Катіонні полімери на основі глікогену

Реферат: Даний винахід стосується катіонних полімерів на основі глікогену, комплексів зазначених катіонних полімерів з аніонними сполуками, фармацевтичних композицій, що містять зазначені комплекси, та застосування зазначених комплексів для доставки або трансфектування зазначених аніонних сполук у специфічну фармакологічну ціль, таку як, наприклад, орган, тканина або клітина. UA 115135 C2 (12) UA 115135 C2 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Галузь винаходу Даний винахід відноситься до катіонних полімерів на основі глікогену, до комплексів, що включають зазначені полімери та щонайменше одну аніонну сполуку, та до застосування зазначених комплексів для доставки аніонних сполук. Зокрема, катіонні полімери на основі глікогену є корисними як невірусні вектори для трансфекції нуклеїнових кислот. Попередній рівень техніки Для того, щоб знизити побічні ефекти активних речовин та максимізувати їх терапевтичну ефективність, розроблені системи контрольованого вивільнення, у яких фармацевтична форма контролює фазу вивільнення активної речовини, а також системи, здатні доставляти та скеровувати активну речовину до специфічної фармакологічної цілі. Зокрема, доставляючі та спрямовуючі системи повинні взаємодіяти з активними речовинами таким чином, щоб отриманий комплекс був стійким у процесі зберігання та введення, але вивільнював активну речовину у правильну фармакологічну ціль. Як правило, взаємодії, які мають місце між системою доставки та активною речовиною, є нековалентними, наприклад, такі як електростатичні, іонні або ван-дер-Ваальсові взаємодії, утворення водневих зв’язків та подібні. Проблема розробки систем доставки та спрямовування стосується частково активних речовин з низькою молекулярною масою, та частково полімерів та молекул з високою молекулярною масою, наприклад, таких як нуклеїнові кислоти. Зокрема, умисний процес вставки послідовностей нуклеїнових кислот та/або генетичних конструкцій у цільові клітини з метою компенсування відсутності гену, надекспресування гену, пригнічення експресування гену або введення нових функцій у зазначену клітину позначається, у галузі генної терапії, терміном "трансфекція". Цей спосіб, здається, багатообіцяючим як у лікуванні генетичних захворювань, так і у розробці стратегій для лікування та профілактики хронічних захворювань. Однак, при введенні in vivo у природній формі, нуклеїнові кислоти, подібно іншим поліаніонним речовинам, швидко розкладаються катіонними ферментами (наприклад, нуклеазами та протеазами) та повністю абсорбуються клітинами. Генні вектори, які були досліджені та розроблені до даного часу, включають вірусні системи (ретровіруси, аденовіруси, тощо) та не-вірусні системи (ліпосоми, полімери, пептиди, тощо). Відомо, що вірусні вектори мають вищу трансфекційну ефективність, ніж не-вірусні системи. Однак, застосування вірусних векторів in vivo обмежується численними недоліками, наприклад, такими як ризик реплікації, можливість спричинення імунних реакцій, той факт, що тільки підрозділені клітини є доступними як цілі, низька ємкість заряду генів великого розміру або довільна вставка ДНК фрагментів. У даній галузі техніки відомо, що застосування генних терапій на основі невірусних векторів включає численні переваги, серед яких - відносна безпека та низька вартість одержання. Невірусні генні вектори, наприклад, катіонний полімери, ліпосоми та синтетичні вектори, широко досліджені як альтернатива застосуванню вірусних векторів. N,N-Діетиламіноетил-декстран (DEAE-декстран) був однією з перших хімічних похідних природного полімеру, призначених для застосування для контрольованого вивільнення активних речовин (наприклад, для контрольованого вивільнення у слизову оболонку, як описано, наприклад, у WO 90/09780) та, далі, як трансфекційний агент (як описано, наприклад, у EP 1 738 769). DEAE-декстран являє собою полікатіонний полімер, отриманий шляхом введення у реакцію N,N-діетиламіноетил-хлориду та декстрану, який являє собою лінійний полімер, у якому глюкозні одиниці зв’язані за допомогою α-1,6 зв’язків, з невеликим розгалуженням, де глюкозні мономери зв’язані за допомогою α-1,4 зв’язків (нумерація показана у формулі нижче). DEAE-Декстран, представлений наступною структурною формулою, має два замісники, що включають азотні залишки, у яких атоми азоту мають відмінні один від одного фізико-хімічні характеристики: 1 UA 115135 C2 6 O CH2 4 * OH O * 1 O O OH CH2 O n OH OH O O H3C CH2 O n OH OH N' CH2 O OH O n H3C OH OH O O H3C * n ClN+ H3C N" H3C H3C 5 10 15 20 25 30 35 40 Перший замісник включає четвертинну амінну функціональну групу (показану як N') з pK a приблизно 9,5, яка, при фізіологічному pH, знаходиться у іонізованій формі. Другий замісник, + відомий як "тандем", включає четвертинну амонійну групу (N ), яка має постійний позитивний заряд та впливає на кислотність другої четвертинної амінної функціональної групи (показаної як N''), яка має pKa приблизно 5,7 та тоді, при фізіологічному pH, знаходиться у не-іонізованій формі (F. Gubensek, Journal of Macromolecular Science: Part A - Chemistry - 2 (5) 1968, 1045 1054). Відомо, однак, що позитивні заряди DEAE-декстрану in vivo взаємодіють з аніонними біологічними структурами, що відрізняються від нуклеїнових кислот, що приводить до токсичних явищ. Загалом, механізм утворення комплексів між катіонними полімерами та нуклеїновими кислотами та наступна доставка можуть бути підсумовані як описано нижче. Генетичний матеріал комплексується катіонними полімерами за допомогою слабких взаємодій, наприклад, таких як електростатичні взаємодії. Утворення цього комплексу захищає нуклеїнову кислоту від нуклеазного розкладання та дозволяє доставити нуклеїнову кислоту у клітину, так як позитивні заряди, присутні на поверхні комплексу, взаємодіють з клітинною мембраною, стимулюючи ендоцитоз комплексу, шляхом утворення ендосом. Внутрішня частина ендосом має pH приблизно 4,5-5, що є значно більш кислим, ніж pH цитоплазматичного середовища, що становить приблизно 7,3. Ця відмінність у pH підтримується АТФ-залежним протонним насосом, що знаходиться на ендосомальній мембрані, + який виштовхує H іони з цитозолю у ендосому. Кисле pH промотує активність лізосомальних нуклеаз, які є ферментами, що відповідають за розкладання нуклеїнових кислот шляхом гідролізу фосфодискладноефірних зв’язків між нуклеотидними субодиницями. Полімери з буферною здатністю інгібують активність лізосомальних нуклеаз та, у той же час, змінюють осмолярність ендосом. + + У дійсності, у той час як полімери зв’язують у комплекс H іони, інші H іони потрібні цитозолю, у той же час як Cl іони необхідні для підтримання електричної нейтральності + ендосоми. Однак, потреба у H та Cl іонах приводить до збільшення концентрації іонів всередині ендосоми, що приводить до зростання осмолярності ендосоми у порівнянні з цитозолем. Зростання осмолярності потребує воду з цитозолю. Отже, ендосома набухає, поки не розірветься, вивільнюючи комплекс полімер-нуклеїнова кислота у цитоплазму. Цей механізм, відомий як "протон-поглинальний механізм", був описаний, серед інших J-P. Behr у “The proton sponge: a trick to enter cells the viruses did not exploit” (Chimia, 1997, 51, 34-36) у відношенні поліетиленімінових (PEI) полімерів та, у більш загальному вигляді, H. Eliyahu et al. у “Polymers for DNA delivery” (Molecules, 2005, 10, 34-64). Поліетиленіміни (PEI) являють собою лінійні або розгалужені катіонні полімери, що характеризуються високо ефективним вивільненням олігонуклеотидів та плазмід у клітини, in vitro, як описано, наприклад, O. Boussif et al. у “A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine” (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, 7297-7301) та у міжнародній патентній заявці WO 02/100435. PEI-и описані як полімери з високою щільністю заряду, що захищає нуклеїнові кислоти від розкладання нуклеазами. 2 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вважається, що висока буферна здатність PEI захищає нуклеїнову кислоту від розкладання у ендосомах у процесі фази всмоктування клітиною, шляхом спричинення осмотичного набухання ("протон-поглинальний" механізм) ендосоми, що робить можливим вивільнення комплексу вектор-нуклеїнова кислота у цитоплазму. Інший полімер, який широко вивчений як трансфекційний агент, являє собою полі(L-лізин) (PLL), який був описаний, наприклад, у міжнародній патентній заявці WO 03/063827, яка характеризується первинними амінними групами, які є іонізованими при фізіологічному pH, які взаємодіють з фосфатними групами нуклеїнових кислот, які є негативно зарядженими. Однак, токсичність та трансфекційна ефективність PLL є прямо пропорційною до його молекулярної маси: коли молекулярна маса полімеру зростає, спостерігається збільшена трансфекційна ефективність, з одного боку, та збільшена цитотоксичність, з іншого боку. Крім того, головний ланцюг PLL слабко розкладається за фізіологічних умов, та його накопичення може призвести до токсичних наслідків у кінцевому рахунку. Як для більшості катіонних полімерів, комплекси PLL з нуклеїновими кислотами також мають фізико-хімічні недоліки. Наприклад, способи одержання забезпечують невелику можливість контролю розміру, та це може привести до присутності великих часток з обмеженою дифузійною здатністю та/або можливістю осадження у процесі фази формулювання або введення. Крім того, як виявлено, кислотно-основні характеристики PLL не дають можливості отримати високу трансфекційну ефективність, можливо через обмежену здатність вивільнення нуклеїнової кислоти у цитоплазматичне середовище. Інші катіонні полімери, як природні, так і синтетичні, описані у даній галузі техніки як трансфекційні агенти для нуклеїнових кислот. Наприклад, міжнародна патентна заявка WO 03/078576 описує хітозан як трансфекційний агент для нуклеїнових кислот. Хітозан являє собою природній лінійний полімер, що складається з D-глюкозамінових та Nацетил-D-глюкозамінових одиниць, які розподілені у довільному порядку у полімері, зв’язаних за допомогою β-1,4 зв’язків, та що включають амінну групу з pKa приблизно 6,5. Що стосується трансфекційних агентів для нуклеїнових кислот, також були проведені широкі дослідження на дендримерах, що містять групи, здатні до позитивної іонізації, наприклад, полі(амідоамін) (PAMAM) структури, макромолекули лінійної структури; метакрилові полімери (такі як N,N-диметиламіноетил-метакрилат, DMAEMA), полі(етиленімін) (PEI), та похідні цих полімерів із солюбілізуючими, функціональними або направляючими групами, наприклад, полімерні структури, що містять полі(етиленгліколь) (PEG). Лінійні полі(амідоаміни) (PAMAM) описані, наприклад, у міжнародній патентній заявці WO 97/25067, являють собою водорозчинні полімери, які дозволяють формувати розчинні та/або диспергуємі комплекси. Переважно, значення pKa катіонних груп цих полімерів слід підтримувати у інтервалі між 7 та 8, так як відомо, що нижчі pKa значення знижують здатність до утворення комплексів з нуклеїновими кислотами. Також, вивільнення комплексів, утворених з дендримерів на основі PAMAM та нуклеїнових кислот, ендосомами залучає "протонпоглинальний" ефект. Особливо, C.L. Waite et al. у “Acetylation of PAMAM dendrimers for cellular delivery of siRNA” (BMC Biotechnology, 2009, 9:38) доповідають, що часткове ацетилювання первинних амінних залишків знижує як буферну здатність дендримерів на основі PAMAM, так і вивільнення міРНК. Також були розроблені катіонні полімери для інших застосувань, ніж трансфекційні агенти для нуклеїнових кислот. Наприклад, у параграфі 2.2 статті Pal S. et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 193-199) розкрито, як глікоген був катіонований шляхом включення катіонного мономеру N-(3-хлор-2-гідроксипропіл)-триметил-амонію хлориду у скелетну структуру полісахаридного глікогену. Знайдено, що зазначений катіонний полімер є ефективним як флокулюючий агент у суспензіях залізної руди. Відомо, що ідеальний трансфекційний агент має забезпечувати високу трансфекційну здатність, без необхідності впливати на фізіологічну ціль; він має бути нетоксичним при ефективній дозі та має бути таким, що біорозкладається, таким чином, щоб уникнути будь-яких довготривалих побічних ефектів. Крім того, у випадку, якщо трансфекційний агент є полімером, він має утворювати частки -6 менше, ніж мікрометр (тобто менше ніж 10 м) та має переважно утворювати наночастки, так як відомо, що розмір може обмежувати як дифузійну здатність комплексу у позаклітинному середовищі, так і ефективність ендоцитозу/фагоцитозу у клітинах. Нарешті, полімерна структура має включати амінні групи та/або атоми азоту, що характеризуються різними pKa значеннями. Фактично, амінні групи із pKa значеннями вище, ніж 3 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 фізіологічне pH значення, сприяють комплексуванню нуклеїнової кислоти при фізіологічному pH; амінні групи із pKa значеннями, що дорівнюють приблизно ендосомальним pH значенням, активують "протон-поглинальний" механізм та забезпечують вивільнення комплексу полімернуклеїнова кислота у цитоплазму; нарешті, четвертинні амонійні групи забезпечують комплексування та вивільнюються з ендосоми незалежно від значення pH. Короткий опис винаходу Заявник звернувся до проблеми розробки нових полімерів, які можуть бути використані як для доставки низькомолекулярних активних речовин, так і як невірусні вектори для нуклеїнових кислот, та які можуть подолати недоліки матеріалів, відомих у даній галузі техніки. Неочікувано, Заявник виявив, що глікоген може бути модифікований таким чином, щоб отримати нові катіонні похідні. Переважно, зазначені нові катіонні похідні глікогену характеризуються низькою цитотоксичністю. Заявник упевнений, що це має місце в основному завдяки двом причинам. По-перше, глікоген являє собою біосумісний полімер, який являє собою продукт метаболізму та зберігання цукрів у всіх тваринних організмах, де він постійно виробляється та розкладається. Крім того, Заявник упевнений, що численні відгалуження у глікогені забезпечують структуру стійкою сферичною конформацією, яка здатна селективно знижувати доступ до катіонних зарядів: розчинні молекули можуть дифундувати всередину полімерної структури та комплексуватися катіонними сайтами, при тому, що, у той же час, взаємодії з більшими комплексними структурами не були б більше дозволені через сферичні причини. Ця сферична конформація могла б зробити можливим зниження токсичності катіонних зарядів, які, як правило, руйнують клітинні мембрани. Заявник виявив, що нові катіонні похідні глікогену зберігають характеристики біосумісності природного полімеру, з якого вони одержані. Заявник також виявив, що ці нові катіонні похідні глікогену здатні утворювати комплекси з аніонними сполуками, які мають розміри та молекулярні маси у широкому інтервалі. Переважно, зазначені комплекси є нанометричного розміру та не показують будь-якої агрегації, коли вони знаходяться у розчині, навіть при високих концентраціях. Заявник виявив, що нові катіонні похідні глікогену можуть доставляти аніонні сполуки до специфічних фізіологічних цілей (наприклад, органів, тканин та клітин). Заявник також виявив, що катіонні похідні глікогену у відповідності з даним винаходом здатні проникати у клітини. Отже, зазначені нові катіонні похідні глікогену можуть бути використані для доставки аніонних сполук у клітини. Нарешті, Заявник виявив, що катіонні похідні глікогену у відповідності з даним винаходом можуть бути використані як стабілізатори у зберіганні білків та ферментів та як співад’юванти у виробництві вакцин. Переважно, нові катіонні похідні глікогену включають замісники, що несуть амінні групи, які характеризуються pKa значеннями, які відрізняються одне від іншого, таким чином, щоб полегшувати як комплексування аніонних сполук, так і вивільнення комплексів полімер-аніонна сполука з ендосоми у цитоплазму. Переважно, нові катіонні похідні глікогену у відповідності з даним винаходом мають низьку в’язкість та, отже, можуть бути сформульовані у фармацевтичні композиції для ін’єкційного застосування. У першому аспекті, таким чином, даний винахід відноситься до нових катіонних полімерів на основі модифікованого глікогену, зокрема даний винахід відноситься до катіонних полімерів на основі глікогену, які включають щонайменше одну повторювану одиницю, вибрану з групи, що включає: (а) OR O * OR O OR 55 n * (a) у якій групи R, які можуть бути однаковими або різними, являють собою атом водню; 4 UA 115135 C2 5 10 карбоксиметильну групу, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групу, що містить атом азоту, вибрану з таких як: NH 2-(C1C6)алкіл, [N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, NH2-{[(C1-C6)алкіл]-ді(C1-C6)алкіламоній}-(C1C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл-ді(C1-C6)алкіламоній}-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіламіно}-(C1-C6)алкіл, [три(C1C6)алкіламоній]-(C1-C6)алкіл, азоцикліл-(C1-C6)алкіл, у яких (C1-C6)алкільні ланцюги, які можуть бути однаковими або різними, є необов’язково заміщеними однією або більше гідроксильними групами; та n являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1; та (b) OR1 O O * X1 15 20 25 30 35 40 45 50 X2 m* (b) у якій R1 вибирають з атому водню; карбоксиметильної групи, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групи, що містить атом азоту, вибраної з таких як: NH2-(C1-C6)алкіл, [N,N-ді(C1-C6) алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1C6)алкіл-ді(C1-C6)алкіламоній]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл-ді(C1C6)алкіламоній}-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1C6)алкіламіно}-(C1-C6)алкіл, [три(C1-C6)алкіламоній]-(C1-C6)алкіл, у яких (C1-C6)алкільні ланцюги, які можуть бути однаковими або різними, є необов’язково заміщеними однією або більше гідроксильними групами; X1 та X2, які можуть бути однаковими або різними, являють собою групу -OH або групу, що містить атом азоту, -NHR2, у якій R2 вибирають з таких як: атом водню, (C1-C6)алкіл та H-[NH(C1-C6)алкіл]p-, де p являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1, та (C 1-C6)алкільні групи можуть бути однаковими або різними; та m являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1; за умови, що щонайменше один з R, R1, X1 та X2 являє собою групу, що містить азот, як визначено, відповідно, для кожного з R, R1, X1 та X2 та за умови, що зазначений катіонний полімер на основі глікогену відрізняється від продукту, отриманого реакцією глікогену з N-(3-хлор-2-гідроксипропіл)-триметил-амоній хлоридом. Зазначений вище вираз “за умови, що щонайменше один з R, R1, X1 та X2 являє собою групу, що містить азот, як визначено, відповідно, для кожного з R, R1, X1 та X2” означає, що, у випадку, коли R являє собою групу, що містить азот, зазначена група приймає значення, визначені у R, у випадку, коли R1 являє собою групу, що містить азот, зазначена група приймає значення, визначені у R1, у випадку, коли X1 являє собою групу, що містить азот, зазначена група приймає значення, визначені у X1, та у випадку, коли X2 являє собою групу, що містить азот, зазначена група приймає значення, визначені у X2. У другому аспекті, даний винахід відноситься до комплексу між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою. У відповідності з кращим варіантом втілення, зазначена аніонна сполука являє собою активну речовину. Переважно, зазначена аніонна сполука являє собою нуклеїнову кислоту. У третьому аспекті, даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що включає комплекс між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою, та щонайменше один фармацевтично прийнятний наповнювач. У четвертому аспекті, даний винахід відноситься до застосування комплексу між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою для доставки або трансфекції зазначеної аніонної сполуки у специфічну фармакологічну ціль, наприклад, орган, тканину або клітину. У відповідності з одним кращим варіантом втілення, зазначена аніонна сполука являє собою активну речовину. Переважно, зазначена аніонна сполука являє собою нуклеїнову кислоту. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На Фігурах 1 - 8 представлені вісім агарозних гелів, отриманих у результаті електрофорезу у гелі, як описано у Прикладі 5. У всіх Фігурах 1 - 8, міРНК(*) та ДНК(*) маркери розподіляють для 5 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 одержання відповідних смуг, що використовують для порівняльних цілей, та перевірки функціонування електрофорезного методу. На Фігурі 1 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси, отримані між полімером 3 у відповідності з даним винаходом та міРНК при різних концентраціях (від 0,5% до 8% за масою). Полімер 3, що не містить нуклеїнової кислоти (0%), використовують як контрольний зразок для перевірки того, що катіонний полімер у відповідності з даним винаходом не заважає визначенню ділянки, що стосується міРНК. На Фігурі 2 представлений агарозний гель, на якому розподіляють: - Комплекси, отримані між полімером 3 у відповідності з даним винаходом та міРНК при концентраціях від 10% до 20% за масою; - полімер 3, що не містить нуклеїнової кислоти (0%), як контрольний зразок для перевірки того, що катіонний полімер у відповідності з даним винаходом не заважає визначенню ділянки, що стосується міРНК; та - полімер 50 (немодифікований глікоген Polglumyt™) як контрольний зразок для перевірки того, що глікоген, не модифікований у відповідності з даним винаходом, є нездатним до комплексування з нуклеїновими кислотами. На Фігурі 3 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси, отримані між полімером 3 у відповідності з даним винаходом та міРНК при різних концентраціях (від 30% до 800% за масою). На Фігурі 4 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси отримані між полімерами 1, 2 та 6 у відповідності з даним винаходом та міРНК при концентраціях 5% та 20% за масою по відношенню до загальної маси кожного полімеру. На Фігурі 5 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси, отримані між полімерами 10, 14 та 15 у відповідності з даним винаходом та міРНК при концентраціях 5% та 20% за масою по відношенню до загальної маси кожного полімеру. На Фігурі 6 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси, отримані між полімерами 8, 12 та 16 у відповідності з даним винаходом та міРНК при концентраціях 5% та 20% за масою по відношенню до загальної маси кожного полімеру. На Фігурі 7 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси, отримані між полімерами 21, 24 та 25 у відповідності з даним винаходом та міРНК при концентраціях 5% та 20% за масою по відношенню до загальної маси кожного полімеру. На Фігурі 8 представлений агарозний гель, на якому розподілені комплекси, отримані між полімерами 20, 23 та 28 у відповідності з даним винаходом та міРНК при концентраціях 5% та 20% за масою по відношенню до загальної маси кожного полімеру. На Фігурі 9 показана титраційна крива для полімерів 2, 3 та 4 у відповідності з даним винаходом, отримана як описано у Прикладі 8. На Фігурі 10 показана титраційна крива для полімерів 4 (у відповідності з даним винаходом) та 18 (контрольний зразок), отримана як описано у Прикладі 8. Детальний опис даного винаходу У даному описі та у Формулі винаходу, що слідує нижче, словосполучення "катіонний полімер" означає полімер із загальним позитивним зарядом, при фізіологічному pH. У даному описі та у Формулі винаходу, що слідує нижче, термін "глікоген" означає, загалом, глюкозний гомополімер, що характеризується високим ступенем розгалуження, у якому глюкозні мономери зв’язані за допомогою α-(1,4) зв’язків у лінійні ланцюги, у той час як відгалуження привиті за допомогою α-(1,6) зв’язків, в основному, але без обмеження, кожні 7-11 глюкозних мономерів, як показано у наступній формулі: OH OH Glu O OH O O HO CH2 Glu O OH n O O O OH O O OH OH OH O O O OH OH OH Glu O n 7-11 7-11 n n CH2 CH2 O O O HO CH2 OH O OH n CH2 OH 50 O O O Glu CH2 CH2 OH Glu OH OH OH CH2 OH Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, вираз "на основі глікогену" використовують, щоб показати, що полімер включає глікогенову структуру, описану вище, яка є 6 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 частково модифікованою з одержанням катіонного полімеру у відповідності з даним винаходом. Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, вираз "повторювана одиниця" означає мономер, який присутній щонайменше один раз у катіонному полімері у відповідності з даним винаходом. Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, вираз "(C1-C6) алкіл" означає лінійну або розгалужену алкільну групу, що містить від 1 до 6 атомів вуглецю, наприклад, метил, етил, пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, втор-пентил, 3-пентил, ізопентил, неопентил, н-гексил, втор-гексил або неогексил. Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, термін "азоцикліл" означає 3- - 7-членне ароматичне або аліфатичне гетероциклічне кільце, що містить щонайменше один N атом, таке як, наприклад, азиридин, пірол, піролін, піролідин, піридин або піперидин. У деяких випадках, зазначене вище гетероциклічне кільце може включати щонайменше другий гетероатом, вибраний з N, O та S, таке як, наприклад тіазол, оксазин або тіазин. Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, термін "комплекс" означає продукт, отриманий шляхом взаємодії катіонного полімеру на основі глікогену у відповідності з даним винаходом з щонайменше однією аніонною сполукою, за допомогою нековалентних взаємодій (наприклад, електростатичних, іонних або ван-дер-Ваальсових взаємодій, водневих зв’язків та подібного). Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, вираз "активна речовина" включає природні, напівсинтетичні або синтетичні молекули, які, після введення, здатні взаємодіяти з біологічними функціональними групами клітини або живого організму та, можливо, модифікуючи зазначену функціональну групу. Активні речовини, які є корисними у відповідності з даним винаходом, таким чином, являють собою молекули із загальним негативним зарядом, іншими словами аніонні молекули, які можуть бути використані для терапії, профілактики або діагностування патологічного стану. Зазначені аніонні молекули можуть бути органічними або неорганічними. Наприклад, вони можуть являти собою органічні аніонні молекули та можуть мати низьку молекулярну масу (наприклад, амінокислоти, сульфаміди або вітаміни) або високу молекулярну масу (наприклад, вакцини, або глюкозаміноглікани, такі як гепарін). Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, термін "нуклеїнова кислота" означає нуклеотидні макромолекули, природного або синтетичного походження, які є двоспіральними або одно-спіральними, та які мають загальний негативний заряд. Зокрема, цей термін включає олігонуклеотиди, РНК (міРНК, длДНК, олРНК, кшРНК, мікроРНК, рРНК, гяРНК, іРНК, тРНК, мяРНК, пре-іРНК, каталітична РНК, антисмислова РНК), ДНК (кДНК, мтДНК, олДНК, длДНК, антисмислова ДНК, плазмідна ДНК). Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, вирази "доставка активної речовини" та "доставляння активної речовини" показують транспортування активної речовини, закомплексованої з катіонним полімером у відповідності з даним винаходом, до специфічної фізіологічної цілі, наприклад, тканини або органу. Для цілей даного опису та Формули винаходу, що слідує нижче, терміни "трансфекція" та "трансфектування" означають введення послідовності нуклеїнових кислот у клітину, зокрема у цитоплазму та/або ядро. Зокрема, даний винахід відноситься до катіонного полімеру на основі глікогену, що включає щонайменше одну повторювану одиницю, вибрану з групи, що включає: (а) OR O * OR O OR 50 55 n * (a) у якій групи R, які можуть бути однаковими або різними, являють собою атом водню; карбоксиметильну групу, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групу, що містить атом азоту, вибрану з таких як NH 2-(C1C6)алкіл, [N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1-C6)алкіл-ді(C1-C6)алкіламоній]-(C1C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіл-аміно]-(C1-C6)алкіл-ді(C1-C6)алкіламоній}-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1C6)алкіл аміно]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіламіно}-(C1-C6)алкіл, [три(C1C6)алкіламоній]-(C1-C6)алкіл, азоцикліл-(C1-C6)алкіл, у яких ланцюги (C1-C6)алкілу, які можуть бути однаковими або різними, є необов’язково заміщеними однією або більше гідроксильними 7 UA 115135 C2 групами; та n являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1; та (b) OR1 O O * X1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 X2 m* (b) у якій R1 вибирають з атому водню; карбоксиметильної групи, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групи, що містить атом азоту, вибраної з таких як: NH2-(C1-C6)алкіл, [N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1C6)алкіл-ді(C1-C6)алкіламоній]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл-ді(C1C6)алкіламоній}-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1C6)алкіламіно}-(C1-C6)алкіл, [три(C1-C6)алкіламоній]-(C1-C6)алкіл, у яких (C1-C6)алкільні ланцюги, які можуть бути однаковими або різними, є необов’язково заміщеними однією або більше гідроксильними групами; X1 та X2, які можуть бути однаковими або різними, являють собою групу -OH або групу, що містить азот, -NHR2, у якій R2 вибирають з таких як: атом водню, (C1-C6)алкіл та H-[NH-(C1C6)алкіл]p-, де p являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1, та (C 1-C6)алкільні групи можуть бути однаковими або різними; та m являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1; за умови, що щонайменше один з R, R1, X1 та X2 являє собою групу, що містить азот, як визначено, відповідно, для кожного з R, R1, X1 та X2 та за умови, що зазначений катіонний полімер на основі глікогену відрізняється від продукту, отриманого шляхом реакції глікогену з N-(3-хлор-2-гідроксипропіл)-триметил-амоній хлоридом, як розкрито, зокрема, у розділі 2.2 статті Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 193-199). Переважно, групи R, які можуть бути однаковими або різними, являють собою атом водню; карбоксиметильну групу, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групу, що містить атом азоту, вибрану з таких як: [N,N-ді(C1C3)алкіламіно]-(C1-C3)алкіл, {[N,N-ді(C1-C3)алкіламіно]-(C1-C3)алкіл-ді(C1-C3)алкіламоній}-(C1-C3)алкіл, {[N,N-ді(C1-C3)алкіламіно]-(C1-C3)алкіламіно}-(C1-C3)алкіл, або [три(C1-C3)алкіламоній]-(C1C3)алкіл, азоцикліл-(C1-C3)алкіл, у яких (C1-C3)алкільні ланцюги, які можуть бути однаковими або різними, є необов’язково заміщеними гідроксильною групою. Переважно, гетероциклічне кільце, що містить щонайменше один N атом, що представляється терміном "азоцикліл", являє собою 5- або 6-членне ароматичне або аліфатичне гетероциклічне кільце, таке як, наприклад, пірол, піролін, піролідин, піридин або піперидин. Переважно, зазначене 5- або 6-членне гетероциклічне кільце включає щонайменше другий гетероатом, вибраний з N, O та S, та представлене, наприклад, діазолом, оксазином та тіазином. Переважно, зазначене гетероциклічне кільце є аліфатичним. Навіть більш переважно, зазначене гетероциклічне кільце являє собою морфолін або піперидин. Більш переважно, групи R, які можуть бути однаковими або різними, являють собою атом водню; карбоксиметильну групу, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групу, що містить атом азоту, вибрану з таких як: N,N-диметиламіноетил, N,N-лиметиламінопропіл, N,N-діетиламіноетил, [(N,N-диметиламіноетил)диметиламоній]етил, [(N,N-диметиламінопропіл)диметил-амоній]пропіл, [(N,N-діетиламіноетил)діетиламоній]-етил, [триметиламоній]-2-гідроксипропіл, піперидил-N-етил або морфолінілN-етил. Переважно, R1 являє собою атом водню; карбоксиметильну групу, необов’язково у формі солі з фармацевтично прийнятною органічною або неорганічною основою; або групу, що містить атом азоту, вибрану з таких як: [N,N-ді(C1-C3)алкіламіно]-(C1-C3)алкіл], {[N,N-ді(C1C3)алкіламіно]-(C1-C3)алкіл-ді(C1-C3)алкіламоній}-(C1-C3)алкіл, {[N,N-ді(C1-C3)алкіламіно]-(C1C3)алкіламіно}-(C1-C3)алкіл або [три(C1-C3)алкіламоній]-(C1-C3)алкіл, у яких (C1-C3)алкільні ланцюги, які можуть бути однаковими або різними, є необов’язково заміщеними гідроксильною групою. Більш переважно, R1 являє собою атом водню або карбоксиметильну групу. 8 UA 115135 C2 5 10 15 20 Переважно, X1 та X2, які можуть бути однаковими або різними, являють собою групу -NHR2, у якій R2 являє собою атом водню або H-[NH-(C1-C4)алкіл]p-, де p являє собою ціле число, більше ніж або рівне 1, та (C1-C4)алкільні групи можуть бути однаковими або різними. Переважно, зазначена група H-[NH-(C1-C4)алкіл]p- являє собою поліетиленімін з молекулярною масою від 50 до 3000 дальтонів та більш переважно з молекулярною масою від 1000 до 2300 дальтонів, спермін (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2), або спермідин (H2N(CH2)4NH(CH2)4NH2). Приклади фармацевтично прийнятних органічних основ включають трометамін, лізин, аргінін, гліцин, аланін, метиламін, диметиламін, триметиламін, етиламін, діетиламін, триетиламін, пропіламін, дипропіламін, трипропіламін, етилендіамін, моноетаноламін, діетаноламін, триетаноламін, гуанідин, морфолін, піперидин, піролідин, піперазин, 1бутилпіперидин, 1-етил-2-метилпіперидин, N-метилпіперазин, 1,4-ди-метилпіперазин, Nбензилфенетиламін, N-метилглюкозамін та тріс(гідроксиметил)амінометан. Приклади фармацевтично прийнятних неорганічних основ включають гідроксиди або карбонати лужних металів або лужноземельних металів, такі як, наприклад, гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид кальцію, карбонат натрію, карбонат калію та карбонат кальцію. Переважно, зазначені повторювані одиниці (a) та (b) розташовані у довільному порядку у глікогенових ланцюгах. Приклади повторюваних одиниць (a) та (b) представлені, відповідно, у таблицях А та В нижче Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) 6 CH 3 N H 3C O N,N-діетил-аміноетил CH 2 O OH O HO H n OH CH 3 H 3C N 6 O N,N-диметил-аміноетил CH 2 O OH O HO OH 9 H n UA 115135 C2 Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) CH 3 N CH 3 6 N,N-диметил-амінопропіл O CH 2 O OH H O HO n OH N H 3C 6 CH 3 N H 3C + CH 3 [(N,N-діетил-аміноетил)-діетиламоній]етил O CH 2 O OH H O HO n OH CH 3 N CH 3 H 3C + N 6 CH 3 [(N,N-диметил-амінопропіл)диметиламоній]пропіл O CH 2 O OH OH 10 H O HO n UA 115135 C2 Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) CH 3 H 3C N H 3C N 6 + CH 3 [(N,N-диметил-аміноетил)диметиламоній]етил O CH 2 O OH H O HO n OH CH 3 H 3C + N CH 3 6 OH [триметил-амоній]-2-гідроксипропіл O CH 2 O OH H O HO n OH OH CH 2 O OH 2 [триметил-амоній]-2-гідроксипропіл H O HO n O HO H 3C 11 N + CH 3 CH 3 UA 115135 C2 Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) CH 3 N CH 3 6 [(N,N-диметил-амінопропіл)диметил-амоній]пропіл H 3C N + CH 3 O CH 2 O OH H O HO n O 2 N,N-диметил-амінопропіл N CH 3 H 3C 6 [(N,N-діетил-аміноетил)діетиламоній]-етил CH 3 N H 3C N H 3C + CH 3 O CH 2 O O 2,3 H O HO n O N,N-діетил-аміноетил N N CH 3 H 3C CH 3 H 3C OH CH 2 O OH 3 n O N,N-диметил-аміноетил CH 3 N CH 3 12 H O HO UA 115135 C2 Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) CH 3 H 3C N 6 N,N-диметил-аміноетил O CH 2 O OH O HO H n O 3 N,N-діетил-аміноетил N OH O 6 O карбоксиметил CH 2 O OH O HO H n OH O + Na O 6 O карбоксиметил- натрієва сіль CH 2 O OH O HO OH N 6 H n + триметиламоній-2-гідроксипропіл OH O CH 2 O OH O HO O 3 N,N-діетил-аміноетил N 13 H n UA 115135 C2 Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) N 6 [триметил-амоній]-2-гідроксипропіл + OH O CH 2 O OH H O HO n O 3 N [(N,N-діетил-аміноетил)діетиламоній]-етил + N CH 3 N 6 CH 3 N,N-диметил-амінопропіл O CH 2 O OH 2 H O HO карбоксиметил n O O OH CH 3 N CH 3 6 [(N,N-диметил-амінопропіл)диметиламоній]пропіл H 3C N + CH 3 O CH 2 O 3 карбоксиметил натрієва сіль O + Na O 14 H O HO O OH n UA 115135 C2 Таблиця A Приклади повторюваних одиниць (a) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (a) OH O 6 карбоксиметил O CH 2 O OH O HO H n O 2 [триметил-амоній]пропіл N + CH 3 H 3C CH 3 OH CH 2 2 O N,N-діетил-аміноетил Na 3 n O O + H O HO O карбоксиметил натрієва сіль N CH 3 O CH 3 N 6 N-етилпіперидил O CH 2 O OH CH3 O HO n OH O N 6 N-етил-морфолініл O CH 2 O OH OH 15 CH3 O HO n UA 115135 C2 Таблиця B Приклади повторюваних одиниць (b) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (b) OH CH 2 O O HO 2 Спермін OH H n NH H 2N NH NH OH CH 2 O O HO 2,3 NH Спермін n H NH H 2N NH 2 NH NH NH NH OH CH 2 O O HO 2 тетраетилен-пентамін OH n H NH H 2N HN H N NH OH CH 2 O O HO 2,3 NH тетраетилен-пентамін H n NH H 2N NH HN H 2N H N NH N H 16 NH UA 115135 C2 Таблиця B Приклади повторюваних одиниць (b) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (b) OH O 6 Карбоксиметил O CH 2 O O HO OH 2 H n NH тетраетилен-пентамін H 2N HN H N NH OH O 6 Карбоксиметил O CH 2 O O HO NH n H NH H 2N 2,3 Спермін NH 2 NH NH NH NH OH CH 2 O 2 Поліетилен-імін (ММ = 1300 Да) O HO H n OH NH H N p NH 2 OH CH 2 O 3 Поліетилен-імін (MМ = 2000 Да) O HO NH 2 NH N H 17 H n p OH UA 115135 C2 Таблиця B Приклади повторюваних одиниць (b) Положення замісника Замісник Повторювана одиниця формули (b) OH 2 O Поліетилен-імін O CH 2 O 6 Карбоксиметил H O HO n OH NH H N p NH 2 N 2 Поліетилен-імін O CH 2 O O HO 6 N,N-Діетил-аміноетил H n OH NH H N p 5 10 15 20 25 30 NH 2 У відповідності з кращим варіантом втілення, зазначені повторювані одиниці (a) та (b) включають щонайменше одну групу, що містить азот, яка є здатною до іонізації при фізіологічному pH, та яка сприяє комплексуванню зазначеної аніонної сполуки, та щонайменше одну групу, що містить азот, яка є здатною до іонізації при pH нижче фізіологічного pH, та яка сприяє вивільненню комплексу з ендосом. Переважно, зазначені групи, що містять азот, які є здатними до іонізації при фізіологічному pH, присутні у числовому відсотковому виразі від 1% до 30% по відношенню до загальної кількості гідроксильних груп у глікогені, що використовують для одержання катіонних полімерів у відповідності з даним винаходом. Переважно, зазначені групи, що містять азот, які є здатними до іонізації при pH нижче фізіологічного pH, присутні у числовому відсотковому виразі від 0,1% до 10% по відношенню до загальної кількості гідроксильних груп у глікогені, що використовують для одержання катіонних полімерів у відповідності з даним винаходом. Для цілей даного винаходу, зазначені групи, що містять азот, які є здатними до іонізації при фізіологічному pH, включають NH2-(C1-C6)алкіл, [N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, NH2-[(C1C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіл, {[N,N-ді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C6)алкіламіно}-(C1-C6)алкіл та азоцикліл-(C1-C6)алкіл. Переважно, зазначені групи, що містять азот, які є здатними до іонізації при pH нижче фізіологічного pH, включають NH2-{[(C1-C3)алкіл]-ді(C1-C6)алкіламоній}-(C1-C6)алкіл та {[N,Nді(C1-C6)алкіламіно]-(C1-C3)алкіл-ді(C1-C6)алкіл-амоній}-(C1-C6)алкіл. Переважно, нові катіонні похідні глікогену у відповідності з даним винаходом мають низьку в’язкість та, отже, можуть бути сформульовані у фармацевтичні композиції для ін’єкційного застосування. Зокрема, нові катіонні похідні глікогену у відповідності з даним винаходом мають в’язкість, менше ніж 10 мПз та переважно менше ніж 5 мПз, що вимірюють при концентрації 1% у PBS за допомогою роторного віскозиметру. Глікоген, що використовують для одержання катіонних полімерів у відповідності з даним винаходом, може бути отриманий у відповідності з одним зі способів, відомих у даній галузі техніки. 18 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно, глікоген отримують як описано у міжнародній патентній заявці WO 94/03502. Переважно, зазначений глікоген отримують з видів Mytilus edulis та Mytilus galloprovincialis. Інші джерела глікогену, які можуть бути використані для цілей даного винаходу, включають молюсків, таких як устриці та Crepidula fornicata, та багаті на глікоген органи хребетних тварин, такі як печінка та м’язи. Переважно, зазначений глікоген є по суті вільним від сполук, що містять азот та редукуючі цукри. Як використано у даному описі та у Формулі винаходу, що слідує нижче, вираз "по суті вільні від сполук, що містять азот та редукуючі цукри" означає, що вміст азоту становить менше, ніж 60 ppm, що вимірюють за допомогою методу Кієдаля (Kieldahl method), та вміст редукуючих цукрів становить менше, ніж 0,25%, що вимірюють за допомогою методу F.D. Snell та Snell (“Colorimetric Methods of Analysis”, New York, 1954, vol. III, p. 204). Переважно, глікоген, що використовують у відповідності з даним винаходом, також характеризується вмістом вуглецю від приблизно 44% до приблизно 45%, молекулярною масою 6 20 приблизно (2,5±0,1)×10 дальтонів та обертанням площини поляризації (α) D 197±2,0 (c = 1, у воді). Більш переважно, глікоген, що використовують у відповідності з даним винаходом, являє TM собою глікоген Polglumyt , вироблений Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A.C.R.A.F. S.p.A. Спеціаліст, кваліфікований у даній галузі техніки, легко зрозуміє, що даний винахід не стосується нових класів сполук з терапевтичною ефективністю per se. Скоріше даний винахід відноситься до застосування катіонного полімеру на основі глікогену, як описано вище, для утворення комплексу з щонайменше однією аніонною сполукою. У другому аспекті, даний винахід відноситься до комплексу між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою, у якому зазначений катіонний полімер на основі глікогену включає щонайменше одну повторювану одиницю, вибрану з групи, що складається з (a) та (b), описаних вище. Переважно, зазначена аніонна сполука є органічною або неорганічною, з низькою молекулярною масою або високою молекулярною масою. Більш переважно, зазначена аніонна сполука являє собою активну речовину, що належить, наприклад, до одного з наступних класів: протиінфекційні агенти, наприклад, антибіотики та противірусні агенти; аналгетичні засоби; анорексигенні засоби; протигельмінтні засоби; протиастматичні засоби; протисудомні засоби; антидепресанти; антидіабетичні засоби; протидіарейні засоби; антигістамінні засоби; протизапальні засоби; антигемікранійні агенти; протиблювотні агенти; протипухлинні засоби; антипаркінсонічні засоби; протисверблячні агенти; антипсихотичні засоби; жарознижувальні засоби; антиспазмолітичні засоби; антихолінергічні агенти; симпатоміметичні засоби; ксантинові похідні; лікарські засоби для серцево-судинної системи, наприклад, калій, блокатори кальцієвих каналів, бета блокатори, альфа блокатори та антиаритмічні засоби; антигіпертензивні засоби; діуретики та антидіуретичні засоби; центральні та периферичні вазодилататори; стимулятори центральної нервової системи; судинозвужуючі засоби; антитуссивні агенти; протизастійні засоби; гормони; снотворні засоби; імунодепресанти; м’язові релаксанти; парасимпатолітичні агенти; психостимулюючі агенти; заспокійливі засоби; транквілізатори. У відповідності з кращим варіантом втілення, зазначена аніонна сполука являє собою нуклеїнову кислоту. Переважно, зазначену нуклеїнову кислоту вибирають з таких як: олігонуклеотиди, РНК (міРНК, длДНК, олРНК, кшРНК, мікроРНК, рРНК, гяРНК, іРНК, тРНК, мяРНК, pre-іРНК, каталітична РНК, антисмислова РНК) та ДНК (кДНК, мтДНК, олДНК, длДНК, антисмислова ДНК, плазмідна ДНК). Заявник виявив, що зазначений комплекс здатний утворювати на наномерні частинки із середнім діаметром (Z) від 1 до 200 нм, переважно від 20 до 100 нм та більш переважно від 30 до 50 нм. У відповідності з кращим варіантом втілення, зазначений комплекс включає кількість зазначеної аніонної сполуки від 5% до 60% за масою по відношенню до маси зазначеного катіонного полімеру на основі глікогену. Переважно, зазначений комплекс включає кількість зазначеної аніонної сполуки від 10% до 50% за масою по відношенню до маси зазначеного катіонного полімеру на основі глікогену. Більш переважно, зазначений комплекс включає кількість зазначеної аніонної сполуки від 10% до 30% за масою по відношенню до маси зазначеного катіонного полімеру на основі глікогену. Комплекс між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою переважно 19 UA 115135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 може бути одержаний у вигляді фармацевтичної композиції. У третьому аспекті, даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що включає комплекс між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою та щонайменше один фармацевтично прийнятний наповнювач, у якій зазначений катіонний полімер на основі глікогену включає щонайменше одну повторювану одиницю, вибрану з групи, що складається з (a) та (b), описаних вище. У одному переважному варіанті втілення, зазначена аніонна сполука являє собою нуклеїнову кислоту. Термін "наповнювач" означає будь-який агент, відомий у даній галузі техніки, який підходить для одержання фармацевтичної форми. Приклади наповнювачів, які є підходящими у відповідності з даним винаходом, включають: консерванти, стабілізатори, поверхнево-активні речовини, солі для регулювання осмотичного тиску, емульгатори, підсолоджувачі, ароматизатори, барвники та подібні. Зазначена фармацевтична композиція може бути одержана у одиничній лікарській формі у відповідності із способами, відомими у даній галузі техніки. Переважно, зазначена фармацевтична композиція призначена для ін’єкційного застосування, така як, наприклад, водний розчин, суспензія або емульсія, або може бути у формі порошку, який необхідно відновити для одержання водного розчину, суспензії або емульсії для внутрішньовенного, внутрішньом’язового, підшкірного, крізьшкірного або внутрішньочеревинного введення. Альтернативно, зазначена фармацевтична композиція може бути, наприклад, у формі таблетки, капсули, покритих таблеток, гранул, розчинів та сиропів для перорального введення; медичних пластирів, розчинів, паст, кремів або помад для крізьшкірного введення; супозиторіїв для ректального введення; стерильного розчину для аерозольного введення; для негайного та уповільненого вивільнення. У четвертому аспекті, даний винахід відноситься до застосування комплексу між катіонним полімером на основі глікогену та аніонною сполукою, для доставки або переносу зазначеної аніонної сполуки до специфічної фармакологічної цілі, наприклад, органу, тканини або клітини, де зазначений катіонний полімер на основі глікогену включає щонайменше одну повторювану одиницю, вибрану з групи, що складається з (a) та (b), описаних вище. У відповідності з кращим варіантом втілення, зазначена аніонна сполука являє собою активну речовину. Переважно, зазначена аніонна сполука являє собою нуклеїнову кислоту. Переважно, зазначена фармакологічна ціль являє собою клітину. У кращому варіанті втілення, катіонний полімер на основі глікогену у відповідності з даним винаходом може бути кон’югований, безпосередньо або через спейсер, із спрямовуючою групою, яка здатна зв’язувати високо специфічним способом ціль, що знаходиться на поверхні клітини, та сприяти абсорбції комплексу у специфічну клітину (наприклад, пухлинні клітини, печінкові клітини, гематопоетичі клітини та подібні). Спрямовуюча група також може бути використана для спрямування катіонного полімеру у певну частину клітини (наприклад, ядро, мітохондрія та подібні). Спрямовуючі групи можуть бути вибрані, наприклад, з фолієвої кислоти, моносахаридів, алігосахаридів, пептидів, білків та олігомерів гіалуронової кислоти. Наступні приклади призначені для ілюстрації даного винаходу, однак, не обмежуючи його будь-яким шляхом. ПРИКЛАДИ Приклад 1 Одержання катіонних полімерів на основі глікогену, що включають одиницю (a) (i) Синтез катіонних полімерів на основі глікогену, що включають групи, які містять азот 10 г глікогену Polglumyt™ (61,73 ммоль глюкози) розчиняють у 124 мл 1н. NaOH (для синтезу продуктів 1-7, 9-11 та 13-15) або 2н. NaOH (для синтезу продуктів 8, 12 та 16) у двогорлій круглодонній колбі, оснащеній магнітною мішалкою та зворотним холодильником. Коли розчинення завершується, суміш нагрівають до 70 °C та перемішують впродовж 2 годин. В залежності від бажаного продукту, додають один з наступних реагентів (I) - (VI) у кількостях (що виражають як ммоль реагенту), представлених у Таблиці 1: (I) 2-хлор-N,N-діетилетиламіну гідрохлорид; (II) 3-хлор-N,N-диметилпропіламіну гідрохлорид; (III) 2-хлор-N,N-диметилетиламіну гідрохлорид; (IV) розчин 3-хлор-2-гідроксипропілтриметиламонію хлориду при 60% за масою у H2O; (V) 1-(2-хлоретил)піперидин; та (VI) 4-(2-хлоретил)морфолін. 20 UA 115135 C2 5 10 Суміш перемішують при 70 °C впродовж ночі. На наступний день, нагрівання зупиняють та суміші дають охолонути до кімнатної температури. Сирий реакційний продукт потім повільно виливають у 400 мл ацетону. Після завершення додавання, отриману суспензію перемішують впродовж приблизно 30 хвилин. Після зупинення перемішування, суміш залишають осісти до відділення надосадової рідини та одержання осаду. Надосадову рідину відкидають та отриманий осад промивають двічі ацетоном (200 мл). Отриману таким чином тверду речовину відфільтровують, розчиняють у 200 мл дистильованої води, доводять до нейтрального pH за допомогою 1н. HCl розчину та нарешті піддають діалізу у пробірках з регенерованою целюлозою (граничне значення 15000) проти дистильованої води, поки провідність не стане сталою (рівна приблизно 2-3 мкСм, де См - сіменс). Отриманий розчин фільтрують через 0,45 мкм фільтр, концентрують у вакуумі та нарешті сушать сублімацією. Виходи синтезу зібрані у Таблиці 1 нижче. 15 Таблиця 1 Клас Діетиламіноетил (DEAE) глікоген Диметил-амінопропіл (DMAP) глікоген Диметил-аміноетил (DMAE) глікоген 2-Гідроксипропіл-триметиламоній (2-OH-PTMA) глікоген гетероциклічна похідна глікогену 20 25 Полімер № Реагент 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 40 41 (I) (I) (I) (I) (II) (II) (II) (II) (III) (III) (III) (III) (IV) (IV) (IV) (IV) (V) (VI) ммоль реагенту 2,65 15,43 30,87 61,73 15,43 30,87 61,73 123,46 15,43 30,87 61,73 123,46 15,43 30,87 61,73 123,46 30,87 30,87 Вихід % (М/М) 82 80 80 82 82 83 80 82 81 80 83 80 83 84 82 84 83 80 За допомогою описаного способу отримують катіонні полімери 1-16 та 40-41, що мають структури, проілюстровані у Таблиці 2 нижче. У представлених структурах, абревіатура "Glu” означає, що полімерний ланцюг може продовжуватися повторюваними одиницями немодифікованої глюкози або повторюваними одиницями у відповідності з даним винаходом. Крім того, для полегшення візуалізації, відгалуження не представлені та замісники показані тільки у положенні 6 та на різних повторюваних одиницях. Спеціаліст, кваліфікований у даній галузі техніки, легко зрозуміє, що та сама повторювана одиниця може містити від одного до трьох замісників, які можуть бути однаковими або різними, та що ці замісники можуть бути незалежно присутніми у положеннях 2, 3 та/або 6. 21 UA 115135 C2 Таблиця 2 Клас Полімер № Структурна формула H3C N CH3 1 ClH3C N (DEAE) Глікоген H3C CH3 CH3 2 3 O OH O Glu N+ O Glu O O OH OH OH OH O O O O O OH OH n O O OH n OH n Glu n N 4 5 N + N (DMAP) Глікоген O O O OH OH O O O n n O n OH OH OH 6 O O O OH OH Glu H2C H2C CH2 CH2 7 O OH O Glu Cl Glu OH 8 n N N (DMAE) Глікоген 10 OH Glu O O Glu O O O O n n + O n OH OH Cl 11 OH OH OH (2-OHPTMA) Глікоген H2C O O OH O O H2C CH2 CH2 OH Glu OH n CH3 13 14 OH O Glu O O Glu H2C O O n n O n OH OH OH 15 OH OH O O O O O OH OH OH H2C CH2 CH2 OH Glu n O Гетероциклічна похідна глікогену OH OH Glu O OH O n O δ ppm 1.65-2.35 (мультиплет), 2.63.15 (мультиплет), 3.55-4.45 (мультиплет), 5.26.15 (мультиплет H аномерний) 41 δ ppm 2.8-3.1 (мультиплет), 3.64.45 (мультиплет), 5.2-6.1 (мультиплет H аномерний) O HO OH O n HO Glu n O N O Glu O Glu OH O OH OH O OH 5 δ ppm: 3.45-4.5 (мультиплет), 5.256.1 (мультиплет H аномерний) 40 OH O O δ ppm: 2.5-4.6 (мультиплет), 5.26.2 (мультиплет H аномерний) 16 N Glu δ ppm: 1.45-1.75 (CH3 мультиплет), 3.2-4.6 (мультиплет), 5.26.1 (мультиплет) δ ppm: 1.25-1.75 (CH3 мультиплет), 2.8-4.6 (мультиплет), 5.26.1 (мультиплет) δ ppm: 2.2-4.5 (мультиплет), 5.26.1 (мультиплет H аномерний) δ ppm: 2.2-4.4 (мультиплет), 5.26.1 (мультиплет H аномерний) 12 N OH H-ЯМР 9 + N Cl O 1 O n O OH OH O n O HO Glu n (ii) Синтез катіонних полімерів на основі глікогену, що включають групи, які містять азот та карбоксиметильні групи Глікоген Polglumyt™, що містить щонайменше одну карбоксиметильну групу (Глікоген-CM), був синтезований як описано нижче. 9,57 г (59,07 ммоль глюкози) безводного глікогену Polglumyt™, завчасно висушеного у печі 22 UA 115135 C2 5 10 15 при 60 °C у вакуумі до сталої маси, поміщають у двогорлу круглодонну колбу, оснащену магнітною мішалкою та під струменем азоту, та розчиняють у 200 мл безводного диметилсульфоксиду. Коли розчинення завершується, гідрид натрію додають у кількостях, показаних у Таблиці 3, та цю суміш перемішують впродовж 1 години при кімнатній температурі. Далі, хлорацетат натрію додають у кількостях, показаних у Таблиці 3, та цю суміш перемішують впродовж ночі при кімнатній температурі. На наступний день, суміш повільно виливають у ацетон (800 мл) та отриману суспензію перемішують впродовж приблизно 30 хвилин. Отриману тверду речовину відфільтровують, промивають двічі ацетоном (400 мл), знову відфільтровують та розчиняють у дистильованій воді (200 мл). Отриманий розчин піддають діалізу у пробірках з регенерованою целюлозою (граничне значення 15000) проти дистильованої води, поки провідність не стане сталою (рівна приблизно 2-3 мкСм). Отриманий розчин фільтрують через 0,45 мкм фільтр, концентрують у вакуумі та нарешті сушать сублімацією. Ступінь дериватизації (DD), що розуміють як кількість глюкозних молекул, дериватизованих карбоксиметильною групою, на 100 глюкозних мономерів, визначають за допомогою ІЧ спектроскопії, шляхом створення калібрувальної кривої з сумішами, що містять відомий титр глікогену Polglumyt™ та ацетат натрію. Таблиця 3 Глікоген-CM 100 101 102 103 104 20 25 30 35 40 45 50 ммоль NaH 5,91 11,82 17,72 23,63 29,54 ммоль ClCH2COONa 6,50 13,00 19,49 25,99 32,49 Вихід % (М/М) 83 80 78 75 74 DD 1 14 22 32 39 Отриманий таким чином глікоген-CM використовують у наступних синтезах для одержання катіонних полімерів, що містять азотні групи. Глікоген-CM, що містить діетиламіноетильні (DEAE-глікоген-CM) та 2гідроксипропілтриметиламонійні (2-OH-PTMA-глікоген-CM) групи, синтезують таким чином. DEAE-глікоген-CM 1 г продукту 103 розчиняють у 10,8 мл 1н. NaOH у двогорлій круглодонній колбі, оснащеній магнітною мішалкою та зворотним холодильником, та нагрівають при 70 °C впродовж 2 годин. 0,929 г 2-хлор-N,N-діетилетиламіну гідрохлориду (5,4 ммоль) додають та цю суміш перемішують впродовж ночі при 70 °C. На наступний день, нагрівання припиняють та цю суміш залишають охолонути до кімнатної температури. Сирий реакційний продукт потім повільно виливають у 100 мл ацетону. Після закінчення додавання, отриману суспензію перемішують впродовж 30 хвилин. Отриману тверду речовину відфільтровують, промивають двічі ацетоном (100 мл), розчиняють у 50 мл дистильованої води, доводять до pH 6,5-7 за допомогою 1н. соляної кислоти, та нарешті піддають діалізу у пробірках з регенерованою целюлозою (граничне значення 15000) проти дистильованої води поки провідність не стане сталою (рівна приблизно 2-3 мкСм). Отриманий розчин фільтрують через 0,45 мкм фільтр, концентрують у вакуумі та нарешті сушать сублімацією. Отриманий розчин фільтрують через 0,45 мкм фільтр, концентрують у вакуумі та нарешті сушать сублімацією. 2-OH-PTMA-глікоген-CM 2,5 г продукту 103 розчиняють у 27 мл 1н. NaOH у двогорлій круглодонній колбі, оснащеній магнітною мішалкою та зворотним холодильником, та нагрівають при 70 °C впродовж 2 годин. Далі додають розчин 3-хлор-2-гідроксипропілтриметиламоній хлориду (60% за масою у H 2O, = 8,1 ммоль) та цю суміш перемішують при 70 °C впродовж ночі. На наступний день, нагрівання припиняють та цю суміш залишають охолонути до кімнатної температури. Сирий реакційний продукт потім повільно виливають у 80 мл ацетону. Отриману тверду речовину відфільтровують, промивають двічі ацетоном (80 мл), розчиняють у 50 мл дистильованої води та піддають діалізу у пробірках з регенерованою целюлозою (граничне значення 15000) проти дистильованої води, поки провідність не стане сталою (рівна приблизно 2-3 мкСм). Отриманий розчин фільтрують через 0,45 мкм фільтр, концентрують у вакуумі та нарешті сушать сублімацією. 23 UA 115135 C2 5 10 Катіонні полімери 17 та 19, отримані за допомогою описаних способів, показані у Таблиці 4 нижче. Для полегшення візуалізації, відгалуження не показані, та замісники показані тільки у положенні 6 та на різних повторюваних одиницях. У представлених структурах, абревіатура "Glu” означає, що полімерний ланцюг може продовжуватися повторюваними одиницями немодифікованої глюкози або повторюваними одиницями у відповідності з даним винаходом. Спеціаліст, кваліфікований у даній галузі техніки, легко зрозуміє, що та сама повторювана одиниця може мати від одного до трьох замісників, які можуть бути однаковими або різними, та що ці замісники можуть бути незалежно присутніми у положеннях 2, 3 та/або 6 тієї ж повторюваної одиниці. Таблиця 4 Клас Полімер № Структурна формула H3C O DEAEГлікогенCM N H3C CH3 O O Glu O O n n Cl + O n OH OH OH n CH3 O- Na+ 25 30 OH O O n n OH O n OH O OH Glu n Приклад 2 Одержання катіонних полімерів на основі глікогену, що містять одиницю (b) Глікоген Polglumyt™ окислюють перйодатом калію у відповідності з наступним способом. 20 г глікогену Polglumyt™ (123,46 ммоль глюкози) розчиняють у 400 мл дистильованої води у пляшці з темного скла. Перйодат калію додають у кількостях, представлених у Таблиці 5 (виражені у ммоль реагенту) та цю суміш перемішують впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі. Реакцію зупиняють шляхом додавання надлишку етилен-гліколю (26 мл) з безперервним перемішуванням впродовж 2 годин при кімнатній температурі. Цю суміш піддають діалізу у пробірках з регенерованою целюлозою (граничне значення 15000) проти дистильованої води, поки провідність не стане сталою (рівна приблизно 2-3 мкСм). Цю суміш потім фільтрують через 0,45 мкм фільтр та сушать сублімацією. Далі, ступінь окислення (% окислених глюкозних мономерів) визначають шляхом титрування з 0,1н. NaOH соляної кислоти, що вивільнюється у процесі реакції між гідроксиламіну гідрохлоридом та вільними альдегідними групами, що присутні на різних карбогідратах. Реакція представлена нижче: глікоген-(CH=O)z + z·H2N-OH*HCl = глікоген-(CH=N-OH)z +z·H2O +z·HCl Відсоток окислених мономерів визначають за допомогою наступної формули: DD  35 O OH OH OH O H2C O O O O H2C CH2 CH2 OH 20 H2C OH O O O Glu 15 C CH4 OH Glu 19 Glu OH N 2-OHPTMAГлікогенCM δ ppm: 3,4-4,65 (мультиплет), 5,256,20 (мультиплет H аномерний) OH O O O O OH OH OH Glu 17 O O O CH3 H2C H2C CH2 CH2 O + Cl- N O H2C δ ppm: 1,25-1,75 (мультиплет), 3-4,65 (мультиплет), 5,56,15 (мультиплет H аномерний) CH3 H3C H-ЯМР N Na+ C 1 V  N  0.5  100, W / 162 у якій V = мл NaOH; N = нормальність NaOH; W = мг безводного зразку; 162 = молекулярна маса глюкозної повторюваної одиниці. 24 UA 115135 C2 Таблиця 5 Окислений глікоген a. 200 201 202 5 10 15 20 ммоль KIO4 6,17 12,35 24,69 % вихід (М/М) 88 87 88 DD 5 10 18 Окислений глікоген Polglumyt™, отриманий таким чином, вводять у реакцію з одним з реагентів (VII) - (X) нижче, у кількостях (виражених у ммоль реагенту), представлених у Таблиці 6: (VII) спермін (Fluka, ідентифікаційний номер 85590); (VIII) тетраетиленпентамін (Fluka, ідентифікаційний номер 15652843); (IX) розчин поліетиленіміну ММ 1300 при 50% за масою у воді (Aldrich, ідентифікаційний номер 482595); (X) розчин поліетиленіміну ММ 2000 при 50% за масою у воді (Aldrich, 408700). Ці похідні синтезують у відповідності з наступним загальним способом. 2 г окисленого глікогену Polglumyt™ розчиняють у 200 мл боратного буферу при pH 8,5 у тригорлій круглодонній колбі, оснащеній механічною мішалкою (IKA Labortechnik model). Амін розчиняють у 40 мл боратного буферу, додають повільно до реакційної колби, та цю суміш перемішують механічно при кімнатній температурі. Через 4 години додають боргідрид натрію (473 мг; 12,5 ммоль) та цю суміш перемішують механічно впродовж ночі при кімнатній температурі. На наступний день, сирий реакційний продукт повільно виливають у 400 мл ацетону та отриману суспензію перемішують впродовж 30 хвилин. Отриману тверду речовину відфільтровують, промивають двічі ацетоном (400 мл), знову відфільтровують та розчиняють у дистильованій воді (100 мл). Цей розчин нейтралізують за допомогою 1н. HCl та піддають діалізу у пробірках з регенерованою целюлозою (граничне значення 15000) проти дистильованої води, поки провідність не стане сталою (рівна приблизно 2-3 мкСм). Отриманий розчин фільтрують через 0,45 мкм фільтр та нарешті сушать сублімацією. 25 Таблиця 6 № 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 30 Вихідний окислений глікоген 200 200 200 201 201 201 201 201 202 202 202 реагент VII IX X VII VIII VIII IX X VII IX IX ммоль реагенту 0,60 0,48 0,31 0,60 0,41 0,83 0,48 0,31 1,20 0,48 0,96 % вихід (М/М) 69 84 70 65 70 44 83 87 24 95 98 Катіонні полімери 20-30, отримані за допомогою описаних способів, показані у Таблиці 7 нижче. У показаних структурах, абревіатура “Glu” означає, що полімерний ланцюг може продовжуватися повторюваними одиницями немодифікованої глюкози або повторюваними одиницями у відповідності з даним винаходом. Для полегшення візуалізації, відгалуження не показані, та замісники показані на різних повторюваних одиницях. 25 UA 115135 C2 Таблиця 7 Клас O O OH NH O O O OH O O O 1 Glu 24 H 2C H 2C CH 2 CH 2 OH OH OH Glu Окислений глікоген Полімер № Структурна формула OH n n O OH OH O NH n H 2N Glu OH n NH HN H N NH H 2N NH 25 N H 20 O O Glu O OH NH O O O 1 Окислений глікоген H 2C H 2C CH 2 CH 2 OH OH OH Glu OH O O OH n n O OH OH O NH n OH Glu n 23 H 2N HN HN H N H 2N NH NH N H 28 21 26 O O Окислений Glu глікоген 1 OH OH OH O O OH n NH O O O O H 2C H 2C CH 2 CH 2 OH OH OH Glu n O OH OH n O OH Glu 22 n H N p NH 2 27 29 26 ІЧ 3293 (M), 2926 (W), 1638 (W), 1409 (W), 1359 (W), 1240 (W), 1148 (M), 1078 (M), 1016 (VS), 999 (VS), 930 (M), 848 (M), 759 (M) 3308 (M), 2924 (W), 1639 (W), 1411 (W), 1358 (W), 1243 (W), 1149 (M), 1078 (S), 1016 (VS), 999 (VS), 930 (M), 848 (M), 759 (M) 3306 (M), 2925 (W), 1639 (W), 1411 (W), 1361 (W), 1241 (W), 1148 (M), 1078 (S), 995 (VS), 927 (M), 847 (M), 757 (M) 3293 (M), 2926 (W), 1638 (W), 1412 (W), 1359 (W), 1241 (W), 1148 (M), 1078 (S), 1015 (VS), 929 (M), 848 (M), 759 (M) 3292 (M), 2928 (W), 1639 (W), 1415 (W), 1355 (W), 1243 (W), 1148 (M), 1078 (S), 1015 (VS), 929 (M), 848 (M), 758 (M) 3228 (M), 2924 (W), 1640 (M), 1412 (W), 1361 (W), 1148 (M), 1079 (S), 1015 (VS), 999 (VS), 930 (M), 848 (M), 759 (M) 3298 (M), 2925 (W), 1638 (W), 1411 (W), 1359 (W), 1148 (M), 1079 (S), 1016 (VS), 999 (VS), 930 (M), 848 (M), 759 (M) 3292 (M), 2921 (W), 1643 (W), 1411 (W), 1360 (W), 1148 (M), 1078 (S), 1015 (VS), 998 (VS), 930 (M), 848 (M), 759 (M) 3299 (M), 2924 (W), 1635 (W), 1412 (W), 1358 (W), 1148 (M), 1079 (S), 1016 (VS), 1000 (VS), 930 (M), 847 (M), 759 (M) 3289 (W), 2924 (W), 2840 (W), 1635 (W), 1411 (W), 1336 (W), 1147 (M), 1079 (S), 1016 (VS), 1000 (VS), 930 (M), 848 (M), 758 (M) UA 115135 C2 Таблиця 7 5 10 15 20 Структурна формула Полімер № ІЧ 30 Клас 3276 (M), 2924 (W), 2843 (W), 1634 (W), 1453 (W), 1333 (M), 1146 (M), 1079 (S), 1019 (VS), 1000 (VS), 930 (M), 848 (M), 758 (M) Приклад 3 Визначення ступеню дериватизації (DD) катіонних полімерів, що містять повторювані одиниці типу (a) Ступінь дериватизації, що відноситься до кількості груп, що містять азот, присутній у полімерах, що містять повторювані одиниці (a), розраховують шляхом перетворення амінних груп у відповідний гідрохлорид та шляхом визначення кількості іонів галогену, присутніх або на амінних групах або на четвертинних амонієвих групах. Таку ж саму процедуру застосовують до DEAE-декстрану гідрохлориду (комерційний продукт DEAE-декстрану гідрохлорид, Sigma, ідентифікаційний номер D9885), що використовують як порівняльний продукт. Кількість іонів галогену визначають на сухій масі полімеру, отриманій шляхом вирахування вмісту води, визначеного за допомогою методу Карла Фішера. 1 г амінної похідної розчиняють у 10 мл дистильованої води. Коли розчинення завершується, додають 10 мл 1н. соляної кислоти та цю суміш перемішують впродовж 30 хвилин. Після завершення перемішування, цю суміш виливають у ацетон (100 мл). Отриману тверду речовину відфільтровують, промивають двічі ацетоном (100 мл) та сушать у печі при 60 °C у вакуумі. Кількість іонів галогену виражають як масовий відсоток, тобто як масу іонів галогену на 100 г катіонного полімеру. Для цілей визначення, кожен атом азоту вважається незалежно заміщеним. Ступінь дериватизації розраховують у відповідності з рівнянням, представленим нижче.  H.I. гідратован а маса  100  ММ гідрохлори дний DD   100  %H2O  мономер   / 35,45  / 3  25 30 DD = ступінь дериватизації H.I. = грами атомів галогену на 100 г гідратованого зразку ММ = молекулярна маса мономеру, заміщеного однією алкіламін-гідрохлоридною групою 35,45 = молекулярна маса хлору Отримані результати представлені у Таблиці 8 нижче. Таблиця 8 Полімер № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 DD 1 6 12 22 5 6 12 19 4 7 12 14 3 5 27 UA 115135 C2 Таблиця 8 Полімер № 15 16 18(*) DD 13 15 20 (*) порівняльний продукт: DEAE-декстран 5 10 15 20 25 30 Вплив ступеню дериватизації та функціональної групи дослідили як функцію двох оперативних параметрів: (i) тенденція до агрегації, яка повинна бути мінімізована; та (ii) зарядна ємкість, яка має бути максимізована. Приклад 4 Вимірювання за методом динамічного розсіювання світла (DLS) Дослідження за методом динамічного розсіювання світла використовували для вивчення тенденції до агрегації катіонних полімерів. Дослідження за методом динамічного розсіювання світла проводять як описано нижче на катіонних полімерах на основі глікогену Polglumyt™, отриманого як описано у Прикладі 1, та на відповідних комплексах з міРНК (Invitrogen, ідентифікаційний номер постачальника 1299001), отриманих при різних масових відсоткових співвідношеннях міРНК/полімер. Для досліджень розсіювання світла готують наступні розчини: - розчин 1: вихідний розчин міРНК 0,1 мг/мл, у PBS, що не містить РНази; - розчин 2: вихідний розчин різних катіонних полімерів при концентрації 0,2 мг/мл, у PBS, що не містить РНази, фільтрованому через стерильні 0,22 мкм фільтри; - розчин 3: розчин PBS, що не містить РНази, фільтрований через стерильні 0,22 мкм фільтри. Абревіатура PBS (фосфат-забуферений сольовий розчин) являє собою стандартний фосфат-забуферений сольовий розчин при pH 7,4, що включає водний сольовий розчин хлориду натрію 8 г/л, фосфату натрію 1,78 г/л, хлориду калію 0,2 г/л та фосфату калію 0,27 г/л. Зразки, які аналізують, одержують шляхом змішування розчинів 1, 2 та 3 у відповідності із співвідношеннями, представленими у Таблиці 9. Ці зразки потім обробляють впродовж 30 секунд шляхом перемішування та залишають стояти впродовж 30 хвилин, двічі. Після наступної обробки шляхом перемішування впродовж 30 секунд та стояння впродовж 1 години, зразки аналізують за допомогою DLS Zetasizer Nano Malvern, при цьому необхідно приділити увагу обробці розчинів перемішуванням впродовж 5 хвилин перед аналізом. Вимірювання проводять, використовуючи гелієво-неоновий лазер (λ = 632,8 нм) при 25 °C та при куті розсіювання 173°. Результати обробляють, використовуючи програмне забезпечення Zetasizer. Таблиця 9 міРНК мг/мл 0,050 0,03 0,02 0,015 0,010 0,005 35 Полімер мг/мл 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 мл розчину 1 0,5 0,3 0,2 0,15 0,10 0,05 Композиція мл розчину 2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 мл розчину 3 0,5 0,2 0,3 0,35 0,4 0,45 Це дослідження забезпечує визначення наступних параметрів: 1. середній діаметр (Z) катіонних похідних глікогену Polglumyt™, що не містить міРНК (результати зібрані у Таблиці 10); 2. аспектне співвідношення наночасток (результати зібрані у Таблиці 10); та 3. максимальне масове відсоткове співвідношення міРНК по відношенню до маси полімеру, для якого не спостерігається ніяких явищ агрегації (результати зібрані у Таблиці 10). 28