Методики використання пор

1. Спосіб ідентифікації окремого нуклеотиду, що включає в себе: (a) контактування нуклеотиду з трансмембранною білковою порою, що забезпечує взаємодію нуклеотиду з порою; та (b) вимірювання струму, що проходить крізь пору під час взаємодії, та відповідне ідентифікування нуклеотиду. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що взаємодія містить у собі оборотне зв'язування нуклеотиду з каналом пори. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що пора являє собою (а) -гемолізин, сформований із семи ідентичних підгруп, як показано у SEQ ID NO: 2; або (b) його варіант, у якому одна або більше із семи підгруп має принаймні 50 % гомології із SEQ ID NO: 2, що ґрунтується на амінокислотній ідентичності відносно усієї послідовності, та зберігає активність пори. 4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що одна або більше із семи підгруп є M113R. 5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що пора містить молекулярний адаптер, що полегшує взаємодію нуклеотиду з порою. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що молекулярний адаптер являє собою гептакіс-6-амін-циклодекстрин (am7--CD). 7. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що окремий нуклеотид являє собою монофосфат, дифосфат або трифосфат. UA (21) a200806147 (22) 15.11.2006 (24) 11.07.2011 (86) PCT/GB2006/004265, 15.11.2006 (31) 0523282.2 (32) 15.11.2005 (33) GB (46) 11.07.2011, Бюл.№ 13, 2011 р. (72) БЕЙЛІ ХАГАН, GB, АСТ'Є ЯНН, FR/GB, БРАХА ОРІТ, US (73) ІСІС ІННОВЕЙШН ЛІМІТЕД, GB (56) WO0028312 A, 18.05.2000. WO0142782 A,14.06.2001. WO9905167 A, 04.02.99. AKESON M. ET AL.: "MICROSECOND TIME-SCALE DISCRIMINATION AMONG POLYCYTIDYLIC ACID, POLYADENYLIC ACID, AND POLYURIDYLIC ACID AS HOMOPOLYMERS OR AS SEGMENTS WITHIN SINGLE RNA MOLECULES" BIOPHYSICAL JOURNAL, NEW YORK, US, US, vol. 77, no. 6, December 1999 (1999-12), pages 3227-3233. KASIANOWICZ J.J. ET AL.: "Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 93, November 1996 (1996-11), pages 13770-13773. LI J. ET AL.: "DNA MOLECULES AND CONFIGURATIONS IN A SOLID-STATE NANOPORE MICROSCOPE" NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDON, GB, vol. 2, no. 9, September 2003 (2003-09), pages 611-615. MARZIALI A. ET AL.: "New DNA sequencing methods." ANNUAL REVIEW OF BIOMEDICAL ENGINEERING 2001, vol. 3, 2001, pages 195-223. GU L.-Q. ET AL.: "Stochastic sensing of organic analytes by a pore-forming protein containing a molecular adapter" NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDON, GB, vol. 398, no. 6729, 22 April 1999 (1999-04-22), pages 686-690. MELLER A. ET AL.: "Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 97, no. 3, 1 February 2000 (2000-0201), pages 1079-1084. 2 (19) 1 3 95087 4 8. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняється тим, що окремий нуклеотид являє собою рибонуклеотид або дезоксирибонуклеотид. 9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що він додатково містить перед етапом (а) ферментативне відщеплення послідовності рибонуклеїнової кислоти (РНК) для одержання окремого нуклеотиду. 10. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що він додатково містить перед етапом (а) ферментативне відщеплення послідовності дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) для одержання окремого нуклеотиду. 11. Спосіб за п. 9 або 10, який відрізняється тим, що більше ніж один з окремих нуклеотидів послідовності РНК або ДНК контактують з порою послідовним способом, так щоб можна було визначити усю або частину послідовності. 12. Спосіб секвенування цільової послідовності нуклеїнової кислоти, який включає: (a) ферментативне відщеплення окремого нуклеотиду від одного кінця цільової послідовності із застосуванням процесивної екзонуклеази; (b) контактування нуклеотиду з трансмембранною білковою порою, що забезпечує взаємодію нуклеотиду з порою; (c) вимірювання струму, що проходить крізь пору під час взаємодії, та відповідне ідентифікування нуклеотиду; та (d) повторювання етапів (а) - (с) на тому самому кінці послідовності нуклеїнової кислоти та відповідне визначення послідовності нуклеїнової кислоти. 13. Набір для секвенування нуклеїнової кислоти, що містить: циклодекстрин; процесивну екзонуклеазу та трансмембранну білкову пору. Винахід відноситься до ідентифікації окремих нуклеотидів і інших фосфат-утримуючих сполук із використанням трансмембранних пор. Зокрема, винахід відноситься до секвенірування нуклеїнових кислот з використанням трансмембранних пор. Для секвенірування ДНК відповідно до методики, що застосовується в даний час, необхідні дорогі реактиви, такі як флуоресцентно мічені дідезоксінуклеотидтрифосфати, дезоксінуклеотидтрифосфати, праймери й полімераза. Ця методика вимагає використання складного устаткування, що обслуговується кваліфікованим лаборантом. Крім того, ця методика не дозволяє секвенірувати послідовності довші ніж 1000 нуклеотидів. Були розглянуті альтернативні методики секвенірування з метою зниження витрат, спрощення методу, а також виносу процесу секвенірування за межі лабораторії, зокрема, методика подовження циклу, полімеразного зчитування, секвенірування за допомогою екзонуклеаз і чип-гібридизації (Braslavsky, L, В. Herbert, et al. (2003), PNAS 100(7):3960-3964). Вичерпний огляд перерахованих методик див. Marziali, A. and M. Akeson (2001), Ann. Rev. Biomed. Eng. 3:195-223. Один можливий метод секвенірування ДНК полягає в протяганні однониткової молекули ДНК через нанопору. Визначення послідовності ДНК за цією методикою відбувається за рахунок вимірювання коливань іонного струму через пору в міру просування молекули ДНК (Kasianowicz, J. J., Е. Brandin, et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. 93:13770-13773). Другий потенційно успішний підхід до секвенірування ДНК - секвенірування за допомогою екзонуклеаз (Chan, E. Y. (2005), Mutat. Res. 573:13-40). Ця методика полягає в послідовному відщіпленні нуклеотидів від молекули ДНК і ідентифікації кожного вивільненого нуклеотида (Dapprich, J. (1999), Cvtomet. 36:163-168; and Matsuura, S.-L, J. Komatsu, et al. (2001), Nuc. Ac. Res. 29(16): e79). Однак, для цих методів необхідна хімічна модифікація ДНК до ферментативного розщеплення або хімічна модифікація нуклеотидів після їхнього відщеплення від молекули ДНК за допомогою екзонуклеази. Удосконалення методу секвенірування за допомогою екзонуклеази в даний час затримується через складності ідентифікації нуклеотидів на молекулярному рівні відповідно до їхнього ферментативного відщеплення від молекули ДНК. Спроби ідентифікації нуклеотидів за допомогою флуоресцентної мітки на сьогоднішній день не призвели до повного успіху. При стохастичному розпізнаванні виміряється іонний струм через пору розміром кілька нанометрів в ізолюючій бішаровій ліпідній мембрані. При контакті ізолюючої сполуки із сайтом зв'язування усередині пори величина іонного струму через пору змінюється, і цю зміну можна детектувати (Braha, О., В. Walker, et al. (1997), Chem. & Biol. 4:497-505; and Bayley, H. and P. S. Cremer (2001), Nature 413:226-230). Ступінь і тривалість блокування струму при зв'язуванні аналізуючої молекули з порою дозволяє визначати природу аналізуючої речовини. Частота зв'язування дозволяє визначати концентрацію аналізуючої речовини. У внутрішній структурі пори можуть бути розміщені різні сайти зв'язування, створені шляхом білкових мутацій або хімічних модифікацій, а також за допомогою молекулярних адаптерів і переносників (Gu, L.-Q., О. Braha, et al. (1999), Nature 398:686690; and Braha, O., J. Webb, et al. (2005), Chem. Phvs. Chem. 6:889-892). Була показана можливість ідентифікувати окремі нуклеотиди на молекулярному рівні, вимірюючи амплітуду струму при їхній взаємодії із трансмембранною порою. Таким чином, стохастичне розпізнавання може застосовуватися для ідентифікації окремих нуклеотидів і для секвенірування нуклеїнових кислот із застосуванням екзонуклеази. Відповідно до вищесказаного, у даному винаході описується метод ідентифікації окремих нуклетотидів, що включає в себе: 5 a) контакт нуклеотиду із трансмембранною білковою порою, що забезпечує взаємодію нуклеотиду з порою, а також b) вимір струму, що проходить через пору під час взаємодії нуклеотиду з порою, і ідентифікація нуклеотиду за допомогою аналізу вимірювання. У винаході далі описується: - метод секвенірування нуклеїнових кислот, що включає в себе: а) відщеплення одиночного нуклеотида від кінця послідовності ДНК за допомогою процесивної екзонуклеази; b) контакт нуклеотиду із трансмембранною білковою порою, що забезпечує взаємодію нуклеотиду з порою; c) вимір струму, що проходить через пору під час взаємодії нуклеотиду з порою й ідентифікація нуклеотиду за допомогою аналізу вимірювання; d) повтор кроків а-с для того самого кінця молекули нуклеїнової кислоти, таким чином, забезпечуючи послідовне зчитування послідовності нуклеїнової кислоти; і також - набір реактивів для секвенірування нуклеїнових кислот, що включає в себе: - циклодекстрин - процесивну екзонуклеазу. Метод секвенірування, описаний у даному винаході, є швидким і простим методом секвенірування ДНК на молекулярному рівні. Також цей метод секвенірування порівняно дешевий, оскільки не вимагає використання дорогих реактивів, таких як флуорофори. На фіг. 1 представлена структура мутанта (M113R)7 -гемолізина (-HL) і гептакіс-6-аміно-циклодекстрина (am7-CD). А - сагіттальний розріз через молекулу -гемолізина. Стрілкою відзначене положення амінокислоти 113. В - просторова структура молекули am7-CD. C - модель можливої взаємодії am7-CD і -гемолізина (M113R)7. На фіг.2А представлено розпізнавання dCMP. A - запис струму через одиночний мутант (M113R)7, що знаходиться у фосфоліпідному бішарі, при напрузі +130 мВ. L1- рівень струму через вільну білкову нанопору. В - у присутності 40 мкМ am7-CD у транс-комірці. L2 - рівень струму,що спостерігається при короткочасному зв'язуванні am7-CD усередині нанопори. С - після додавання 5 мкМ dCMP у цис-комірку. L3 - рівень струму, що спостерігається при зв'язуванні dCMP з комплексом (M113R)7/am7-CD. На фіг.2В представлена модель взаємодії гемолізинової пори з гептакіс-6-аміно-циклодекстрином (am7-CD) і dCMP. A - модель гептамірної -гемолізинової пори, у якій Met 113 був замінений на Arg. Модель am7-CD у поперечному розрізі, виконана в програмі ChemDraw Ultra, поміщена вручну на відстані ван-дер-Ваальса від бічних ланцюгів Arg, що перешкоджають проходженню циклодекстрина через пору при входженні із транс-боку. Коли am7-CD знаходиться усередині пори, два кільця позитивних зарядів, одне кільце із семи первинних аміногруп циклодекстрина й друге кільце із семи бічних ланцюгів аргініну, пе 95087 6 ребувають на відстані ~10Å. Було показано, що аміноциклодекстрини зв'язують фосфатну групу нуклеозидмонофосфатів шляхом іонних взаємодій із протонованими аміногрупами. Можливо, стабільність таких комплексів підвищується за рахунок р-катіонних взаємодій нуклеотидних основ з бічними ланцюгами Arg. Молекула dCMP розташовується так, що фосфатна група взаємодіє із протонованими амінами am7-CD, а цитозинове кільце взаємодіє з гуанідиновими групами бічних ланцюгів Arg. В - запис струму через одиночний мутант (M113R)7 при напрузі +130 мВ. L1 - рівень струму через вільну білкову нанопору, модель якої наведена праворуч. С - запис струму в присутності 40 мкМ am7-CD у транс-комірку. L2 - рівень струму, що спостерігається при зв'язуванні am7-CD усередині нанопори. С - запис струму після додавання 5 мкМ dCMP у цис-комірку. L3 - рівень струму, що спостерігається при зв'язуванні dCMP з комплексом (M113R)7/am7-CD. На фіг.3 наведені амплітуди струму різних дезоксинуклеотидмонофосфатів (dXMP). Запис струму через одиночний мутант (M113R)7, що знаходиться у фосфоліпідному бішарі, при напрузі +130 мВ у присутності 40 мкМ am7-CD у транскомірку. А - після додавання 5 мкм dCMP у цискомірку. Праворуч наведені відповідні гістограми розподілу подій і структури dGMP, dTMP (В), dAMP (C) і dCMP (D). На фіг.4 наведені записи струму циклодекстрина. Запис струму через одиночний мутант (M113R)7, що знаходиться в ліпідному бішарі, у присутності 40 мкМ am7-CD в trans chamber при напрузі +130 мВ. L1 і L1’ - два рівня струму через вільну нанопору, L2 і L2’ - два рівня струму, що спостерігаються при зв'язуванні am7-CD з (M113R)7. На врізанні(врезке) наведена амплітудна гістограма запису струму; піки відповідають рівням струму L1, L1’, L2 і L2’. На фіг.5 наведений аналіз одиничних подій. А - гістограма аналізу одиничної події рівня струму L3 всіх чотирьох dXMP, що перебувають у тому самому розчині. В - гістограма аналізу одиничної події рівня L3, що виникає винятково від рівня L2. У цис-комірці знаходяться dGMP, dAMP, dCMP у концентрації 5 мкм і dTMP у концентрації 10 мкм. На фіг.6 наведений приклад одночасного виявлення dXMP. A - запис струму через одиночний мутант (M113R)7, що знаходиться в ліпідному бішарі, при напрузі +130 мВ між Ag/ AgClелектродами. Буфер Tris-HCl 25 мМ рН 8,0 з додаванням 1М КСl. 40 мкМ am7-CD додано в транскомірку. По 5мкм dGMP, dTMP, dAMP і dCMP додано в цис-комірку. Кольорові смуги ілюструють розподіл амплітуди для кожного dXMP. На фігурі В представлена гістограма розподілу подій для запису струму, що містить 8000 випадків зв'язування. Кожний пік накладений на статистичний розподіл dXMP. На фіг.7 продемонстрований статистичний метод. Два нормальних розподіли А и В перекриваються в точці перетинання І. Інтегрована площа під нормальною кривою А за межами точки перетинання І показує ймовірність того, що популяція А буде розпізнана як популяція В. 7 Опис послідовностей SEC ID NO: 1 показує полінуклеотидну послідовність, що кодує одну субодиницю -гемолізина. SEC ID NO: 2 показує амінокислотну послідовність однієї субодиниці -гемолізина. SEC ID NO: 3 показує полінуклеотидну послідовність, що кодує одну субодиницю -гемолізина M113H. SEC ID NO: 4 показує амінокислотну послідовність однієї субодиниці -гемолізина M113H. SEC ID NO: 5 показує полінуклеотидну послідовність, що кодує одну субодиницю -гемолізина М113К. SEC ID NO: 6 показує амінокислотну послідовність однієї субодиниці -гемолізина M113K SEC ID NO: 7 показує полінуклеотидну послідовність, що кодує одну субодиницю -гемолізина M113R. SEC ID NO: 8 показує амінокислотну послідовність однієї субодиниці -гемолізина M113K SEC ID NO: 9 показує амінокислотну послідовність екзонуклеази лямбда. Це послідовність однієї із трьох ідентичних одиниць, що збираються в тример. Метод ідентифікації одиночних нуклеотидів У першому втіленні, даний винахід відноситься до методики ідентифікації одиночних нуклеотидів, що складається з контакту нуклеотида із трансмембранною білковою порою, що забезпечує взаємодію нуклеотида з порою, а також вимірювання струму, що проходить через пору під час взаємодії нуклеотида з порою й ідентифікації нуклеотида за допомогою аналізу вимірювання. Таким чином, винахід включає стохастичне розпізнавання одиночних нуклеотидів. Винахід може бути застосований для розрізнення нуклеотидів, подібних по своїй структурі, на підставі їхнього різного впливу на величину струму, що проходить через трансмембранну білкову пору. Винахід також може бути використаний з метою виявлення певного нуклеотида в досліджуваному зразку. Винахід також може бути використаний з метою вимірювання концентрації певного нуклеотида в досліджуваному зразку. У даному винаході під одиночним нуклеотидом розуміється вільний нуклеотид. Одиночним нуклеотидом називається нуклеотид, не зв'язаний з іншим полінуклеотидом нуклеотидним зв'язком. Нуклеотидний зв'язок містить у собі зв'язок однієї з фосфатних груп нуклеотида з вуглеводним залишком іншого нуклеотида. Як правило, одиночним нуклеотидом називається нуклеотид, не зв'язаний нуклеотидним зв'язком з іншим полінуклеотидним ланцюгом довжиною не менш 5, не менш 10, не менш 20, не менш 50, не менш 100, не менш 200, не менш 500, не менш 1000 або не менш 5000 нуклеотидів. Наприклад, одиночний нуклеотид може бути отриманий шляхом ферментативного відщеплення від полінуклеотидного ланцюга, наприклад, ланцюжка ДНК або РНК. У той же час, одиночний нуклеотид може бути зв'язаний або приєднаний до інших хімічних груп, таких як флуоресцентні молекули або хімічні залишки, що міс125 35 тять радіоізотопи, наприклад І або S. Нижче буде наведено більш докладний опис типів нукле 95087 8 отидів, що піддаються ідентифікації за допомогою описуваного методу. Методика може бути проведена в будь-якій відповідній мембранно-поровій системі, що включає в собі білкові трансмембранні пори, розташовані в мембрані. Як правило, методика проводиться з використанням і) штучної мембрани, що містить трансмембранну пору природного або рекомбінантного походження; іі) ізольованої мембрани природного походження, що містить трансмембранну пору рекомбінантного походження, ііі) ізольованої мембрани природного походження, що містить трансмембранну пору або iv) кліток, експресуючих трансмембранну пору природного або рекомбінантного походження. Краще проводити метод, використовуючи штучну мембрану. Крім трансмембранної пори, мембрана може містити інші трансмембранні й/або внутрішньомембрані білки й інші молекули. Як правило, методика проводиться в системі in vitro. Мембрана Мембрана утворює перешкоду на шляху іонів і нуклеотидів. В якості мембрани краще використовувати ліпідний бішар. Ліпідні бішари, що підходять для використання в методі, описаному в даному винаході, можуть бути отримані з використанням стандартних методик. Наприклад, ліпідні бішарові мембрани можуть бути отримані з використанням методу Montal і Mueller (1972). Методика, описана в даному винаході, може проводитися з використанням ліпідних бішарів, отриманих з будь-яких мембранних ліпідів, у тому числі: фосфоліпідів, гліколіпідів, холестерину і їхніх сумішей. Перерахований список не є вичерпним. Кращим матеріалом для одержання ліпідних бішарів є 1,2-дифітаноіл-sn-гліцеро-3-фосфохолін. Існують стандартні методики вбудовування порових комплексів у мембрани, у тому числі в ліпідні бішари. Наприклад, поровий комплекс може перебувати у суспендованому стані в розчині, що містить ліпідний бішар. З розчину поровий комплекс дифундує в ліпідний бішар і вбудовується шляхом зв'язування з ліпідним бішаром і придбання активної конформації. Крім того, поровий комплекс може бути вбудований у мембрану в пряму відповідно до методу, описаному в М.А. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503. Трансмембранна білкова пора Методика, що описана в даному винаході, проводиться з використанням трансмембранної білкової пори. Під трансмембранною білковою порою розуміється поліпептид, що дозволяє іонам перетікати з однієї сторони мембрани на іншу по електрохімічному градієнту. Найкраще, щоб пора дозволяла нуклеотидам перетікати з однієї сторони мембрани на іншу по електрохімічному градієнту. Як правило, пора являє собою олігомер. Найкраще, щоб пора складалася з декількох повторюваних субодиниць. Найкраще, щоб пора була пентамірною або гептамірною. Як правило, пора, являє собою порожній циліндр або канал, через який проходять іони. 9 Як правило, у порожнині або у каналі пори перебувають амінокислотні залишки, що забезпечують взаємодію пори з нуклеотидом. Як правило, для використання відповідно до методики, що описана в даному винаході, пора повинна містити один або більше позитивно заряджених амінокислотних залишків, таких як аргінін, лізин або гістидин. Найкращою є локалізація цих амінокислотних залишків неподалік від місця звуження порожнини або каналу. Як правило, ці амінокислотні залишки забезпечують зв'язування між порою й нуклеотидом шляхом взаємодії з фосфатною групою нуклеотида або р-катіонних взаємодій з основою нуклеотида. Переважно, щоб у порі було кільце позитивно заряджених амінокислотних залишків, таких як аргінін, лізин або гістидин, розташоване неподалік від місця звуження порожнини або каналу. Як правило, кожна субодиниця пори привносить один позитивно заряджений амінокислотний залишок. Підходящі пори для використання в методиці, що описана в даному винаході, включають гемолізин, порини й лейкоцидини. Наведений список не є вичерпним. Кращим варіантом пори для використання в методиці, що описана в даному винаході, є гемолізин або його мутантний різновид, гемолізинова пора складається із семи однакових субодиниць (гептамір). Послідовність однієї субодиниці наведена в SEQ ID NO: 2. Під різновидом розуміється гептамірна пора, що зберігає свою провідну спроможність, в якої одна або декілька субодиниць мають послідовність, відмінну від наведеної в SEQ ID NO: 2.1, 2, 3, 4, 5, 6 або 7 субодиниць різновиду -гемолізинової пори можуть мати послідовність, відмінну від наведеної в SEQ ID NO: 2. Сім субодиниць різновиду пори, як правило, мають ідентичну послідовність, але можуть і розрізнятися. Різновиди -гемолізина містять один або більше позитивно заряджених амінокислотних залишків, таких як аргінін, лізин або гістидин, розташованих неподалік від місця звуження порожнини або каналу. Найкраще, щоб у порі було кільце з 4, 5, 6 або краще 7 позитивно зарядженими амінокислотними залишками, такими як аргінін, лізин або гістидин, розташованими неподалік від місця звуження порожнини або каналу. Як правило, кожна субодиниця різновиду пори привносить один позитивно заряджений амінокислотний залишок. Субодиниці різновиду пори, як правило, містять позитивно заряджений амінокислотний залишок у положенні 113. В якості пор в методиці, що описана в даному винаході, найкраще використовувати а-гемолізин (М113К)7, що складається із семи субодиниць, чия послідовність наведена в SEQ ID NO: 4; також краще використовувати -гемолізин (М113Н)7, що складається із семи субодиниць, чия послідовність наведена в SEQ ID NO: 6 або краще всього використовувати -гемолізин (M113R)7, що складається із семи субодиниць, чия послідовність наведена в SEQ ID NO: 8. Різновид пори може бути природного походження експресуючий в організмі, наприклад, у 95087 10 стафілококовій бактерії. Різновиди пори також містять у собі пори штучного походження, отримані за допомогою рекомбінантних методів. Найкраще, щоб протягом всієї амінокислотної послідовності, гомологія послідовності різновиду -гемолізина й послідовності, наведеної в SEQ ID NO: 2 становила не менш, ніж 50 % амінокислотних залишків. Більш переважно, щоб напротязі всієї амінокислотної послідовності гомологія поліпептидної субодиниці пори й послідовності, наведеної в SEQ ID NO: 2, становила не менш 55 %, не менш 60 %, не менш 65 %, не менш 70 %, не менш 75 %, не менш 80 %, не менш 85 %, не менш 95 % відсотків амінокислотних залишків; найбільш краща гомологія не менш 95 %, 97 % або 99 % амінокислотних залишків. У послідовності можуть зустрічатися безперервні ділянки довжиною не менш 200 амінокислотних залишків, приміром, 230, 250, 270, 280 або більше амінокислотних залишків з високим ступенем гомології, не менш 80 %, наприклад, не менш 85 %, 90 % або 95 % ідентичних амінокислотних залишків. В амінокислотну послідовність, наведену в SEQ ID NO:2, можуть бути внесені амінокислотні заміни, наприклад, до 1, 2, 3, 4, 5, 10 або 20 замін. Консервативні амінокислотні заміни можуть здійснюватися у відповідності з наступною таблицею. Амінокислоти, що перебувають в одній групі другого стовпця, і переважно в одному рядку третього стовпця, є взаємозамінними: Неполярні Неароматичні Полярні незаряджені Полярні заряджені Ароматичні GAP ILV CSTM NQ DE HKR HFWY Крім того, замість амінокислотних замін або на додаток до них один або декілька амінокислотних залишків можуть бути делетовані. Можуть бути делетовані до 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 або 30 або більше амінокислотних залишків. Різновиди пор можуть включати субодиниці, синтезовані на основі фрагментів послідовності SEQ ID NO:2. Такі фрагменти зберігають здатність до утворення пор. Фрагменти можуть бути довжиною не менш 50, 100, 200 або 250 амінокислотних залишків. Такі фрагменти можуть використовуватися для створення химерних пор. Переважно, щоб фрагменти містили домен, що формує пору, наведений у послідовності SEQ ID NO:2. Різновиди пор включають химерні білкові пори, що містять фрагменти або частини послідовності SEQ ID NO:2. Химерні білкові пори утворені з білків, що містять фрагменти послідовності SEQ ID NO:2. Частина білка, що утворює структуру пори або каналу, як правило, утворена фрагментом або частиною послідовності SEQ ID NO:2. Крім того, до поліпептидів, що описані вище, можуть бути додані один або кілька амінокислотних залишків. Амінокислотні залишки можуть бути додані до N- або С-кінця амінокислотної послідовності, наведеної в SEQ ID NO: 2, її різновидів або 11 фрагментів. Доданий фрагмент може бути коротким, наприклад, довжиною 1-10 амінокислотних залишків. Доданий фрагмент також може бути довгим, приміром, 50-100 амінокислотних залишків. Відповідно до винаходу, амінокислотна послідовність може бути злита з послідовністю білкапереносника. Для вичислення гомології можуть застосовуватися стандартні методики. Наприклад, до складу пакета програмного забезпечення UWGCG входить програма BESTFIT, що підходить для розрахунків гомології з використанням заданих за умовчанням параметрів. Можна також використовувати алгоритми PILEUP і BLAST з параметрами, заданими за умовчанням, для вичислення гомології й вирівнювання послідовностей (ідентифікація еквівалентних амінокислотних залишків і відповідних ділянок послідовності). Цей метод описаний в Altschul S. F. (1993) J Мої Evol 36:290-300; Altschul, S.F et al (1990) J Мої Biol 215:403-10. Програмне забезпечення для аналізу послідовності по алгоритму BLAST знаходиться у відкритому доступі на веб-сайті Національного центра біотехнологічної інформації (http://www.ncbi.nln.nih.gov/). Спочатку алгоритм відшукує ділянки послідовності з високим ступенем гомології (high scoring sequence pair, HSP). Для цього алгоритм знаходить короткі ділянки послідовності («слова») заданої довжини W у введеній користувачем послідовності, збіг яких з ділянками послідовності тої ж довжини, що міститься в базі даних, повне або перевершує позитивне граничне значення критерію Т. Т -поріг гомології близько прилеглих слів (neighborhood words score threshold) (Altschul et al., там же). Ці вихідні збіги слів служать відправними точками для пошуку більш довгих гомологічних послідовностей, що містять ці слова. Області відповідності потім розширюються в обидва боки доти, поки показник загального вирівнювання збільшується. Розширення області збігу слів припиняється в наступних випадках: показник загального вирівнювання зменшується на величину X від максимально досягнутого; показник вирівнювання падає до нуля або нижче за рахунок локального негативного вирівнювання; досягнуто кінця послідовності. Параметри W, Т і X визначають чутливість і швидкість вирівнювання. За умовчанням програма BLAST приймає значення довжини слів (W), рівне 11, матриця замін BIOSUM62 (див. Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Set USA 89:10915-10919) вирівнювання В=50, очікування E=10, M=5, N=4, і порівняння по обох нитям. Алгоритм BLAST проводить статистичний аналіз подібності двох послідовностей, наприклад див. Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Один параметр подібності, що розраховується алгоритмом BLAST - найменша сумарна імовірність P(N) - індикатор імовірності випадкового збігу двох амінокислотних послідовностей. Наприклад, послідовність визнається подібною з іншою послідовністю, якщо найменша сумарна ймовірність при порівнянні першої послідовності із другою менше 1, переважно менше 0,1, 95087 12 більш переважно менше 0,01 і найбільше переважно менше 0,001. Пори, що використовуються в методиці, описаній в даному винаході, можуть бути модифіковані. Наприклад, можуть бути додані гістидинові залишки для полегшення ідентифікації або очищення, або може бути додана сигнальна послідовність для секреції пор із кліток, у випадку якщо поліпептид не несе такої сигнальної послідовності. Бажано, щоб поліпептиди перебували у відповідній формі для прикріплення до твердої основи. Наприклад, пора може бути прикріплена до твердої основи для вбудовування пори в мембрану. Пора може бути позначена проявляючою міткою. Під проявляючою міткою може розумітися будь-яка мітка, що дозволяє виявити пору, як то: флуоресцентні молекули, радіоізотопи, наприклад' 125 35 I, S, ензими, антитіла, полінуклеотиди, лінкери, наприклад біотин. Наведений список міток не є вичерпним. Пори можуть бути виділені з організмів, продукуючих пори, наприклад, золотистий стафілокок (Staphilococcus aureus) або отримані штучними шляхом, наприклад, за допомогою рекомбінантних методів. Наприклад, пора може бути синтезована методом трансляції й транскрипції in vitro. В амінокислотну послідовність пори можуть бути внесені зміни у вигляді нестандартних амінокислот для підвищення стабільності сполуки. У випадку одержання пори штучним шляхом ці модифікації амінокислотної послідовності можуть бути здійснені на етапі синтезу пори. Також пора може бути модифікована після одержання за допомогою синтетичних або рекомбінантних методів. Пора також може бути отримана з використанням D-амінокислот. У таких випадках амінокислоти виявляються зв'язаними у зворотній послідовності від С-кінця до N-кінця. Це є звичайною практикою при одержанні такого роду пептидів або білків. Відомо кілька стандартних модифікацій бічних ланцюгів, які можуть застосовуватися при одержанні пори. Серед таких модифікацій: модифікації амінокислотних залишків шляхом відновленого алкілірування за допомогою реакції з альдегідом і відновлення за допомогою NaBH4, амідування шляхом взаємодії з метілацетімідатом або ацилірування за допомогою оцтового ангідриду. Рекомбінантна трансмембранна пора може бути отримана з використанням стандартних методик. Нуклеотидні послідовності кодуючі білки пори, можуть бути виділені й репліцирувані за допомогою стандартних методик. Нуклеотидні послідовності кодуючі білки пори, можуть бути експресовані в бактеріальній клітці-хазяїні за допомогою стандартних методик. Пора може бути поміщена в клітку шляхом експресії поліпептиду in situ з рекомбінантного вектора експресії. Краще, щоб вектор експресії містив індуцибельний промотор для контролю рівня експресії поліпептиду. Нуклеотидні послідовності кодуючі пору, можуть бути виділені й репліковані з використанням стандартних методик. Хромосомна ДНК може бути 13 виділена з організму, що продукує пори, наприклад, Staphilococcus aureus. Ген, кодуючий пору може бути ампліфікований за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) зі спеціально підібраними праймерами. Потім ампліфікована послідовність може бути вбудована в рекомбінантний реплікований вектор, наприклад, у клонуючий вектор. Такий вектор може бути використаний для реплікації нуклеїнової кислоти у відповідній клітціхазяїні. Таким чином, можна створити нуклеїнові кислоти кодуючі пору, шляхом введення полінуклеотида в реплікуючий вектор, введення вектора у відповідну клітку-хазяїна й культивування клітокхазяїв в умовах, сприятливих для реплікації вектора. Потім вектор може бути виділений із кліток. Відомі лінії кліток-хазяїв, що підходять для клонування полінуклеотидів кодуючих пору, будуть описані нижче. Нуклеотидна послідовність, що кодує пору може бути клонована в відповідний вектор експресії. Як правило, у векторі експресії нуклеотидна послідовність, що кодує білок пори, функціонально пов'язана з регулюючою послідовністю, що забезпечує експресію кодуючої послідовності у клітціхазяїні. Такі вектори експресії можуть використовуватися для експресії пори. Термін "функціонально зв'язані" означає близьке розміщення компонентів, що забезпечує їхнє функціонування належним чином. Регулююча послідовність "функціонально зв'язана" з кодуючою послідовністю, якщо експресія останньої досягається в умовах, сумісних з регулюючою послідовністю. Множинні копії кодуючої послідовності можуть бути вставлені в той самий вектор. Потім вектор експресії може бути уведений у придатну клітку-хазяїна. Таким чином, методика, описана у винаході, може бути проведена в клітці, отриманій шляхом введення нуклеотидної послідовності, що кодує пору у реплікуючий вектор, введення вектора в придатну бактеріальну кліткухазяїна й культивування кліток-хазяїв в умовах, сприятливих для експресії нуклеотидної послідовності, що кодує пору. У той же час, рекомбінантна пора, отримана таким шляхом, може бути виділена з бактеріальної клітки-хазяїна й вбудована в іншу мембрану. В якості вектора можна використовувати, наприклад, плазміду, вірус або фаговий вектор, що містить точку початку реплікації, можливо, промотор, що регулює експресію зазначеної кодуючої нуклеотидної послідовності й можливо, регулятор промотору. Вектори можуть містити один або більше генів селективних маркерів, наприклад, ген стійкості до тетрацикліну. Промотори й інші послідовності, що регулюють експресію, можуть бути підібрані з метою їхньої найкращої відповідності й функціонування в даній клітці-хазяїні. Як правило, застосовується промотор T7, trc, lac, аrа або L. Як правило, досягається високий рівень експресії пори в клітці-хазяїні. Клітка-хазяїн, трансформована нуклеотидною послідовністю, що кодує пору, вибирається з міркувань відповідності вектора експресії клітці-хазяїнові. Як правило, вибирається бактеріальна клітка-хазяїн, переважно Escherichia coli. Всі клітки-лізогени по фагу (DE3), 95087 14 наприклад, С41 (DE3), BL21 (DE3), JM109 (DE3), В834 (DE3), TUNER, Origami і Origami В, можуть експресувати вектор, що несе промотор T7. Виділення пори з організмів, що продукують пору або з рекомбінантних систем, описаних вище, у сукупності з її очищенням шляхом рідинної білкової хроматографії дозволяє виробляти більші кількості білків пори. Для рідинної білкової хроматографії можуть бути використані стандартні системи, такі як FPLC, ACTA Bio-Cad, системи BioRad Biologic і Gilson HPLC. Відповідно до винаходу, пори природного походження або отримані в рекомбінантній системі можуть бути вбудовані в мембрану природного або штучного походження. У методиці, описаній у винаході, може використовуватися будь-який вид пор, описаний вище. Взаємодія нуклеотида з порою. Нуклеотид може контактувати з порою з будьякої сторони мембрани. Нуклеотид може входити в пору з будь-якої сторони мембрани. Найкраще, щоб нуклеотид контактував з порою з боку мембрани, з якого іони можуть входити в пору й проходити крізь пору через мембрану по електрохімічному градієнту. Найкраще, щоб нуклеотид контактував з порою з боку мембрани, з якого нуклеотид може ввійти в пору й пройти через пору на іншу сторону мембрани. Наприклад, нуклеотид контактує з торцем пори, що забезпечує в нормальних умовах попадання в канал пори іонів і дрібних молекул, таких як нуклеотиди, і їхнє проходження через пору на інший бік мембрани. Нуклеотид може контактувати з порою в будьякому місці будь-яким способом. Краще оборотне зв'язування нуклеотида з порою. Найкраще, щоб нуклеотид оборотно зв'язувався з порожниною або каналом пори. Найбільше переважно, щоб нуклеотид оборотно зв'язувався з порожниною або каналом пори в міру просування його крізь пору через мембрану. За рахунок взаємодії нуклеотида з порою значення струму, що проходить через пору, змінюється, причому характер цих змін визначається природою нуклеотида. Наприклад, певний нуклеотид може зменшувати величину струму, що проходить скрізь пору, на певну величину протягом певного періоду часу. Для визначення змін струму, що проходить через пору, характерних для кожного нуклеотида, можна поставити контрольні експерименти. Дані дослідного зразка, отримані за допомогою методики, описаної у винаході, можна потім зрівняти з даними, отриманими в контрольному експерименті з метою ідентифікації нуклеотида, що міститься в дослідному зразку або виявлення, чи міститься певний нуклеотид у дослідному зразку. По частоті змін струму через мембрану, характерних для певного нуклеотида, можна визначити концентрацію цього нуклеотида в зразку. Прилад Методика може виконуватися з використанням будь-якого приладу, що підходить для роботи з мембранно-поровою системою, у якій трансмембранна пора вбудовується в мембрану. Методика може виконуватися з використанням будь-якого приладу, що підходить для стохастичного розпі 15 знавання. Наприклад, прилад може складатися з камери, заповненої водяним розчином і бар'єра, що розділяє камеру на дві комірки. У бар'єрі є отвір, у якому формується мембрана, що містить пору. Нуклеотид може контактувати з порою при додаванні нуклеотида в камеру. Нуклеотид може бути доданий у будь-яку комірку камери. Методика, описана у винаході, містить у собі вимір величини струму, що проходить через пору, під час взаємодії нуклеотида з порою. Таким чином, прилад також містить у собі електричну схему для прикладання й вимірювання електричного сигналу через мембрану й пору. Методика може виконуватися з використанням фіксації потенціалу (patch clamp) або напруги (voltage clamp). Краще використання методу фіксації потенціалу. У Прикладі розкривається один зі способів застосування методу фіксації потенціалу. Молекулярний адаптер Краще, щоб трансмембранна пора містила молекулярний адаптер, що сприяє взаємодії нуклеотида з порою. Як правило, такий адаптер змінює фізичні або хімічні властивості пори, що поліпшує взаємодію нуклеотида з порою. Як правило, адаптер змінює заряд у порожнині або каналі пори або взаємодіє специфічним чином або зв'язується з нуклеотидом, таким чином, сприяючи проходженню нуклеотида через пору. Краще, щоб адаптер взаємодіяв з однією або декількома фосфатними групами нуклеотида або з основою нуклеотида шляхом р-катіонних взаємодій. Адаптер може опосередковувати взаємодію нуклеотида з порою. Наприклад, нуклеотид може оборотно зв'язуватися з порою через адаптер. Також адаптер може взаємодіяти одночасно з нуклеотидом і порою. Наприклад, нуклеотид може оборотно зв'язуватися як із порою, так із адаптером. Краще, що б адаптер викликав звуження порожнини або каналу пори для полегшення взаємодії пори з нуклеотидом. Сам адаптер може оборотно взаємодіяти з порою й у такий спосіб може переміщатися ззовні пори всередину порожнини або каналу пори й назад. Також адаптер може бути необоротно зв'язаний з каналом пори ковалентним зв'язком. Як правило, адаптер містить кільце аміногруп. Краще, щоб адаптер містив кільце із семи аміногруп. Таке кільце аміногруп може взаємодіяти з нуклеотидом одночасно з кільцем амінокислотних залишків у місці звуження каналу пори. Прикладом підходящого адаптера є циклодекстрин. Кращим адаптером є гептакис-6-аміно-циклодекстрин (am7--CD). Нуклеотид Методика, описана у винаході, може застосовуватися для ідентифікації будь-яких нуклеотидів. Нуклеотид може бути природного або штучного походження. Як правило, нуклеотид складається з азотистої основи, вуглеводного залишку й однієї або декількох фосфатних груп. Азотистою основою, як правило, є гетероцикл. Підходящі азотисті основи включають пурини й піримідини, зокрема, аденін, гуанін, тімін, урацил і цитозін. Як правило, вуглеводний залишок представлений пентозой. Підходящі вуглеводні залишки включають, але не 95087 16 обмежуються рибозой і дезоксірибозой. Як правило, нуклеотид є рибонуклеотидом або дезоксірибонуклеотидом. Як правило, нуклеотид містить одну, дві або три фосфатні групи. Підходящі нуклеотиди включають аденозинмонофосфат (AMP), аденозиндіфосфат (ADP), аденозинтрифосфат (АТР), гуанозинмонофосфат (GMP), гуанозиндіфосфат (GDP), гуанозинтрифосфат (GTP), тімідинмонофосфат (ТМР), тімідиндіфосфат (TDP), тімідинтрифосфат (ТТР), уридинмонофосфат (UMP), уридиндіфосфат (UDP), уридинтрифосфат (UTP), цитидинмонофосфат (СМР), цитидинідифосфат (CDP), цитидинтрифосфат (СТР), циклічний аденозинмонофосфат (сАМР), циклічний гуанозинмонофосфат (cGMP), дезоксіаденозинмонофосфат (dAMP), дезоксіаденозиндіфосфат (dADP), дезоксіаденозинтрифосфат (dATP), дезоксігуанозинмонофосфат (dGMP), дезоксігуанозиндіфосфат (dGDP), дезоксігуанозинтрифосфат (dGTP), дезоксітімідинмонофосфат (dTMP), дезоксітімідиндіфосфат (dTDP), дезоксітімідинтрифосфат (dTTP), дезоксіуридинмонофосфат (dUMP), дезоксіуридиндіфосфат (dUDP), дезоксіуридинтрифосфат (dUTP), дезоксіцитидинмонофосфат (dCMP), дезоксіцитидиндіфосфат (dCDP) і дезоксіцитидинтрифосфат (dCTP), однак, наведений список не є вичерпним. Кращі нуклеотиди AMP, TMP, GMP, UMP, dAMP, dTMP, dUMP або dCMP. Нуклеотид може бути отриманий шляхом ферментативного відщеплення від нуклеотидної послідовності, наприклад від рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксірибонуклеїнової кислоти. Одиночні нуклеотиди, відщиплені від полінуклеотидної молекули, можуть послідовно контактувати з порою, що дозволяє визначити нуклеотидну послідовність цілої молекули або її частини. Секверування нуклеїнових кислот у відповідності із другим втіленням винаходу більш детально описано нижче. Як правило, нуклеотид не піддається хімічній модифікації, як наприклад, у випадку, утворення нуклеотида шляхом відщеплення від нуклеотидної послідовності. У той же час, нуклеотид може бути хімічно модифікований або ушкоджений. Як правило, нуклеотид метіліруваний. Нуклеотид може бути позначений проявляючою міткою. Під проявляючою міткою може розумітися будь-яка мітка, що дозволяє виявити нуклеотид, як-то: флуорес125 35 центні молекули, радіоізотопи, наприклад' І, S, і лінкери, наприклад біотин. Наведений список міток не є вичерпним. Нуклеотид може перебувати в будь-якому підходящому біологічному зразку. Як правило, у методиці використовується зразок, про який відомо, що він містить або може містити один або декілька нуклеотидів. У методиці може використовуватися зразок, що містить один або декілька нуклеотидів невідомої природи. Крім того, стосовно зразка, що містить або може містити нуклеотиди відомої природи, дана методика може застосовуватися з метою підтвердження природи цих нуклеотидів. Методика може проводитися in vitro на будь-якому зразку, отриманому або виділеному з будь-якого організму або мікроорганізму. Організм або мікро 17 організм може бути прокаріотичним або еукаріотичним і може належати до одного з п'яти областей: рослини, тварини, гриби, бактерії й найпростіші. Методика може проводитися in vitro на зразку, отриманому або виділеному з будь-якого вірусу. Краще рідка форма зразка. Як правило, методика проводиться на зразках рідин тіла пацієнта. Зразок може являти собою мочу, слину, мокротиння або амніотичну рідину, однак краще кров, плазма або сироватка. Як правило, зразки тканин мають людське походження, але в той же час тканини можуть належати будь-якому ссавцеві, наприклад, сільськогосподарським тваринам таким, як коні, велика рогата худоба, вівцям або свиням, або свійським тваринам, як кішки або собаки. Перед аналізом зразок звичайно піддається попередній обробці, наприклад, центрофугуваню або фільтрації з метою видалення непотрібних компонентів, наприклад, червоних кров'яних тілець. Зразок може бути проаналізований безпосередньо після забору. Також після забору зразок може зберігатися, переважно при температурі не вище -70 °C. Умови Методика, описана в даному винаході, містить у собі вимір струму, що проходить через пору під час взаємодії нуклеотида з порою. Підходящі умови для вимірювання величин іонного струму через трансмембранні білки загальновідомі й розкриті в Прикладі. Для виконання методики до мембрани, що містить пору, прикладається різниця потенціалів. Як правило, різниця потенціалів становить від +50 мВ до +200 мВ. Переважно використовувати різницю потенціалів від +70 мВ до +150 мВ, від +85 мВ до +145 мВ або від +100 мВ до +140 мВ. Краща різниця потенціалів становить біля +130 мВ для дезоксірибонуклеотид-5-монофосфатів, таких як dAMP, dTMP, dGMP і dCMP і +110 мВ для рибонуклеотид-5-монофсфатів, таких як AMP, TMP, GMP і UMP. Методика проводиться в присутності хлористих солей лужних металів. У зразку приладу, описаному вище, сіль присутня у водяному розчині, що заповнює камеру. Як правило, використовується хлорид калію (КСl), хлорид натрію (NaCl) або хлорид цезію (CsCl). Краще використовувати КС1. Звичайно використовується концентрація солі 0, 1-2 М, 0, 3-1,9 М, 0, 5-1,8 М, 0, 7-1,7 М, 0, 91,6 М, 1-1,4 М. Краща концентрація солі становить 1 М. Методика проводиться в присутності буферного розчину. У зразку приладу, описаному вище, буферний розчин присутній у водяному розчині, що заповнює камеру. У методиці, що описана у винаході, може використовуватися будь-який буфер. Підходящим буфером є Tris-HCl. Як правило, методика проводиться при р=7, 5-12,0, 7, 6-11,0, 7, 7-10,0, 7, 8-9,5, 8, 0-9,0, 8, 0-8,5. Краще значення р становить 8,0. Як правило, методика проводиться при температурі 14-100 °C, 15-90 °C, 16-80 °C, 17-70 °C, 1860 °C,19-50 °C або 20-40 °C. Краще проводити методику при кімнатній температурі. Для дезоксінуклеотид-5'-монофосфатів, таких як dAMP, dTMP, dGMP і dCMP краще проводити 95087 18 методику при +130 мВ, рн=8,0 у присутності 1 М КСl. Для нуклеотид-5'-монофосфатів, таких як AMP, TMP, GMP і UMP краще проводити методику при +110 мВ, рн=8,0 у присутності 1 М КСl. Метод секвенірування нуклеїнових кислот У другому втіленні винахід відноситься до методу секвенірування нуклеїнових кислот, що включає в себе: а) відщеплення одиночного нуклеотида від кінця послідовності ДНК за допомогою процесивної екзонуклеази; b) контакт нуклеотида із трансмембранною білковою порою, що забезпечує взаємодію нуклеотида з порою; с) вимір струму, що проходить через пору під час взаємодії нуклеотида з порою й ідентифікація нуклеотида за допомогою аналізу вимірювання; d) повтор кроків а-с для того самого кінця молекули нуклеїнової кислоти, таким чином, забезпечуючи послідовне зчитування послідовності нуклеїнової кислоти. Таким чином, друге втілення містить у собі послідовне стохастичне розпізнавання кожного одиночного нуклеотида нуклеотидної послідовності, що дозволяє визначати послідовність нуклеїнової кислоти. За допомогою методу, описаному в другому втіленні, нуклеїнова кислота може бути секвенірувана частково або повністю. Нуклеїнова кислота може бути природного або штучного походження. Наприклад, метод, описаний у другому втіленні, може використовуватися для перевірки послідовності синтетичного олігонуклеотида. Методика, описана в другому втіленні, звичайно виконується in vitro. Пункти b і с методики, описаної в другому втіленні, практично ідентичні описаним вище пунктам методики, описаної в першому втіленні. Наведене вище обговорення першого втілення, особливо, де це стосується мембран, приладів, пор, молекулярних адаптерів, нуклеотидів і умов проведення методики, оптимальних для першого втілення, повністю справедливо й для другого втілення. Нуклеїнова кислота в другому втіленні може перебувати в тих же біологічних зразках, що були описані вище для першого втілення. Методика, описана в другому втіленні, може бути виконана на зразку, що містить одну або декілька нуклеїнових кислот з невідомою послідовністю. Крім того, стосовно зразка, що містить або може містити нуклеїнові кислоти відомої природи, методика, описана в другому втіленні, може застосовуватися з метою підтвердження природи цих нуклеїнових кислот. Як правило, перед застосуванням методики, описаної в другому втіленні, нуклеїнова кислота ампліфікується. Процесивна екзонуклеаза Методика, описана в другому втіленні, містить у собі взаємодію нуклеотидної послідовності із процесивною ендонуклеазою, у результаті якої з одного кінця нуклеотидної послідовності вивільняються окремі нуклеотиди. Процесивні екзонуклеази - це ферменти, які прикріплюються до одного кінця нуклеотидної послідовності й послідовно відщеплюють із цього кінця по одному нуклеотиду. Процесивна екзонуклеаза може розщеплювати нуклеотидну послідовність у напрямку від 3' до 5'кінця або від 5’ до 3'-кінця. Кінець нуклеотидної послідовності, з яким зв'язується екзонуклеаза, 19 звичайно визначається шляхом підбора використовуваного ферменту й/або за допомогою загальновідомих методик. Гідроксильні групи або кепструктури на будь-якому кінці нуклеотидної послідовності можуть використовуватися для ускладнення або полегшення зв'язування екзонуклеази із цим кінцем нуклеотидної послідовності. Будь-яка процесивна екзонуклеаза може використовуватися в методиці, що описана в даному винаході. Краще використовувати екзонуклеазу . Послідовність однієї із субодиниць екзонуклеази лямбда наведена в SEQ ID NO: 9. Три ідентичні субодиниці утворюють тримірну екзонуклеазу. Під різновидом екзонуклеази лямбда розуміються ферменти, зібрані з поліпептидних субодиниць із амінокислотною послідовністю, що відрізняється від наведеної в SEQ ID NO: 9; такі ферменти зберігають екзонуклеазну активність. Послідовність різновидів може відрізнятися від SEQ ID NO: 9 у такий же спосіб і до такого ж ступеня, як це було описано вище для різновидів SEQ ID NO: 2. Краще, щоб різновид екзонуклеази містив домени, відповідальні за зв'язування нуклеїнової кислоти й відщеплення нуклеотида (каталітичний домен). Краще, щоб різновид мав більш низьку ферментативну активність і/або знижену сольову чутливість у порівнянні з ферментом дикого типу. Процесивна екзонуклеаза може бути отримана будь-яким методом, описаним вище, що підходить для одержання трансмембранних пор. Методика, описана в другому втіленні, містить у собі контакт нуклеотидної послідовності із процесивною екзонуклеазою таким чином, що окремі нуклеотиди відщеплюються з кінця нуклеотидної послідовності зі швидкістю, що дозволяє ідентифікацію кожного окремого нуклеотида відповідно до методики, що описана в даному винаході. Методи цього відщеплення відомі в науці. Наприклад, за методикою деградації Едмана амінокислоти послідовно відщеплюються від кінця поліпептидного ланцюжка. Отримані окремі амінокислоти ідентифікують за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (HPLC). Подібна методика може використовуватися в даному винаході. Краще, щоб процесивна екзонуклеаза була ковалентно зв'язана із трансмембранною порою. Методики, підходящі для ковалентної зшивки екзонуклеази із трансмембранною порою, відомі в науці. Швидкість роботи процесивної екзонуклеази для застосування її в методиці, що описана в даному винаході, як правило, менше, ніж оптимальна швидкість роботи процесивної екзонуклеази дикого типу. Припустима швидкість відщеплення нуклеотидів процесивною екзонуклеазою у методиці, що описана в другому втіленні, може становити 0, 5-1000 нуклеотидів у секунду, 0, 6-500 нуклеотидів у секунду, 0, 7-200 нуклеотидів у секунду, 0, 8-100 нуклеотидів у секунду, 0, 9-50 нуклеотидів у секунду або 1-20 або 10 нуклеотидів у секунду. Переважна швидкість роботи становить 1, 10, 100, 500 або 1000 нуклеотидів у секунду. Припустима швидкість роботи процесивної екзонуклеази може бути досягнута різними способами. Наприклад, відповідно до винаходу, можливо використовувати мута 95087 20 нтну процесивну екзонуклеазу, що має знижену ферментативну активність. Як правило, ферментативна активність процесивної екзонуклеази залежить від рн розчину. Ферментативна активність падає зі зниженням рн. Так, методика, описана в другому втіленні, як правило, проводиться при рн, рівному 7, 5-8,0 або 7, 7-8,0. Краще значення рн становить 8,0. Як правило, ферментативна активність екзонуклеази падає зі збільшенням концентрації солей у розчині. Однак дуже висока концентрація солі справляє руйнуючу дію на фермент. Іншим способом зниження активності ферменту є підвищення концентрації солей у розчині до значення, що зменшує активність ферменту, але не впливає негативно на фермент. Наприклад, методика, описана в другому втіленні, може проводитися в розчині з концентрацією солей 0, 5-1 М. Краща концентрація солей становить 1М. Набори реактивів У своєму третьому втіленні даний винахід відноситься також до наборів реактивів, які можна використовувати для проведення методики, що описана в другому втіленні винаходу. Таким чином, ці набори реактивів підходять для секвенірування нуклеїнових кислот. У набір реактивів входить циклодекстрин і процесивна екзонуклеаза. У якості циклодекстрина краще включати в набір гептакіс-6-аміно--циклодекстрин. У якості процесивної екзонуклеази можна використовувати кожну з наведених вище в описі другого втілення. Також краще, щоб набір реактивів містив трансмембранну пору. В якості пори можна використовувати кожну з наведених вище в описі першого втілення винаходу. Крім перерахованих вище складових, у набір реактивів можуть входити один або більше реактивів або приладів, необхідних для проведення методики згідно всім перерахованим вище втіленням. Серед таких реактивів або приладів можуть бути: підходящі буферні розчини, устаткування для забору зразка (наприклад, контейнер або інструмент для уколу), реактиви, необхідні для ампліфікації нуклеїнових кислот, мембрана, описана вище або прилад для фіксації потенціалу або напруги). Реактиви можуть входити до складу набору в сухому вигляді, так щоб при додаванні до них рідкого зразка реактиви переходили б у розчин. У наборі також можуть міститися детальні роз'яснення того, яким пацієнтам показана діагностика за допомогою описаної методики. Набір може також містити або не містити нуклеотиди. Нижче описаний приклад пояснює винахід: Приклад Для того, щоб зменшити діаметр іонопровідного каналу нанопори до розмірів, порівнянних з розмірами визначаємих нуклеотидів, у мутант гемолізина (M113R)7 (фіг. 1А) у безпосередній близькості від місця звуження пори був поміщений циклодекстрин. Для цієї мети використовувався гептакіс-6-аміно--циклодекстрин (am7-CD) (фіг. 1В), що містить сім аміногруп у ключових положеннях. Коли циклодекстрин знаходиться усередині пори (фіг. 1С), кільце, що складається із семи аміногруп циклодекстрина й друге кільце, що 21 складається із семи залишків аргініну, що перебувають у положенні 113 мутантних поліпептидних ланцюгів, перебувають у безпосередній близькості друг від друга, у місці найбільшого звуження каналу пори. Ця аміно-аргинінова кільцева структура має здатність оборотно зв'язуватися з фосфатними групами й у такий спосіб затримувати ХМР і dXMP у каналі пори на 5-30 мс. Зв'язування нуклеотидів легко детектується по зміні амплітуди іонного струму через пору. 1. Матеріали й методи Мутант -гемолізина (M113R)7 експресувався й виділявся відповідно до протоколу, описаному в Cheley, S., L.-Q. Gu, et al. (2002), Chem. & Biol. 9:829-838. Реактиви 1,2-дифітаноіл-sn-глицеро-3-фоосфохолін виробництва Avanti Polar Lipids Inc. Пентан був придбаний в JT Baker, гексадекан чистотою >99 % в Sigma-Aldrich. Гептакіс (6-дезоксі-6-аміно)-циклодекстрин:НСl чистотою >99 % був придбаний в CYCLOLAB Ltd, Будапешт, Угорщина. 2дезоксігуанозин-5-монофосфат натрієва сіль чистотою 99 % була придбана в Acros, 2дезоксіцитозин-5'-монофосфат двунатриєва сіль >95 %, 2-дезоксітимідинн-5'-монофосфат двунатриєва сіль >97 % і 2-дезоксіаденозин-5'монофосфат двунатриєва сіль >95 % були придбані в Fluka. Уридин-5'-монофосфат двунатриєва сіль 99 % і цитозин-5'-монофосфат кислий були придбані в Fluka. Аденозин-5'-монофосфат кислий і гуанозин-5'-монофосфат двунатриєва сіль були придбані в Acros. Tris чистотою 99,9 % був придбаний в Sigma Aldrich; концентрована НС1 аналітичної чистоти була придбана в Fischer Scientific. Хлорид калію 99 % і хлорид натрію 99 % були придбані в Sigma-Aldrich. Бромід калію 99,5 % і хлорид цезію 99 % були придбані в Fluka. Устаткування Використовувався ампліфікатор фіксації потенціалу Axiopatch 200D виробництва Axon instruments, підключений до комп'ютера, обладнаного конвертером Digidata 1200 (A/D) виробництва Axon Instruments. Також використовувалася тефлонова камера. Збір даних здійснювався за допомогою програмного продукту pClamp 9,2, аналіз даних за допомогою програми Clampfit 6,0. Графіки й діаграми будувалися за допомогою Microsoft Origin 6.0. Інтегрування проводилося за допомогою калькулятора. Умови проведення екперименту Ліпідна бішарова мембрана була сформована з 1,2-діфітаноїл-sn-глицеро-3-фосфохоліна відповідно до методу, описаному Montal and Mueller (1972) на отворі діаметром 100-150 мкм у полікарбонатній плівці товщиною 20 мкм (плівка товщиною 20 мкм виробництва Goodfellow, Malvern PA), що розділяє камеру на цис- і транс-комірки. Потенціал цис-боку камери дорівнював потенціалу землі, а транс-бік був підключений до підсилюющої голівки. "Потенціал" позначає значення потенціалу трансу-електрода. Адаптерна молекула вводилася із транс-боку, мутант -гемолізина й аналізовані речовини вводилися із цис-боку. Експерименти з дезоксірибонуклеотидами (dXMP) проводилися 95087 22 при різниці потенціалів +130 мВ, експерименти з рибонуклеотидами (ХМР) при +110 мВ. Всі описані експерименти проводилися при рн=8,0, у буфері Tris-HCl 25 мм при концентрації КСl 1М. Свіжі розчини нуклеотидів готувалися щодня. Експерименти проводилися при кімнатній температурі 22±2 °C, якщо не зазначено інакше. 2. Результати 2-дезоксінуклеотид-5’-монофосфати частково блокують гомогептамірні пори, що складаються з (М113R)7/гептакіс-6-аміно--циклодекстрина. Проводився запис одиночного каналу в гомогептамірних порах, що складаються з -HL-M113R з додаванням am7-CD із транс-боку (фіг. 2А і 2В). При відсутності am7-CD пора перебувала у відкритому стані (фіг. 2А і 2В, В), якому відповідає безперервний струм L1 величиною 145±5 пА (при +130 мВ) у розчині 1М KCl в 25 мМ буфері TrisHCl. Додавання тільки 40 мкМ am7-CD у транскомірку приводило до ряду оборотних короткочасних закривань пори, що супроводжувалися падінням струму до 65±5 па (L2 на фіг. 2А, В і фіг. 2В, С). При додаванні dCMP у цис-комірку спостерігався третій рівень струму, рівний 22±1 пА (L3 на фіг. 2А, С та фіг. 2В, D), що виникає від рівня струму L2. L3 відповідає зв'язуванню dCMP з комплексом (M113R)7 і am7-CD. Додавання dCMP у транс-, а не в цис-комірку у концентрації до 300 мкм не приводило до зміни провідності пори, пов'язаної із циклодекстрином (не показано). В умовах експерименту, описаних вище, спостерігалися окремі події блокування струму через зв'язування циклодекстрина при додаванні немодифікованого -циклодекстрина в концентрації 40 мкМ у транс-комірку у присутності однієї нанопори, що складається з -HL-M113R. Однак, при додаванні дезоксірибонуклеотидів у концентрації до 300 мкм у цис- або транс-комірку картина блокування струму не мінялася (не показано). Під час відсутності am7-CD у транс-комірці спостерігалися окремі події блокування струму тривалістю до 1 мс при додаванні в цис-комірку dGMP або dTMP у концентрації не менш 300 мкМ. При концентрації ХМР або dXMP 5 мкМ подібні події не спостерігалися протягом усього експерименту. Додавання am7-CD у транс-комірку під час вимірювання струму через одиночну пору, що складається з -HL дикого типу, приводило до подій зв'язування циклодекстрина. Додавання дезоксірибонуклеотида в цис- або транс-комірку не викликало подальших змін величини струму. Можливість ідентифікації 2-дезоксінуклеотид5’-монофосфатів по амплітуді часткового блокування гомогептамірних пор, що складаються з (М113R)7/гептакіс-6-аміно--циклодекстрина Амплітуда часткового блокування перехідного комплексу (M113R)7/am7-CD варіювала залежно від природи дезоксірибонуклеотида, що додається в цис-комірку (фіг. 3). Додавання 5 мкМ dGMP викликало в середньому блокування струму до рівня 16 пА (фіг. 3А). Гістограма розподілу подій по амплітуді запису струму, наведеного на фіг. 3А, наведена праворуч від запису разом зі структурною 23 95087 формулою dGMP. Для кожного нуклеотида існує характерна амплітуда блокування струму, як показано на фіг. 3В для dTMP, 3C для dAMP і 3D для dCMP. Для чотирьох досліджених дезоксірибонуклеотидів, ефект dGMP виявляється найбільш вираженим. Амплітуда струму варіювала незначно між незалежними експериментами, що пояснюється різною білковою природою нанопор, використаних в експериментах. Середнє значення струму при +130 мВ становить 139 пА для (M113R)7, однак для деяких каналів значення струму досягало 147 пА, а для деяких становило 131 пА. Внаслідок цього, для порівняння записів струмів, записи були нормалізовані між різними експериментами між нульовим струмом і струмом (M113R)7/am7-CD на рівні 65 пА. Час затримки кожного dXMP у порі розраховувався по 500 подіям з 3 незалежних експериментів (табл. 1) Таблиця 1 Час затримки (мс) dGMP, dTMP, dAMP і dGMP, усереднений по трьох незалежних експериментах off dGMP 9,8±0,2 dTMP 19,8±0,8 dAMP 7,1±0,2 dCMP 10,5±0,4 Рівень струму циклодекстрина При рН=8,0 мутант (M113R)7 демонструє два значення струму L1/L1’, коли білковий канал вільний (фіг. 4). Циклодекстриновий адаптер може зв'язуватися з білком незалежно від рівня струму, на якому знаходиться білок. При запису струму через нанопору (M113R)7 спостерігаються два рівні струму (фіг. 4). Значення L1 відповідає основному рівню струму, що наведено на вставці у фіг. 4. Зв'язування am7-CD з нанопорою веде до появи двох рівнів струму, що ’ відповідають L2 і L2 (при рН=7,5 спостерігаються три рівні струму, не показано). Зв'язування am 7CD з нанопорою відбувається незалежно від рівня струму L1 або L1’. L2 відповідає основному рівню провідності, що спостерігається при зв'язуванні am7-CD з (M113R)7, він виникає від рівнів провідності вільної нанопори L1 або L1’ без видимої кореляції. Рівень струму L2’ що спостерігається при зв'язуванні am7-CD з (M113R)7 відповідає менш 15 % провідності при зв'язуванні циклодекстринового адаптера (див. вставку на фіг. 4). Події зв'язування нуклеотида іноді розрізняються по амплітуді струму, це залежить від якого рівня струму, L2 або L2', вони виникають. Спостерігався зсув величиною 0,5 пА залежно від того, виникає подія зв'язування dXMP від рівня L2 або L2'. Це приводить до збільшення перекривання гістограм подій зв'язування (фіг. 5). Можливий аналіз записів вручну для того, щоб видалити з розгляду всі події зв'язування аналізованих молекул, що виникають від рівня току зв'язаного циклодекстрина L2', наведеного на фіг. 3. На фіг. 5 наведена різниця між гістограмою аналі 24 зу одиничної події, отриманої з неопрацьованого запису струму детекції дезоксінуклеотида (фіг. 5А) і гістограми, отриманої в результаті видалення подій, що виникають від рівня струму L2' (фіг. 4). На обох гістограмах добре помітні ті самі чотири піки, що відповідають dGMP, dTMP, dAMP і dCMP. Амплітуда піків на фіг. 5А більша, ніж на фіг. 5В, оскільки були вилучені піки, що виникають із L2', у результаті чого гістограма містить менше подій. Поділ піків виглядає краще на гістограмі 5В, чим на 5А. Однак, видалення цих подій із записів не привело до повного поділу піків (фіг. 5В). Внаслідок цього, рівні струму циклодекстрина L2 і L2' не розглядалися в гістограмах аналізу одиночних подій і нижченаведеному статистичному аналізі. Можливість ідентифікації 2-дезоксінуклеотид5’-монофосфатів по амплітуді блокування гомогептамірних пор, утворених тимчасовим комплексом (M113R)7 і гептакіс-6-аміно--циклодекстрина Амплітуда часткового блокування тимчасового комплексу (M113R)7/am7-CD варіювалася залежно від природи дезоксірибонуклеотида, що додається в цис-комірку. При одночасному додаванні dGMP, dTMP, dAMP і dCMP у цис-комірку можливо розрізнити характерні амплітуди (фіг. 5). На фіг.6А показана амплітуда струму для змішаного розчину всіх 4 нуклеотидів; наведені дані одного експерименту. На запис струму накладені кольорові смуги для ілюстрації розподілу амплітуд кожного dXMP. На фіг. 6В наведена гістограма амплітуди запису струму, що містить 8000 подій, передбачається, що вона являє собою сполучення розподілів амплітуд, що генеруються кожним нуклеотидом. Гістограма амплітуд накладена на нормальні розподіли. Криві підігнані в такий спосіб: пікове значення струму в цьому експерименті взято за середнє значення по вибірці, а величина а отримана шляхом незалежного підгонки й усереднення розподілу кожного одиночного нуклеотида. Після підгонки кривих під нормальні розподіли, були обчислені ймовірності ідентифікації кожного нуклеотида. Статистичні методи На записі струму через (M113R)7 у присутності am7-CD на транс-боці й одного з аналізованих нуклеотидів на цис-боці був накладений цифровий фільтр Гаусса нижніх частот на рівні 300 Гц, і за отриманими даними були побудовані гистограми розподілу подій. На цих гистограмах видний високий пік, що відповідає амплітуді струму, спостережуваної при зв'язуванні am7-CD з мутантом (M113R)7 -гемолізина (рівень L2 на фіг. 3). Це значення амплітуди варіює між експериментами в межах 5 %. У зв'язку із цим гистограми амплітуд були нормалізовані між нульовим струмом і основним піком циклодекстрина на 65 пА. На нормалізованій гістограмі пік нуклеотида був підігнаний під нормальний розподіл. Середнє значення й масштаб розподілу (сигма, ) для одного нуклеотида були усереднені за результатами 3 незалежних експериментів по 1000 подій кожний (значення наведені в табл.2). 25 95087 26 Таблиця 2 Таблиця 4 Середні значення розподілу кожного нуклеотида за результатами трьох незалежних експериментів, нормалізовані між 0 і 65 пА У таблиці наведені ймовірності ідентифікації доданого нуклеотида (по вертикалі) правильно або помилково як інший нуклеотид (по горизонталі) G Т А С Середнє значення 16.0, =0.64 17.4, =0.41 18.4, =0.54 20.0, =0.51 Gadded Tadded Aadded Cadded Імовірності розпізнавання кожного нуклеотида визначалися за результатами експериментів з одночасною присутністю всіх 4 нуклеотидів у розчині; у кожному записі містилося не менш 3000 подій зв'язування. На записи був накладений фільтр (цифровий низькочастотний фільтр Гаусса), і записи були нормалізовані між 0 і циклодекстриновим піком на 65 пА, аналогічно експериментам з одиночними нуклеотидами. Пікові значення для кожного нуклеотида усереднювались за результатами 5 незалежних експериментів (табл. 3). Таблиця 3 Пікові значення для кожного нуклеотида в умовах одночасної присутності чотирьох нуклеотидів за результатами п'яти незалежних експериментів. У другому стовпчику наведені середні значення кожного піка з інтегрованими ділянками перекривання нормальних розподілів G(na) Т(па) А (па) С(па) Середнє значення 16.2±0.5 17.6±0.6 18.6±0.6 20.2±0.5 В експериментах з одночасною присутністю всіх 4 нуклеотидів, криві нормального розподілу для всіх 4 нуклеотидів перекриваються. Була підрахована ймовірність правильної ідентифікації нуклеотида або неправильної ідентифікації його як іншого нуклеотида, виходячи з величини перекривання нормальних розподілів для даного нуклеотида і його сусідів. Точка перетинання двох кривих нормального розподілу обчислюється, виходячи з відносних положень піків (отриманих в експерименті із сумішшю нуклеотидів) і масштабом  кожного з розподілів (отримана шляхом підгонки кривих окремих нуклеотидів). Імовірність правильного визначення нуклеотида отримується шляхом інтегрування площі під нормальною кривою за межами її точки перетинання із сусідньою нормальною кривою (фіг. 6, табл. 4). У першому стовпчику в табл. 4 нуклеотид, взаємодіючий з нанопорою; у першому ряду значення зчитування відповідної амплітуди. Gread 0.88 0.06 0 0 Тread 0.12 0.83 0.19 0 Aread 0 0.11 0.74 0.06 Сread 0 0 0.07 0.94 3. Висновки Результати, представлені вище, дають підставу стверджувати, що стохастичне розпізнавання є багатообіцяючою альтернативою класичним методикам розпізнавання одиночних нуклеотидів. Це також означає, що секвенірування за допомогою екзонуклеази можна використовувати в якості дешевого, швидкого й простого методу секвенірування ДНК на молекулярному рівні. Секвенірування за допомогою екзонуклеази також значно дешевше звичайних методів, оскільки не вимагає використання дорогих реактивів, таких як флуорофори. Точність визначення кожного нуклеотида за допомогою методу гистограм розподілу становить 74-94 % (табл. 4). В умовах експерименту час затримки різних ХМР і dXMP розрізняється недостатньо для розрізнення аналізованих молекул. Статистичні дані, отримані по гистограмам амплітуд, можуть бути поліпшені шляхом компенсації рівня струму циклодекстрина як показано на фіг. 4. Різниця в рівні струму між різними dXMP становить 1 пА. Це вирішення методу залежить від умов, описаних нижче: Залежність від напруги Події зв'язування залежать від напруги. При напрузі 50 мВ спостерігається дуже мало подій зв'язування. Це означає, що існує мінімум напруги, необхідний для переміщення dXMP і ХМР у напрямку до сайту зв'язування. При напрузі +150 і +200 мВ різниця амплітуд недостатня для розрізнення нуклеотидів. Для дезоксирибонуклеотид-5'монофосфатів оптимальна напруга становить +130 мВ, для рибонуклеотид-5'-монофосфатів +110 мВ. Концентрація солі Був використаний буфер Tris-HCL рн=8,0, що містить 0,5, 1 або 2 М KCl. По всім гістограмам розподілу найкращий аналіз був отриманий при використанні 1 М KCl. Залежність від рН Для з'ясування залежності амплітуд струму від рН використовувався буфер Tris-HCl, що містить 1 М KCl із рН=7,5, 8,0, 8,2, 8,5, 9,0 і 9,5. При значенні рН 8,0 і вище при зв'язуванні am7-CD спостерігалися два рівні струму (фіг. 4). При рН=7,5 при зв'язуванні гептакис-6-аміно-(-циклодекстрина з'являється третій рівень струму (не показаний). Внаслідок цього dTMP демонструє два типи подій з різними амплітудами, один з яких попадає в галузь значень, характерних для подій зв'язування dGPM. Це приводить до втрати дозволу. При 27 рН=9,5, події зв'язування нуклеотидів не спостерігаються. Найкращий поділ піків спостерігається при рН=8,0. Залежність від солі. Аналіз методу як для dXMP, так і для ХМР, у розчині KCl краще, ніж у розчині NaCl або CsCl. Аналіз в 1 М KCl краще, ніж в 2 М KCl. Використання KBr не дозволяє ідентифікувати нуклеотиди, оскільки кожна подія зв'язування вела до повного блоку тимчасового комплексу (M113R)7/am7-CD. Залежність від температури Зниження температури до 14 °C або підвищення до 50 °C не перешкоджало визначенню нуклеотидів. Однак це не поліпшувало поділу гістограм амплітуди. Інші мутанти -гемолізина В експериментах з іншими мутантами гемолізина (M113N)7 виявився здатним зв'язувати am7- CD, однак визначення нуклеотидів виявилося неможливим. При використанні (M113F)7 і (M113F/147K)7 визначення нуклеотидів виявилося неможливим поза залежністю від зв'язування з ат7-CD. (М113К)7 був протестований у тих же умовах. У цьому випадку запис виявивсяподібним з наведеним на фіг. 1. При використанні мутанта (М113К)7 виявилося можливим виявити зв'язування нуклеотида з -гемолізином і am7-CD, однак, 95087 28 піки нуклеотидів розділялися гірше, ніж при використанні (M113R)7. Рибонуклеотид-5'-монофосфати ХМР успішно виявлялися за допомогою даного методу, однак поділ між нуклеотидами був гіршим, ніж між dXMP, з поділом піків U, А і С менш 1 пА. Гістограми розподілу амплітуд току розташовані в тому ж порядку, що й гістограми dXMP, найменший струм (найбільш повне блокування) відповідає GMP, далі UMP, AMP і СМР, якому відповідає найбільша амплітуда струму (найменш повне блокування). Оптимальна напруга для ідентифікації ХМР становила +110 мВ при рН=8,0 і концентрації KCl 1 М. Механізм Було також показано, що тимчасовий комплекс (M113R)7/am7-CD здатний зв'язувати й диференціювати глюкозофосфати (глюкозо-1-фосфат і галактозо-1-фосфат). Це припускає сильні взаємодії між аргининовим кільцем на одному боці, фосфатною групою й кільцем аміногрупи am7-CD на іншому боці. Немодифікований  циклодекстрин виявився нездатним до детекції. Різниця між dXMP і ХМР виявляється малою, що говорить про те, що гідроксильні групи не грають значної ролі у зв'язуванні. 29 95087 30 31 95087 32 33 95087 34 35 95087 36 37 95087 38 39 95087 40 41 95087 42 43 95087 44 45 95087 46 47 95087 48 49 95087 50 51 95087 52 53 95087 54 55 95087 56 57 95087 58 59 95087 60