і/або генетичні засоби для попередження утворення життєздатного пилка або виділення пилка. Винахід стосується способу визначення часу видалення волотей шляхом вибору діапазону на Відносній шкалі розвитку, причому вибраний діапазон вказує на дозрівання до бажаної стадії розвитку волоті. Бажаною стадією розвитку волоті є стадія з Т0 до Т7, наприклад, стадія Т5. Стадією розвитку волоті, що представляє особливий інтерес, є стадія розвитку волоті, оптимальна для репродуктивного схрещування, стадія розвитку волоті, оптимальна для стерилізації волотей або видалення волотей, і/або стадія, оптимальна для проведення модулюючої розвиток обробки на рослині маїсу. При створенні і використанні Відносної шкали розвитку певною стадією розвитку квіток, Відносної шкали розвитку, що використовується для створення, може бути виділення пилка приблизно 50 процентами популяції рослин маїсу. Прикладом діапазону на Відносній шкалі розвитку, який можна використовувати зі способом за винаходом, є діапазон від приблизно 0,62 і до приблизно 0,75 на Відносній шкалі розвитку. Визначення часу розвитку волоті може бути корисне для агротехнічних способів, включаючи планування і/або стандартизацію способів практичного застосування, які пов'язані з розвитком рослин. Приклади включають: способи, що вимагають застосування хімічного агента за часом, такі як застосування гербіциду, фунгіциду, фертилайзера і/або регулятора росту для інбредних рослин, що мають протилежні групи стиглості; способи, що вимагають моніторингу, прогнозування і/або регулювання розвитку волоті, такі як моніторинг чоловічих інбредних рослин по ранньому розвитку волоті, який може привести до зниження виділення пилка, і забезпечення відповідної обробки для впливу на розвиток волоті; способи, що вимагають застосування гормону і/або регулятора росту за часом для корекції порушень і/або для отримання бажаного агротехнічного результату; і/або будь-які способи, що вимагають застосування модулюючої розвиток обробки на рослини маїсу на вказаній бажаній стадії розвитку волоті. Винахід можна використовувати для польового планування і/або дослідницької роботи, наприклад, для прогнозування необхідного об'єму роботи, пов'язаної з видаленням волотей або розвитком рослин; для очікування вимог, пов'язаних з розвитком волотей; для визначення того, як стрес впливає на розвиток волотей; і/або для застосування в скринінгу і оцінці ознак, і/або інбредних рослин або гібридів при накладанні стресу в певні стадії розвитку, визначені за допомогою прогнозування стадій розвитку волоті. Винахід стосується способів, які можна використовувати для визначення часу, коли обробка, що модулює розвиток, є оптимально ефективною, з використанням Відносної шкали розвитку. Використовуваний в даному документі термін "модулююча розвиток обробка" стосується застосування щонайменше одного фізичного впливу і/або хімічного агента, які впливають на розвиток рослини. Розвиток рослини включає, але не обмежений цим, розвиток квіток, розвиток коріння, розвиток листя, розвиток стебел, розвиток волотей, розвиток репродуктивних органів, розвиток гамет, розвиток пилка, розвиток насіння і/або розвиток будь-якої іншої частини рослини. Модулююча обробка може викликати зупинку, сповільнення, попередження, затримку або посилення розвитку. Модулюючою розвиток обробкою може бути фізичний вплив, такий як видалення волотей, обпікання (використання пальника для обпікання верхівок чоловічих рослин як засобу сповільнення дозрівання) і/або обдирання, стирання, зішкрібання, надсікання, відрізання, проколювання, ультразвукова обробка, від'єднування, руйнування, видалення, подрібнення, обрізання і/або приховування будь-якої частини рослини. Обробкою, що модулює розвиток, може бути хімічний агент, такий як природні або синтетичні сполуки. Хімічні агенти, які можуть бути корисні як модулююча розвиток обробка включають регулятори росту рослин, інгібітори регуляторів росту рослин, рослинні гормони, інгібітори рослинних гормонів, стимулятори росту рослин, уповільнювачі росту рослин, фунгіциди, інсектициди, гербіциди, ауксини, антиауксини, цитокініни, дефоліант, інгібітори етилену, сполуки, сприяючі вивільненню етилену, гібереліни, морфактини і гаметоциди. Прикладом фізичного впливу для застосування в способах за винаходом є видалення волотей і/або обпікання. Прикладом хімічного агента для використання в способах за винаходом є гербіцид гліфосат. Модулюючу розвиток обробку можна застосовувати на будь-якій стадії розвитку рослини маїсу, наприклад, коли стадія розвитку волоті відповідає діапазону від 0,62 до 0,75 по Відносній шкалі розвитку, який включає 15 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 в себе стадію розвитку волоті Т5. Здатність ідентифікувати оптимально ефективний період для застосування обробки, що модулює розвиток волоті, з використанням приведеної Відносної шкали розвитку є одним аспектом винаходу. У даній галузі відома множина обробок, що модулюють розвиток волоті, включаючи хімічні агенти, здатні попереджувати розвиток пилка або виділення пилка, які були б корисні в застосуванні на практиці способів за винаходом. Винахід можна застосовувати для отримання гібридного насіння з використанням способів за винаходом. Винахід стосується способів, за допомогою яких першу батьківську рослину маїсу схрещують з другою батьківською рослиною маїсу, причому продукція пилка першою батьківською рослиною маїсу інгібована в результаті застосування модулюючої розвиток обробки. Способи за винаходом можна використовувати для визначення стадії розвитку і/або часу, коли застосування модулюючої розвиток обробки буде максимально ефективним. Винахід може бути особливо корисним в способах, приведених в патенті США № 6762344 і публікації патентної заявки СШК № 2009/0165166. У одному варіанті здійснення винахід являє собою гібридне насіння, отримане з використанням способів за винаходом, включаючи рослини і частини рослини, вирощеної з гібридного насіння і продукти споживання, вироблені з них. Винахід стосується способу застосування рослин трансгенної події MON 87427 маїсу для продукції гібридного насіння, причому гліфосат використовують в якості обробки, що модулює розвиток волоті, у рослин MON 87427 для попередження утворення пилка. Це зумовлено можливістю попереджувати виділення пилка жіночими батьківськими лініями, що містять MON 87427, своєчасним застосуванням гліфосату, таким чином, попереджуючи самозапилення. Якщо застосовувати гліфосат дуже рано відносно розвитку волотей, то чоловічі репродуктивні тільця можуть недостатньо розвинутися, щоб обробка була повністю ефективною. Якщо застосовувати гліфосат дуже пізно відносно розвитку волоті, то може вже відбуватися викидання пильовиків, і обробка гліфосатом може бути не здатна попередити розвиток пилка. Тому, час застосування гліфосату відносно розвитку волоті важливо для гарантії максимальної ефективності і, тому, максимальної чистоти гібридного насіння, що отримується. У одному варіанті здійснення винаходу оптимальний час застосування гліфосату для цього способу можна ідентифікувати, визначаючи час розвитку волоті рослин MON 87427 з використанням Відносної шкали розвитку і вибору діапазону на Відносній шкалі розвитку, який вказує на досягнення бажаної стадії розвитку волоті. Це визначення часу розвитку волоті потім можна використовувати для ідентифікації часу застосування гліфосату як модулюючу розвиток обробку на рослині MON 87427, таким чином, попереджуючи самозапліднення і збільшуючи продукцію гібридного насіння. Способи за винаходом виявляють, що розвиток волоті в діапазоні від 0,62 до 0,75 по Відносній шкалі розвитку або Т5, є оптимальним діапазоном для застосування гліфосату на рослинах MON 87427 для попередження утворення пилка. Тому, в системі гібридизації Roundup® для будь-якої даної батьківської жіночої лінії будь-якої даної групи стиглості оптимальний час буде прогнозуватися множенням GDU, необхідних для досягнення P50 для цієї батьківської жіночої лінії на будь-яке значення в межах цього діапазону. Коли результат цього обчислення буде дорівнювати GDU даного вегетаційного сезону, то буде з'ясований оптимальний час застосування гліфосату. Відносні шкали розвитку можна отримувати з використанням інших показників виділення пилка, і інших показників Т-шкали, які можна буде застосовувати, не виходячи за межі об'єму винаходу. Ще один аспект винаходу стосується способу, який корисний для визначення стадії розвитку волоті, при якій репродуктивне схрещування є оптимальним. Аналогічно тому, як відмінності в розвитку по генотипах перешкоджають достовірному прогнозуванню оптимальних модулюючих обробок, основаних тільки на V-стадіях або GDU, визначення часу для перехресного запилення за допомогою Відносної шкали розвитку також може бути ефективним. Просте дослідження з використанням Відносної шкали розвитку може виявити, що перехресне запилення є оптимальним в деякому діапазоні на цій шкалі. Крім того, знаючи GDU, необхідні для Р50 даного генотипа, можна буде точно визначити час досягнення діапазону, не покладаючись на недостовірні вегетативні показники або не проводячи часозатратну фізичну оцінку розвитку волоті. Описи способів схрещування, які звичайно використовуються для різних ознак і зернових, можна знайти в одному з декількох довідників 16 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 При застосуванні на практиці способів за винаходом одна або обидві батьківські рослини маїсу можуть містити одну або декілька бажаних ознак, що представляють агротехнічний інтерес. Наприклад, батьківську рослину маїсу MON 87427 можна використовувати в продукції гібридного насіння для схрещування з другою батьківською рослиною маїсу, яка містить щонайменше один ген і/або ознаку, що представляє агротехнічний інтерес. У цьому варіанті здійснення винаходу Відносну шкалу розвитку можна використовувати для моніторингу і/або визначення репродуктивної стадії розвитку батьківської рослини маїсу MON 87427 для точного визначення часу обробки батьківської рослини маїсу MON 87427 гліфосатом до утворення пилка, таким чином попереджуючи самозапліднення. Рослини події MON 87427 потім запилювалися б другою батьківською рослиною маїсу, і гібридне насіння маїсу збирали б від рослин події MON 87427, причому насіння, зібране від оброблених рослин MON 87427 мало більший вихід гібридного насіння маїсу (тобто, вищий процентний вміст гібридного насіння, що збирається, або вищу чистоту гібридного насіння), ніж насіння маїсу, зібране від необроблених або оброблених в невідповідний час рослин події MON 87427 або від іншої(их) рослини(ин) маїсу в таких же умовах. Ознаки і гени, що представляють агротехнічний інтерес, добре відомі в даній галузі і включають, але не обмежені цим, наприклад, гени стійкості до гербіцидів, чоловічої стерильності, підвищення врожайності, контролю комах, стійкості до грибкових захворювань, стійкості до вірусів, стійкості до нематод, стійкості до бактеріальних захворювань, росту і розвитку рослин, продукції крохмалю, модифікованої і/або високої продукції олії, модифікованого вмісту жирних кислот, продукції великої кількості білка, дозрівання фруктів, збільшеної поживності для тварин і/або людини, біополімерів, стійкість до стресу, що викликається навколишнім середовищем, гени фармацевтичних пептидів і секретованих пептидів, гени, ознак, поліпшуючих переробку, гени підвищеної перетравлюваності, низького вмісту рафінози, промислової продукції ферментів, поліпшеного аромату, фіксації азоту, продукції гібридного насіння, продукції клітковини і/або продукції біопалива. Прикладами рослин, що мають одну або декілька бажаних ознак є зареєстровані в Службі по контролю за здоров'ям тварин і рослин (APHIS) Департаменту сільського господарства США як стійкі до гербіцидів (наприклад, події маїсу MON 88017, NK603, DAS-68416-4, HCEM485, DP-098140-6, Р356043-5, MIR604, 59122, TC-6275, Line 1507, MON 802, T14 і/або T25), як стійкі до комах (наприклад, події маїсу MON 863, MON 809, MON 810, MON 89034, MON 88017, MON 802, MIR162, TC-6275, DBT418, B16, TC-1507, DAS 59122-7, MIR604 і/або MON 80100), і/або які мають інші бажані ознаки (наприклад, події маїсу LY038, MON 87460 і/або 3272) (повний список і опис таких ознак доступний на веб-сайті Уряду США, http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html). У застосуванні на практиці способів за винаходом можна використовувати інбредну лінію, сорт або гібрид (або будь-який інший генотип). Наприклад, елітною інбредною лінією є лінія рослин маїсу, яка отримана схрещуванням і відбиранням по найвищих агротехнічним показниках. Генотипи можуть бути трансформовані і/або використані в способах схрещування, щоб включити в них ген, що представляє агротехнічний інтерес, такий як ген стійкості до гліфосату, і події можна відбирати по їх придатності як жіноча або чоловіча батьківська рослина в системі продукції гібридного насіння. Елітні генотипи маїсу для використання в практичному застосування винаходу включають, але не обмежені цим: CI9805 (патентна публікація США № 20030093826); LH321 (патентна 17 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 публікація США № 20030106086); Н0I002 (патентна публікація США № 20030154524); HOI001 (патентна публікація США № 20030172416); 5750 (патентна публікація США № 20030177541); G0502 (патентна публікація США № 20030177543); G1102 (патентна публікація США № 20030177544); HX879 (патентна публікація США № 20040068771); 6803 (патентна публікація США № 20040088767); 5020 (патентна публікація США № 20040088768); G3001 (патентна публікація США № 20040098768); LH268 (патентна публікація США № 20040111770); LH311 (патентна публікація США № 20040111771); LH306 (патентна публікація США № 20040111772); LH351 (патентна публікація США № 20040111773); LHE323 (патентна публікація США № 20040111774); 402A (патентна публікація США № 20040123352); 366C (патентна публікація США № 20040139491); NP2315 (патентна публікація США № 20040143866); PH0GC (патентна публікація США № 20040194170); SE8505 (патентна публікація США № 20050015834); D201 (патентна публікація США № 20050028236); BE1146BMR (патентна публікація США № 20050076402); PHCAM (патентна публікація США № 20050114944); PHCK5 (патентна публікація США № 20050114945); PHC77 (патентна публікація США № 20050114951); PHCND (патентна публікація США № 20050114952); PHCMV (патентна публікація США № 20050114953); PHB00 (патентна публікація США № 20050114955); PHCER (патентна публікація США № 20050114956); PHCJP (патентна публікація США № 20050120437); PHADA (патентна публікація США № 20050120439); PHB8V (патентна публікація США № 20050120443); 6XN442 (патентна публікація США № 20050125864); 4XP811 (патентна публікація США № 20050125865); PHCCW (патентна публікація США № 20050125866); MN7224 (патентна публікація США №20050132433); BE9514 (патентна публікація США № 20050132449); PHCA5 (патентна публікація США № 20050138697); PHCPR (патентна публікація США № 20050144687); PHAR1 (патентна публікація США № 20050144688); PHACV (патентна публікація США № 20050144689); PHEHG (патентна публікація США № 20050144690); NP2391 (патентна публікація США № 20050160487); PH8WD (патентна публікація США № 20050172367); D501 (патентна публікація США № 20050177894); D601 (патентна публікація США № 20050177896); D603 (патентна публікація США № 20050177904); PHCEG (патентна публікація США № 20050223443); W16090 (патентна публікація США № 20050273876); M10138 (патентна публікація США №. 20050273877); N61060 (патентна публікація США № 20050273878); NP2460 (патентна публікація США № 20060048243); BS112 (патентна публікація США № 20060070146); PHDWA (патентна публікація США № 20060107393); PH8JV (патентна публікація США № 20060107394); PHEWW (патентна публікація США № 20060107398); PHEDR (патентна публікація США № 20060107399); PHE67 (патентна публікація США № 20060107400); PHE72 (патентна публікація США № 20060107408); PHF1J (патентна публікація США № 20060107410); PHE35 (патентна публікація США № 20060107412); PHEHR (патентна публікація США № 20060107415); PHDPP (патентна публікація США № 20060107416); PHEHC (патентна публікація США № 20060107418); PHANF (патентна публікація США № 20060107419); PHC78 (патентна публікація США № 20060107420); PH8T0 (патентна публікація США № 20060107421); PHDRW (патентна публікація США № 20060107422); PHEGV (патентна публікація США № 20060107423); PHEBA (патентна публікація США № 20060107426); PHENE (патентна публікація США № 20060112463); PHEJW (патентна публікація США № 20060112464); PHAPT (патентна публікація США № 20060112465); PHCND (патентна публікація США № 20060130188); PHCEG (патентна публікація США № 20060130189); PHADA (патентна публікація США № 20060130190); PHEED (патентна публікація США № 20060143744); PHHB (патентна публікація США № 5633427); LH262 (патент США № 5633428); LH227 (патент США № 5633429); LH226 (патент США № 5639941); LH235 (патент США № 5639942); LH234 (патент США № 5639943); PHDP0 (патент США № 5639946); PH06N (патент США № 5675066); LH177 (патент США № 5684227); PH24E (патент США № 5689034); PHP38 (патент США № 5708189); ASG06 (патент США № 5714671); CG00685 (патент США № 5723721); PHND1 (патент США № 5723722); PH44A (патент США № 5723723); ZS01591 (патент США № 5723724); ZS01101 (патент США № 5723725); ZS01452 (патент США № 5723726); ZS01429 (патент США № 5723727); ZS01819 (патент США № 5723728); ZS01250 (патент США № 5723729); ZS01595 (патент США № 5723730); CG3ND97 (патент США № 5728923); NP938(934) (патент США № 5728924); PHNG2 (патент США № 5731491); CG5NA58 (патент США № 5731502); NP948 (патент США № 5731503); LH236 (патент США № 5731504); CG00766 (патент США № 5731506); PHOAA (патент США № 5750829); PH15A (патент США № 5750830); PH25A (патент США № 5750831); PH44G (патент США № 5750832); PH0CD (патент США № 6084160); ASG25 (патент США № 6084161); 86ISI15 (патент США № 6084162); BE4547 (патент США № 6084163); PH21T (патент США № 6091007); 01DHD16 (патент США № 6096952); PH224 (патент США № 6096953); ASG26 (патент США № 6103958); ASG28 (патент США № 6103959); PH0V0 (патент 18 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 США № 6107550); 90LCL6 (патент США № 6111171); 22DHD11 (патент США № 6111172); ASG17 (патент США № 6114606); AR5253bm3 (патент США № 6114609); ASG27 (патент США № 6114610); WDHQ2 (патент США № 6114611); PH3GR (патент США № 6114613); PH1NF (патент США № 6118051); PH0JG (патент США № 6118053); PH189 (патент США № 6118054); PH12J (патент США № 6118055); PH1EM (патент США № 6118056); 90DJD28 (патент США № 6121519); PH12C (патент США № 6121520); PH55C (патент США № 6121522); PH3EV (патент США № 6121523); ZS4199 (патент США № 6121525); PH2V7 (патент США № 6124529); PH4TF (патент США № 6124530); PH3KP (патент США № 6124531); PH2MW (патент США № 6124532); PH2N0 (патент США № 6124533); PH1K2 (патент США № 6124534; PH226 (Патент США № 6124535); PH2VJ (Патент США № 6127609); PH1M8 (Патент США № 6127610); WQCD10 (Патент США № 6130369); PH1B8 (патент США № 6130370); 17DHD5 (патент США № 6133512); PH0WD (патент США № 6133513); PH3GK (патент США № 6133514); PH2VK (патент США № 6137036); PH1MD (патент США № 6137037); SM4603 (патент США № 6137038); PH04G (патент США № 6140562); NP2151 (патент США № 6140563); PH5DR (патент США № 6727413); LH254 (патент США № 6730833); PH5WB (патент США № 6730834); PH7CH (патент США № 6730835); PH54M (патент США № 6730836); PH726 (патент США № 6730837); PH48V (патент США № 6734348); PH3PV (патент США № 6737566); PH77V (патент США № 6740795); PH7JB (патент США № 6740796); NP2316 (патент США № 6740797); PH70R (патент США № 6740798); RAA1 (патент США № 6747194); VMM1 (патент США № 6747195); PH3RC (патент США № 6747196); MNI1 (патент США № 6753465); 5750 (патент США № 6756527); PH6KW (патент США № 6756528); PH951 (патент США № 6756530); PH6ME (патент США № 6759578); NP2171 (патент США № 6759579); PH87H (патент США № 6759580); PH26N (патент США № 6765132); RII1 (патент США № 6765133); PH9AH (патент США № 6770802); PH51H (патент США № 6774289); PH94T (патент США № 6774290); PH7AB (патент США № 6777599); PH5FW (патент США № 6781042); PH75K (патент США № 6781043); KW7606 (патент США № 6784348); PH8CW (патент США № 6784349); PH8PG (патент США № 6784350); RBOl (патент США № 6797869); 9SM990 (патент США № 6803509); PH5TG (патент США № 6806408); 1501150 (патент США № 6806409); 1390186 (патент США № 6806410); PH6JM (патент США № 6809240); KW4636 (патент США № 6809243); 1363128 (патент США № 6809244); LH246 (патент США № 6812386); 2JK221 (патент США № 6812387); PHN46 (патент США № 5567861); ZS0223 (патент США № 5569813); phajo (патент США № 5569816); PHJJ3 (патент США № 5569817); phap8 (патент США № 5569818); PHPP8 (патент США № 5569819); ZS1284 (патент США № 5569820); PHT11 (патент США № 5569821); phte4 (патент США № 5569822); ZS0114 (патент США № 5569826); 7054 (патент США № 5576473); ZS0560 (патент США № 5585533); ZS0853 (патент США № 5585534; ZS1791 (патент США № 5585539); ZS1513 (патент США № 5585541); ZS1679 (патент США № 5589606); ZS1022 (патент США № 5602314); ZS1202 (патент США № 5602315); ZS1783 (патент США № 5602316); PHDG1 (патент США № 5602318); PHKV1 (патент США № 5608138); PH05F (патент США № 5608139); PH38B (патент США № 5608140); PH42B (патент США № 5618987); PHDD6 (патент США № 5625129); ZS0541 (патент США № 5625131); PH08B (патент США № 5625132); PHOC7 (патент США № 5625133); LH233 (патент США № 5625135); ASG05 (патент США № 5723731); LH281 (патент США № 5723739); PHBF0 (патент США № 5728919); CG5NA01 (патент США № 5728922); AR5651bm3 (патент США № 5977458); LH266 (патент США № 5977459); LH303 (патент США № 5977460); LH301 (патент США № 5981855); 4SQ601 (патент США № 5986182); PH1TB (патент США № 5986184); PH24D (патент США № 5986185); LH229 (патент США № 5986186); LH277 (патент США № 5986187); PH1CN (патент США № 5990393); LH261 (патент США № 5990394); W1498A (патент США № 5990395); WQDS2 (патент США № 5994631); NL085B (патент США № 5998710); PH09E (патент США № 5998711); 5 LH284 (патент США № 6015944); PH1B5 (патент США № 6020543); PH1CA (патент США № 6025547); 70LDL5 (патент США № 6031160); GM9215 (патент США № 6031161); 90LDI1 (патент США № 6031162); 90LDC2 (патент США № 6034304); 90QDD1 (патент США № 6034305); R398D (патент США № 6034306); RDBQ2 (патент США № 6037531); HX621 (патент США № 6040506); HX622 (патент США № 6040507); 01HG12 (патент США № 6040508); HX740 (патент США № 6043416); 79314N1 (патент США № 6043417); 17INI20 (патент США № 6043418); 17DHD7 (патент США № 6046387); 83INI8 (патент США № 6046388); 83InI14 (патент США № 6046389); 01INL1 (патент США № 6046390); LH286 (патент США № 6049030); ASG29 (патент США № 6054640); ASG07 (патент США № 6060649); QH111 (патент США № 6069303); 09DSQ1 (патент США № 6072108); JCRNR113 (патент США № 6072109); NP2029 (патент США № 6072110); ASG09 (патент США № 6077996); PHOWE (патент США № 6077997); 86AQV2 (патент США № 6077999); PH1GG (патент США № 6080919); RPK7346 (патент США № 6506965); NP2044BT (патент США № 6573438); PH8W4 (патент США № 6600095); M42618 (патент США № 19 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6617500); MV7100 (патент США № 6624345); 3JP286 (патент США № 6627800); BE4207 (патент США № 6632986); CI9805 (патент США № 6632987); JCR503 (патент США № 6635808); NR401 (патент США № 6635809); 4VP500 (патент США № 6635810); 7SH385 (патент США № 6642440); KW4773 (патент США № 6642441); NP2073 (патент США № 6646187); PSA104 (патент США № 6646188); 5XH755 (патент США № 6653536); 1445-008-1 (патент США № 6653537); NP2015 (патент США № 6657109); 7SH383 (патент США № 6660916); LH310 (патент США № 6664451); I880S (патент США № 6670531); RR728-18 (патент США № 6677509); LH320 (патент США № 6683234); 11084BM (патент США № 6686519); W60028 (патент США № 6686520); PH1GD (патент США № 6693231); LH295 (патент США № 6693232); PH1BC (патент США № 6700041); PH4V6 (патент США № 6706954); NP2276 (патент США № 6706955); NP2222 (патент США № 6710233); Ph0R8 (патент США № 6717036); PH581 (патент США № 6717037); PH6WR (патент США № 6717038); PH5HK (патент США № 6717039); PH5W4 (патент США № 6717040); PH0KT (патент США № 6720486); PH4GP (патент США № 6720487); PHJ8R (патент США № 6723900); NP2052 (патент США № 6723901); PH7CP (патент США № 6723902); PH6WG 15 (патент США № 6723903); PH54H (патент США № 6727412); 4P33339 (патент США № 5489744); PHKM5 (патент США № 5491286); LH225 (патент США № 5491293); LH185 (патент США № 5491294); LH176 (патент США № 5491296); PHW06 (патент США № 5495065); LH252 (патент США № 5495067); LH231 (патент США № 5495068); PHTE4 (патент США № 5495069); PHP38 (патент США № 5506367); PHN82 (патент США № 5506368); PHTD5 (патент США № 5527986); 899 (патент США № 5530181); PHAP1 (патент США № 5530184); PHKW3 (патент США № 5534661); CG00653 (патент США № 5536900); PHRD6 (патент США № 5541352); PHK46 (патент США № 5543575); PHBG4 (патент США № 5545809); LH189 (патент США № 5545811); PHNJ2 (патент США № 5545812); PHRF5 (патент США № 5545813); PHFR8 (патент США № 5545814); PHN18 (патент США № 5557034); PHTP9 (патент США № 5557038); PH54B (патент США № 5563320); PHGF5 (патент США № 5563321); PHAG6 (патент США № 5563322); PHAP9 (патент США № 5563323); PHBE2 (патент США № 5563325); ZS0510 (патент США № 5563327); PHAAO (патент США № 5602317); LH273 (патент США № 5880348); 7571 (патент США № 5880349); LH237 (патент США № 5880350); PH0B4 (патент США № 5889188); FEBS (патент США № 5902922); 8F286 (патент США № 5905191); 3AZA1 (патент США № 5910625); 91DFA-5 (патент США № 5910635); ASG20 (патент США № 5910636); ZS03940 (патент США № 5912420); 91ISI6 (патент США № 5912421); MF1113B (патент США № 5914452); PH03D (патент США № 5917125); PHDN7 (патент США № 5917134); 01DIB2 (патент США № 5920003); 82DHB1 (патент США № 5922935); 8M222 (патент США № 5922936); PHMJ2 (патент США № 5929313); SBB1 (патент США № 5932787); 86ISI3 (патент США № 5932788); ZS01231 (патент США № 5936144); 87DIA4 (патент США № 5936145); 79310J2 (патент США № 5936146); PH1GC (патент США № 5936148); 01DHD10 (патент США № 5939606); PH2CB (патент США № 5939607); PH080 (патент США № 5939608); PH14T (патент США № 5942670); PH185 (патент США № 5942671); PH 19V (патент США № 5948957); ZS09247 (патент США № 5952551); CRAUGSH2W-89 (патент США № 5952552); 91DHA1 (патент США № 5962770); LH300 (патент США № 5965798); 91ISI4 (патент США № 5965799); 79103A1 (патент США № 5969212); ASG22 (патент США № 5969220); 82IUH1 (патент США № 5969221); (патент США № 5969222); LH302 (патент США № 5973238); LH265 (патент США № 5973239); PHFW4 (патент США № 5977451); 01IBH10(патент США № 5977452); 91CSI-1 (патент США № 5977453); WKBC5 (патент США № 5977455); PH1M7 (патент США № 5977456); R327H (патент США № 6399860); FR2108 (патент США № 6407320); FR3383 (патент США № 6410830); IT302 (патент США № 6414227); FR3303 (патент США № 6414228); 9034 (патент США № 6420634); G1500 (патент США № 6420635); FR3311 (патент США № 6420636); 1389972 (патент США № 6420637); PH77C (патент США № 6423888); IT201 (патент США № 6426451); G3000 (патент США № 6426453); 94INK1B (патент США № 6429363); PH3HH (патент США № 6433259); 6TR512 (патент США № 6433260); 89AHD12 (патент США № 6433261); 1889291 (патент США № 6433262); 2070BT (патент США № 6437223); 3323 (патент США № 6437224); G1900 (патент США № 6441279); 16IUL6 (патент США № 6441280); 7RN401 (патент США № 6444881); UBB3 (патент США № 6444882); 6077 (патент США № 6444883); 1014738 (патент США № 6444884); TDC1 (патент США № 6452074); GF6151 (патент США № 6452075); 7180 (патент США № 6452076); WQDS7 (патент США № 6455764); X532Y (патент США № 6459021); 1465837 (патент США № 6459022); 1784S (патент США № 6469232); LH176Bt810 (патент США № 6469233); 6RC172 (патент США № 6469234); 3327 (патент США № 6469235); 7SH382 (патент США № 6476298); 1181664 (патент США № 6476299); NP2010 (патент США № 6483014); FR3361 (патент США № 6483015); 1778S (патент США № 6486386); 1362697 (патент США № 6492581); RPK7250 (патент США № 20 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6506964); і 6RT321 (патент США № 6911588). Використовуваний в даному документі термін "що включає" означає "що включає, але не обмежений цим". Наступні приклади включені для демонстрації прикладів деяких переважних варіантів здійснення винаходу. Досвідченим фахівцям в даній галузі потрібно розуміти, що методики, розкриті в нижченаведених прикладах, представляють підходи, які, як виявили автори винаходу, функціонують добре в застосуванні винаходу на практиці, і, тому, можуть розглядатися як складові приклади переважних варіантів здійснення винаходу на практиці. Однак досвідченим фахівцям в даній галузі в світлі даного розкриття винаходу повинно бути зрозуміло, що можна здійснити множину змін в конкретних варіантах здійснення, які розкриті в описі, і все ще отримати подібний або аналогічний результат, не відступаючи від суті і об'єму винаходу. Приклади Приклад 1: Трансформація маїсу і відбирання події MON 87427 Рослину маїсу MON 87427 отримували Agrobacterium-опосередкованою трансформацією маїсу. Клітини маїсу були трансформовані і регенеровані в цілі рослини маїсу, і з популяції рослин були відібрані окремі рослини, які показували збереження трансгенної експресійної касети і стійкість до гліфосату. З цієї популяції було відібрана і охарактеризована рослина події MON 87427 маїсу. Трансгенна стійка до гліфосату рослина маїсу MON 87427 була отримана за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації незрілих зародків маїсу з використанням трансформуючого вектора pMON58401. Трансгенна вставка і експресійна касета з MON 87427 включає в себе промотор і лідер з гена 35S-РНК вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), що містить дупліковану енхансерну область (P-e35S); функціонально пов'язані з ДНК-лідером з першого інтрона гена білка теплового шоку 70 (I-HSP70) маїсу; функціонально пов'язаним з молекулою ДНК, що кодує N-кінцевий пептид-переносник в хлоропласти з гена shkG, що кодує EPSPS з Arabidopsis thaliana (Ts-CTP2); функціонально пов'язаною з молекулою ДНК з гена aroA зі штаму CP4 агробактерій і кодуючою білок CP4 EPSPS; функціонально пов'язаної з молекулою ДНК 3’-UTR з гена нопалінсинтетази (T-NOS) з Agrobacterium tumefaciens. Клітини маїсу можна трансформувати різними способами. Наприклад, для отримання трансгенної рослини маїсу, що містить касету для експресії в рослинах за винаходом, можна використовувати наступний спосіб. Рідкі культури Agrobacterium tumefaciens, що містять касету для експресії в рослинах, ініціювали із законсервованих в гліцерині культур або з чашки зі свіжими штрихами бактерій і вирощували протягом ночі при 26-28 °C з гойданням (приблизно 150 обертів в хвилину, об/хв) до середини логарифмічної фази росту в рідкому середовищі LB, рН 7,0, що містить 50 мг/л (міліграмів на літр) канаміцину і або 50 мг/мл стрептоміцину, або 50 мг/л спектиноміцину, і 25 мг/л хлорамфеніколу з 200 мкМ ацетосирингоном (AS). Клітини агробактерій ресуспендували в середовищі для зараження (рідке СМ4С, описане в таблиці 8 патенту США № 6573361), і щільність клітин регулювали таким чином, що ресуспендовані клітини мали оптичну густину 1 при вимірюванні в спектрофотометрі при довжині хвилі 660 нм (тобто, OD660). Свіжовиділені незрілі зародки заражали агробактеріями і спільно культивували 2-3 дні в темряві при 23 °C. Потім зародки поміщували в сповільнююче середовище (N6 1-10012, описане в таблиці 1 патенту США № 5424412) з доданими карбеніциліном (500 мг/л, SigmaAldrich, St Louis, Mo.) і 20 мкM AgNO3 і інкубували при 28 °C протягом 4-5 днів. Всі подальші культури містили при даній температурі. Зародки переносили в перше середовище для відбирання (N61-0-12, описане в таблиці 1 патенту США № 5424412) з доданими карбеніциліном (500 мг/л) і 1,0 мМ гліфосатом. Через два тижні тканини, що вижили, переносили у друге середовище для відбирання (N61-0-12) з доданими карбеніциліном (500 мг/л) і 1,0 мМ гліфосатом. Калюс, що вижив, субкультивували кожні 2 тижні приблизно 3 разу на 1,0 мМ гліфосаті. Після ідентифікації стійких до гліфосату тканин, тканину нарощували для регенерації. Для регенерації калюсні тканини переносили в регенераційне середовище (MSOD, описане в таблиці 1 патенту США № 5424412) з доданою 0,1 мМ абсцизовою кислотою (ABA; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo.) і інкубували протягом двох тижнів. Калюси, що регенеруються, переносили в середовище з високим вмістом сахарози і інкубували протягом двох тижнів. Паростки переносили в середовище MSOD (без АВА) в культуральній посудині і інкубували протягом двох тижнів. Рослини з корінням і нормальними фенотипічними характеристиками відбирали і переносили в ґрунт для росту і подальшої оцінки. Рослини R0, створені за допомогою вищезгаданої трансформації, переносили в ґрунт для росту і подальшого самозапилення для отримання насіння R1. Рослини відбирали комбінацією аналітичних методик, включаючи TaqMan, ПЛР-аналіз і обприскування гербіцидом. Подію MON 87427 відбирали з 45 індивідуальних трансгенних подій на основі багаторічних аналізів, що демонструють чудові фенотипічні і молекулярні характеристики події і її бажану 21 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 асоціацію з гаплотипом (хромосома 9, 60 cM). Процес відбирання для події MON 87427 починали з трансформованих рослин маїсу, що представляють 45 подій R0. Їх обприскували 2 гліфосатом (64 унції/акр (1,81 кг/4047 м ) на стадії V7) і потім оцінювали по вегетативній стійкості і стерильності після обприскування гліфосатом. З вихідних 45 подій, 35 подій R0 виявляли вегетативну стійкість до гліфосату і чоловічу стерильність після обприскування тестованою концентрацією гліфосату у вказаний час. Проводили додаткову характеристику рослин цих 35 подій R0 за допомогою молекулярного аналізу. 35 подій R0 були молекулярно охарактеризовані з використанням ПЛРаналізу Taqman® і Саузерн-блот аналізу. З 35 проаналізованих подій 29 були відібрані для подальшої роботи і тестування в полі. 29 подій R1 були проаналізовані в польових випробуваннях на польову ефективність і врожайність. Крім цього, були проведені додаткові молекулярні характеристики, включаючи геномну характеристику і характеристику експресії білка. Дані були проаналізовані, і виходячи зі всебічного аналізу рослин R1 і результатів польових випробувань були відібрані три лідируючі події і висунуті для польового тестування R2. Подальший аналіз і тестування цих трьох лідируючих подій привели до відбирання події MON 87427. Додатковий польовий скринінг включав обробку події MON 87427 гліфосатом в кількості 32 2 унції/акр (907 г/4047 м ) (Roundup Ultra®, Monsanto Co., St. Louis, Mo.) на вегетативній стадії росту 4 (V4) і вегетативній стадії росту (V10). Підрахунок позитивної і негативної відповіді рослин проводили після обприскування на стадії V4. Крім того, у оброблених рослин проводили оцінку хлорозу і порушень розвитку через 10-14 днів після обробки (DAT) як на стадії V4, так і на стадії V10. Ступінь стерильності волотей в момент цвітіння також оцінювали для рослин, обприсканих на стадії V4 і V10. Приклад 2: характеристика послідовностей ДНК MON 87427 ДНК, вбудована в геном рослини маїсу MON 87427, і фланкуюча геномна послідовність були детально охарактеризовані методами молекулярного аналізу. Ці методи аналізу включали: секвеновані трансгенні вставки ДНК і геномної ДНК, фланкуючої трансгенну вставку, визначення числа трансгенних вставок (числа сайтів інтеграції в геномі маїсу), визначення числа піків (числа піків трансгенної ДНК в одному локусі), аналіз цілісності вбудованої генної касети, аналіз геномної ДНК, фланкуючої вставку, і асоціацію вставки з гаплотипними областями геному маїсу. Послідовності, фланкуючі трансгенну вставку ДНК в MON 87427 були визначені з використанням методик ПЛР. Геномну ДНК рослин виділяли з тканини рослин трансгенної лінії, вирощених в стандартних умовах теплиці. Тканину рослини заливали рідким азотом і розтирали в порошок, використовуючи ступку і товкач. ДНК виділяли, використовуючи набір для виділення геномної ДНК Nucleon™ PhytoPure™ Genomic DNA extraction kit (RPN8511, Amersham, Piscataway, N.J.) відповідно до протоколу виготівника. Після кінцевої стадії осадження ДНК ресуспендували в 0,5 мл ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA). Досвідчений фахівець в даній галузі може модифікувати цей спосіб для виділення ДНК з будь-якої тканини маїсу, включаючи, без обмежень, насіння. Аліквоту ДНК розщеплювали рестрикційними ендонуклеазами, виходячи з рестрикційного аналізу трансгенної ДНК. Після лігування рестрикційних фрагментів самих на себе проводили ПЛР з використанням праймерів, підібраних на основі послідовності трансгенної ДНК, які будуть ампліфікувати послідовності, що простягаються від 5’- і 3’-кінців трансгенної ДНК. Продукти ПЛР розділяли електрофорезом в агарозному гелі і очищали з використанням набору QIAGEN gel purification kit (Qiagen, Valencia, Calif.). Отримані ДНК-продукти секвенували напряму з використанням стандартних протоколів секвенування ДНК. 5’фланкуюча послідовність, яка переходить в праву граничну (RB) послідовність трансгенної ДНК експресійної касети представлена як SEQ ID NO: 7. 3’фланкуюча послідовність, яка переходить в ліву граничну (LB) послідовність трансгенної ДНК експресійної касети представлена як SEQ ID NO: 8. Послідовність, що повністю вбудована в геномну ДНК маїсу і містить ДНК експресійної касети, представлена як SEQ ID NO: 9. Послідовності виділених молекул ДНК порівнювали з послідовністю трансгенної ДНК для ідентифікації фланкуючої послідовності і спільно виділеного фрагмента трансгенної ДНК. Підтвердження присутності експресійної касети досягали за допомогою ПЛР з праймерами, підібраними, виходячи з виведених даних фланкуючої послідовності і відомої послідовності трансгенної ДНК. Послідовність дикого типу, що відповідає тій же області, в яку була вбудована трансгенна ДНК в трансформованій лінії, була виділена з використанням праймерів, підібраних з фланкуючих послідовностей в MON 87427. ПЛР-реакції проводили з використанням системи ампліфікації Elongase® (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Фланкуючі послідовності ДНК в MON 87427 і послідовність дикого типу LH198 аналізували відносно множини нуклеотидних і білкових баз даних. Цю інформацію використовували для дослідження взаємодії трансгена з рослинним 22 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 геномом і для пошуку консервативності сайту вбудовування. Приклад 3: способи, придатні для ідентифікації ДНК MON 87427 в зразку У цьому прикладі описані способи, придатні для ідентифікації ДНК події MON 87427 в зразку. Фланкуючу(і) послідовність(ності), геномну послідовність дикого типу маїсу і/або трансгенну послідовність можна використовувати для підбору праймерів і проб для використання в таких способах. У аналіз можна включити (або можна не включати) внутрішні контрольні праймер(и) і пробу(и). Описані способи температурної ампліфікації TAQMAN® з детекцією по кінцевій точці для ідентифікації події MON 87427 (специфічний до події аналіз) і/або синтетичного гена CP4EPSPS (що також називається CP4-Zm) (специфічний до трансгену аналіз) події MON 87427 в зразку. Фланкуюча(і) послідовність(ності) події, геномна послідовність дикого типу маїсу і/або трансгенна послідовність були використані для підбору праймерів і проб для використання в цих аналізах (таблиця 1). ДНК-праймери, що використовуються в специфічному до події аналізі, є праймерами SQ12763 (SEQ ID NO: 17) і SQ12886 (SEQ ID NO: 18) з 6-FAM™міченою пробою PB4352 (SEQ ID NO: 19). ДНК-праймери, що використовуються в специфічному до трансгену аналізі, є праймерами SQ20052 (SEQ ID NO: 11) і SQ20053 (SEQ ID NO: 12) з 6-FAM™-міченою пробою PB10016 (SEQ ID NO: 13). 6-FAM™ є флуоресцентним барвником від Applied Biosystems (Foster City, Calif.), приєднаним до зонда ДНК. Контроль для даного аналізу повинен включати позитивний контроль з ДНК маїсу, що містить подію MON 87427, негативний контроль з нетрансгенного маїсу і негативний контроль, який не містить ДНКматрицю. Крім того, необов'язковий контроль для ПЛР може включати праймери внутрішнього контролю і пробу внутрішнього контролю, специфічні до однокопійного гена в геномі маїсу. Досвідчений фахівець в даній галузі буде знати, як підібрати праймери, специфічні до однокопійного гена в геномі маїсу. ДНК-праймерами, що використовуються в специфічному до трансгену аналізі як внутрішні контролі є праймери SQ1241 (SEQ ID NO: 14) і SQ1242 (SEQ ID NO: 15) з VIC TAMRA-міченою пробою PB0084 (SEQ ID NO: 16). Праймери і пробу внутрішнього контролю для специфічного до трансгену аналізу можна використовувати на необов'язкових стадіях 5-6 (нижче). У специфічному до події аналізі не використовували внутрішніх контролів. Таблиця 1 Праймери і проби Праймери-проби CP4Zm Опис Назва SEQ ID NO SQ20052 11 SQ20053 12 Послідовність Специфічний до трансгену праймер 1 Специфічний до трансгену праймер 2 30 23 UA 115762 C2 Продовження таблицы 1 Специфічна до трансгену 6-FAM™проба PB10016 13 SQ1241 14 SQ1242 15 PB0084 16 Внутрішній контроль Внутрішній контроль VIC-проба внутрішнього контролю Праймери-проби MON 87427 Опис Специфічний до події праймер 1 Назва SQ12763 Послідовність 17 24 UA 115762 C2 Продовження таблицы 1 Специфічний до події праймер 2 SQ12886 18 PB4352 19 Специфічна до події 6-FAM™-проба 5 10 15 20 25 30 35 Приклади умов, прийнятних для способів TAQMAN® з детекцією по кінцевій точці, є наступними: Стадія 1: воду (18 МОм) підводять до кінцевого об'єму 10 мкл. Стадія 2: додати 5,0 мкл 2х універсальної "майстер»-суміші (все 4 дезоксинуклеотиду, фермент, буфер) до 1х кінцевої концентрації. Стадія 3: додати 0,5 мкл суміші специфічного до події праймера 1 (SEQ ID NO: 17) і специфічного до події праймера 2 (SEQ ID NO: 18) (ресуспендованих у воді (18 МОм) до концентрації 20 мкМ для кожного праймера) до 1,0 мкМ кінцевої концентрації (наприклад, в мікроцентрифугальній пробірці, щоб отримати 500 мкл з кінцевою концентрацією 20 мкМ потрібно додати: 100 мкл специфічного до події праймера 1 (SEQ ID NO: 17) з концентрацією 100 мкМ; 100 мкл специфічного до події праймера 2 (SEQ ID NO: 18) з концентрацією 100 мкМ; 300 мкл води (18 МОм)). Стадія 4: додати 0,2 мкл специфічної до події 6-FAM™ MGB-проби (SEQ ID NO: 19) (ресуспендованої у воді (18 МОм) до концентрації 10 мкМ) до кінцевої концентрації 0,2 мкМ. Стадія 5 (необов'язкова): додати 0,5 мкл суміші праймера 1 внутрішнього контролю і праймера 2 внутрішнього контролю (ресуспендованих у воді (18 МОм) до концентрації кожного праймера 20 мкМ) до кінцевої концентрації 1,0 мкМ. Стадія 6 (необов'язкова): додати 0,2 мкл VIC™-проби внутрішнього контролю (ресуспендованої у воді (18 МОм) до концентрації 10 мкМ) до кінцевої концентрації 0,2 мкМ. Стадія 7: додати 3,0 мкл виділеної ДНК (матриці) для кожного зразка з кожним одним з наступного, включаючи: 1. зразки листя для аналізу; 2. негативний контроль (нетрансгенну ДНК); 3. негативний контроль воду (немає матриці); 4. позитивний контроль ДНК MON 87427. Стадія 8: умови термоциклера були наступними: один цикл при 50 °C протягом 2 хвилин; один цикл при 95 °C протягом 10 хвилин; десять циклів (95 °C протягом 15 секунд, потім 64 °C протягом 1 хвилини с −1 °C/цикл); тридцять циклів (95 °C протягом 15 секунд, потім 54 °C протягом 1 хвилини); кінцевий цикл при 10 °C. Ці аналізи оптимізовані для використання або з Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700 (операції на максимальній швидкості) або термоциклером MJ Research DNA Engine PTC225. Інші способи і апарати, відомі досвідченим фахівцям в даній галузі, які продукують амплікони, що ідентифікують ДНК події MON 87427, входять в об'єм даної галузі. SEQ ID NO: 11 і SEQ ID NO: 12 або SEQ ID NO: 17 і SEQ ID NO: 18, кожні є прикладом пари молекул ДНК (пари праймерів), що складаються з першої молекули ДНК і другої молекули ДНК, відмінної від першої молекули ДНК, причому вказані кожна перша і друга молекули ДНК містять молекулу нуклеїнової кислоти з достатньою довжиною безперервної нуклеотидної послідовності з SEQ ID NO: 10 для функціонування як ДНК-праймери при спільному використанні в реакції ампліфікації з ДНК, отриманої з події MON 87427, щоб отримати діагностичний амплікон для 25 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК MON 87427 в зразку. Ці праймери можна використовувати в інших способах на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для детекції події. Приклад 4: використання події MON 87427 для продукції гібридного насіння У наступному прикладі описано як можна використовувати MON 87427 для схрещування маїсу, включаючи використання способів, описаних в патентній публікації США № 20090165166 і/або патенті США № 7314970. При отриманні гібридного насіння рослини маїсу, що містять MON 87427, висаджують на місцевості, такій як відкрите поле. Інші батьківські рослини маїсу можуть бути присутніми (або можуть не бути присутніми) в тій же місцевості. Для контролю бур'янів в ході отримання насіння і на промислових полях можна застосовувати гліфосат на рослинах маїсу, що містять MON 87427, на вегетативних стадіях, як указано на товарних етикетках до агротехнічному продукту Roundup®, в таких же кількостях, як ті, що використовуються для подій Roundup Ready® NK603 і MON 88017 маїсу. Для продукції гібридного насіння дві обробки гліфосату, починаючи безпосередньо перед стадіями і протягом стадій розвитку волоті (приблизно стадії вегетативного росту маїсу в діапазоні від V8 до V13), застосовували у рослин MON 87427 для отримання чоловічого стерильного фенотипу за допомогою тканино-вибіркової стійкості до гліфосату. У системі продукції гібридного насіння маїсу рослини MON 87427 після застосування гліфосату під час розвитку віночки будуть мати чоловічу стерильність і, тому, будуть легко запилюватися пилком від інших рослин-донорів пилка (чоловічих), даючи в результаті живе гібридне насіння маїсу, яке несе ген тканино-вибіркової стійкості до гліфосату. Рослини-донори пилка можуть бути присутніми, а можуть і не бути присутніми, в тій же місцевості. Запилення можна здійснити будь-якими засобами, відомими в даній галузі, включаючи розміщення рослин на близькій відстані або ручне запилення. Тільки обробки гліфосатом, проведені в точний час, починаючи безпосередньо перед стадіями і/або протягом стадій розвитку волоті (приблизно стадії вегетативного росту маїсу в діапазоні від V8 до V13) будуть давати чоловічий стерильний фенотип за допомогою тканино-вибіркової стійкості до гліфосату у MON 87427. Гліфосат є системним гербіцидом, який легко переміщується по флоемі у рослин. Як тільки гліфосат виявляється у флоемі, він переміщується в області з високою меристемною активністю, слідуючи типовому розподілу джерел і стоків. Розвиток пилка у рослин маїсу займає приблизно чотири тижні. Ранні стадії росту волоті починаються приблизно на вегетативній стадії V9 маїсу, тому, обробка гліфосатом, проведена приблизно на цій стадії і в цей час дозволяє максимальне переміщення гліфосату в чоловічі репродуктивні тканини. Обробки гліфосатом, проведені протягом ранніх вегетативних стадій відповідно до часу застосування, вказаного на товарній етикетці існуючого агротехнічного продукту Roundup® для контролю бур'янів, не впливають на продукцію пилка рослинами MON 87427, оскільки чутливі чоловічі репродуктивні тканини не розвиваються активно в цей час. В умовах обробки гліфосатом можна внести модифікації, які відомі фахівцям в галузі застосування гербіцидів, і входять в об'єм винаходу. MON 87427 при схрещуванні з іншою стійкою до гліфосату подією маїсу, такою як подія NK603 маїсу (патент США № 6825400), для отримання гібридного насіння не показують втрату врожайності в порівнянні з врожайністю стандартного гібрида NK603 (див. фіг. 2). Поле гібридних рослин маїсу обробляли двома послідовними оббризкуваннями гліфосатом в кількості 2,25 фунтів a. о./акр, кожне з яких застосовували для контролю бур'янів, і не спостерігалося ніякої різниці в пошкодженні або чоловічої фертильності між різними гібридами події MON 87427 і гібридом NK603. Це ілюструє те, що гібридні рослини F1, отримані в результаті схрещування події MON 87427, є повністю стійкими до гліфосату при її використанні для контролю бур'янів. Приклад 5: вимірювання стадій розвитку волоті Стадії розвитку волоті проілюстровані на фіг. 3, з приблизними розмірами в міліметрах, показаних між дужками. На фігурі Vg являє собою меристему на вегетативній стадії; T0 є переходом від вегетативної до репродуктивної стадії; Т1 являє собою видиму репродуктивну точку росту (0,9 мм); Т2 являє собою видимі бічні примордії (1,8 мм); Т3 являє собою видимі примордії колосків (4,1 мм); Т4 являє собою подовження центральної осі і бічної осі (12,9 мм); Т5 являє собою початок диференціювання пильовиків (41,0 мм); Т6 являє собою початок диференціювання пилка (175 мм); і Т7 являє собою розкриття пильовиків і виділення пилка (285,0 мм). Стадію розвитку волоті для даної рослини вимірювали, досліджуючи віночок на різних стадіях дозрівання. Використовуючи скальпель і маленький пінцет під препаративним мікроскопом, меристему волоті відсікали від листя, що розвивається. Потім меристему надрізали скальпелем в її основі і оцінювали відповідно до стадій розвитку волоті (показаними на фіг. 3) під мікроскопом. Приклад 6: стадії вегетативного розвитку (V-стадія) відносно стадій розвитку волоті У цьому прикладі продемонстровано, що суха вага волоті, довжина волоті і стадія розвитку 26 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 волоті значно варіюють по генотипах при вимірюванні відносно вегетативних стадій рослини і вегетативного росту рослини. Було висаджено десять генотипів: інбредні лінії LH198, LH287, O1DKD2, 19HGZI, 17IDI6 і гібриди DKC 44-46, DKC 47-10, DKC 52-40, DKC 58-80, DKC 6381. Гібриди були вибрані таким чином, щоб вони представляли генотипи, що стосуються різних варіантів розвитку. Дослідження проводили в містах Farmer City (IL), Kearney (NE) і Williamsburg (IA). Десять генотипів висаджували з використанням конусної сівалки і 2 проріджували до кінцевої щільності насаджень 38000 рослин на акр (4047 м ). Довжина ділянки становила 20 футів (6 м) з проміжками в 3 фути (0,9 м) через 4 ряди, для того, щоб гарантувати достатнє число рослин для всіх обробок і знизити граничні ефекти. Дані збирали для реєстрації спостережень як вегетативного розвитку рослин, так і розвитку волоті, відносно стадій розвитку волоті. Явні відмінності в розвитку волоті спостерігалися по генотипах для ідентичних відповідних вегетативних стадій (V-стадій). Наприклад, відмінності в розмірі волоті між генотипами були очевидні для кожної V-стадії. Середня довжина волоті на стадії V8 становила 7 мм для LH198, 40,2 мм для LH287 і 47,8 мм для DKC44-46 (фіг. 4). Цей діапазон в довжині волоті на стадії V8 являє собою 7-кратну різницю між генотипами. На стадії V10 середня довжина волоті для цих трьох генотипів відповідно становила 70,1 мм, 148,2 мм і 277,3 мм (фіг. 4). Це давало практично 4-кратну різницю між генотипами. Генетична варіабельність в рості волоті відносно V-стадій також очевидна при дослідженні накопичення сухої ваги волотей. У додатковому дослідженні використовували сімдесят дві інбредних лінії для обхвату широкого діапазону стиглості. Ці інбредні лінії були згруповані в 6 груп стиглості для спрощення процесу препарування (таблиця 2). Були вибрані інбредні лінії без характерних ознак для того, щоб уникнути складності проведення препарування волотей на контрольованих полях. Цей експеримент відображає дані, зібрані на чотирьох різних місцеположеннях полів: Williamsburg (IA), Waterman (IL), Farmer city (IL) і Constantine (MI). Рослини вирощували на чотирирядних ділянках довжиною 20 футів (6 м). Цільова кінцева популяція становила 38000 рослин на акр 2 (4047 м ). Підрахунок кінцевих насаджень документували на стадії V3. Позначали п'ятий і десятий листки трьох репрезентативних рослин на ділянку для того, щоб відстежувати V-стадії; всі листки підраховували, включаючи колеоптилі. Три репрезентативні рослини з кожної групи відбирали як зразки на 60, 70 і 80 % середніх градусо-одиниць росту для цвітіння (що визначається як приблизно половина волотей в групі виділяють пилок, що представляється як Р50), і проводили препарування волотей, як описано раніше. Таблиця 2 Група стиглості Середні GDU для Р50 % Перше препарування Друге препарування Третє препарування Група 1 1200 720 840 960 Група 2 Група 3 Група 4 Група 5 Група 6 1280 1330 1370 1420 1460 768 798 822 852 876 896 931 959 994 1022 1024 1064 1096 1136 1168 35 40 45 50 Рослини вибирали з середніх рядів, щоб уникнути рослин з граничних рядів. У момент першого відбирання зразків, рослини на відповідній стадії розвитку були помічені для використання для другого і третього відбирання зразків. Дати кожного препарування разом з Vстадією на момент відбирання зразків документували. Стадію розвитку волоті ідентифікували по Відносній шкалі розвитку, описаній вище. Ділянки продовжували моніторить протягом цвітіння і реєстрували дату Р50. Вегетативна стадія варіювала серед інбредних ліній відносно стадій розвитку волоті. Наприклад, V-стадія для Т5 (початок диференціювання пильовиків) варіювала в діапазоні більше ніж 6,5 листків серед інбредних ліній, які на цей момент мали від 7 до 14 листків. Це становило приблизно 64 % від загального середнього значення 10,3 листя для досягнення даної стадії. Приклад 7: середні GDU відносно стадій розвитку волоті і квіток Цей приклад демонструє, що середні GDU, необхідні для досягнення даної стадії розвитку волоті або стадії розвитку квіток можуть значно варіювати серед генотипів, і що GDU, тому, не є достовірним засобом прогнозування розвитку волоті. Дані були отримані з ділянок на полі і інбредних рослин, описаному вище. Проводили моніторинг температури кожну годину від початку саджання і до цвітіння, використовуючи метеорологічні станції Onset, і дані використовували для обчислення денних кумулятивних GDU, слідуючи традиційному способу (тобто усередненню денних максимальної і мінімальної температур). Дані препарування зразків, 27 UA 115762 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вказуючі на стадію розвитку волоті, відкладали відносно вимог GDU. Звичайно очікується, що інбредні лінії, у яких розвивається більше число листків, мають вищі вимоги GDU для досягнення певної стадії розвитку волоті. Однак описана вище варіабельність, що спостерігається в V-стадіях для Т5, не пояснює всю варіабельність, що спостерігається в GDU для Т5. Це дозволяє передбачити, що філохрон, який являє собою час між розгортанням двох наступних листків, може варіювати між інбредними лініями. Результати цього дослідження показали, що GDU для досягнення стадії Т5 варіювали більше ніж на 400 теплових або градусоодиниць росту серед інбредних ліній; тобто розкид становив приблизно 40 % від загального середнього. Спостерігалася сильна кореляція між вимогами GDU для Р50 і даною стадією розвитку волоті серед інбредних сортів. Використовуючи дані від польових ділянок і інбредних рослин, реєстрували середні вимоги GDU для Р50 серед інбредних рослин і порівнювали з даними стадіями розвитку волоті. Вимоги GDU для Р50 варіювали від 1283 до 1645 одиниць, від інбредної лінії найшвидшої стиглості до інбредної лінії найпізнішої стиглості; тобто різниця в GDU становила трохи більше 360 одиниць. Було знайдено, що ця різниця корелює з різницею в середніх вимогах GDU для стадії Т5 в межах інбредних ліній (фіг. 5). Приклад 8: конструювання Відносної шкали розвитку У цьому прикладі продемонстровано конструювання стандартизованої шкали для моніторингу і/або попередження розвитку волоті. Ця Відносна шкала розвитку успішно стандартизує стадії розвитку волоті по інбредних лініях. Беручи до уваги сильну кореляцію між вимогами GDU для досягнення Р50 на даній стадії розвитку волоті серед інбредних сортів, описану вище, була створена Відносна шкала розвитку. Вона була обчислена шляхом виразу росту волоті для кожного генотипа відносно температурного часу для виділення пилка, як зазначено нижче: Відносна шкала розвитку = (GDU для Tn/GDU для Px) Використовували дані від польових ділянок і інбредних рослин, описані вище. Величину GDU на даній стадії розвитку волоті (GDU для Tn) ділили на число GDU, яке, як відомо, потрібно для досягнення конкретної стадії виділення пилка (GDU для Px), яка в цьому випадку була Р50 для деякого генотипа. Це погодило відмінності в стадії розвитку волоті по генотипах. Наприклад, вимоги GDU для кожної Т5 були досить постійними на Відносній шкалі розвитку для всіх інбредних ліній і варіювали тільки від 69 до 75 % GDU, необхідних для P50. Варіабельність в лініях регресії вимог GDU різних генотипів відносно стадії розвитку волоті в порівнянні з більш узгодженими лініями регресії тих же генотипів з використанням стандартизованої Т-шкали використовували для оцінки стандартизації шкали незалежно від групи стиглості (фіг. 7). Приклад 9: прогнозування оптимального часу для модулюючої розвиток обробки У цьому прикладі продемонстроване застосування Відносної шкали розвитку для визначення оптимального часу для схеми обприскування хімічним агентом для того, щоб досягнути повної стерильності волотей маїсу. У цьому прикладі хімічним агентом був гербіцид гліфосат Roundup®, що використовується в комбінації з рослинами маїсу MON 87427 в системі гібридизації Roundup® (RHS). Оптимальний час обприскування був узгоджений з фактичною стадією розвитку волоті, повна стерильність волотей маїсу досягалася в результаті тільки однієї ефективної дози Roundup®. Тридцять дві інбредні вихідні лінії, що містять подію MON 87427, були відібрані для дослідження і згруповані в дві групи стиглості. Інбредні рослини висаджували рядами по 20 футів з проміжками по троє фута. Відстань між рослинами в ряду становила 30 дюймів. Ряди висаджували таким чином, щоб були чотири ряди жіночих "тестованих" рослин, за якими йшли два ряди чоловічих запилюючих рослин. Для даного дослідження відбирали трансгенні події, які мали стійкість вегетативних і жіночих репродуктивних тканин до гліфосату, але не мали стійкості до гліфосату у чоловічих репродуктивних тканин (тобто, тканиновибіркову стійкість до гліфосату). Чоловічі запилюючі рослини також мали стійкість чоловічих репродуктивних тканин до гліфосату, в той час як жіночі рослини-реципієнти були чутливі до пилка чоловічих рослин після обробки гліфосатом. Обробку обприскуванням ділили на блоки і розбивали на дві підгрупи виходячи з групи стиглості інбредної лінії. Відразу після кожного обприскування відбирали три репрезентативні рослини з кожної ділянки і препарували на полі. Записували довжину волоті, стадію розвитку волоті, дату і GDU в момент обприскування. Обробки обприскуванням (SS1) Roundup PowerMAX™ з об'ємом води 15 галонів/акр застосовували однократно на групі стиглості, що відповідає кожній обробці (Trt), з використанням обприскувача з високим кліренсом. Обробки обприскуванням для індукції стерильності застосовували в діапазоні від 50 % до 80 % GDU, необхідних для досягнення Р50 (усередненої в межах групи стиглості інбредних ліній), як показано в таблиці 3, в якій WC=«контроль бур'янів"; Trt 1 SS1=50 % GDU 28