Нові ад’ювантні композиції

Реферат: Винахід стосується вакцинної композиції, яка містить антигенний компонент та ад'ювантний компонент, де антигенний компонент включає бактерин Escherichia coli J-5, a ад'ювантний компонент містить: а) Quil А, холестерин та DDA, а також принаймні один DEAE декстран та олію, або б) DEAE декстран, ODN, що містить CpG, та олію, UA 114787 C2 (12) UA 114787 C2 а також застосування такої вакцинної композиції для одержання лікарського засобу для лікування або попередження маститу у корів. UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід головним чином стосується нових ад'ювантних препаратів для підсилення імунної відповіді на антигени для використання у імуногенних та вакцинних композиціях, без продукування токсичних або неочікуваних побічної дії у суб'єкті. Цей винахід також стосується способів приготування та використання ад'юванту, імуногенних та вакцинних композицій. Бактеріальні, вірусні, та спричинені паразитами інфекції є широко поширеними у людей та тварин. Хвороби, спричинені цими інфекційними агентами є часто стійкими до антимікробної фармацевтичної терапії, без ефективних засобів лікування. Отже, шлях створення вакцин все частіше використовують для контролю інфекційних захворювань. Цілий інфекційний патоген може бути виконаний придатним для використання у препараті вакцини після хімічної інактивації або відповідної генетичної маніпуляції. Крім того, білкова субодиниця патогену може бути експресована у рекомбінантній системі експресії та очищена для використання у препараті вакцини. Вакцини можуть бути виконані більш дієздатними додаванням у композицію відповідного ад'юванту. Також є підвищений інтерес у застосуванні вакцинології для лікування раку у тварин та людей. Цей терапевтичний підхід до лікування раку полягає у вакцинації пацієнтів, хворих на рак вакциною, що містить специфічний до пухлин антиген та ад'ювант. Проте, жодна з багатьох подібних вакцин не була схвалена регулювальними органами. Не показано, що вакцини здатні зменшувати пухлини, застосування стандартних засобів ліків проти раку є більш дієвим. Термін "ад'ювант" головним чином стосується будь-якого препарату, що збільшує гуморальну або клітинну імунну відповідь на антиген. Ад'юванти використовують для досягнення двох цілей - вони сповільнюють вивільнення антигенів з місця ін'єкції та вони стимулюють імунну систему. Традиційні вакцини головним чином складаються з грубого приготування інактивованих або вбитих, або модифікованих живих патогенних мікроорганізмів. Домішки, пов'язані з цими культурами патологічних мікроорганізмів можуть виступати як ад'ювант для посилення імунної відповіді. Проте, імунітет, викликаний вакцинами, де як антигени використовують гомогенні препарати патологічних мікроорганізмів або очищені білкові субодиниці, часто низький. Отже, становиться необхідним додавання певних екзогенних речовин, таких як ад'юванти. Більш того, виробництво синтетичних та субодиничних вакцин багато коштує. Додавання ад'юванту може дозволити використання поменшеної дози антигену для стимуляції подібної імунної відповіді, таким чином знижуючи ціну виробництва вакцини. Отже, ефективність деяких придатних для введення шляхом ін'єкції лікувальних агентів може бути суттєво підвищена, коли агент є поєднаним з ад'ювантом. Багато факторів повинні бути прийняті до уваги при підборі ад'юванту. Ад'ювант повинен викликати відносно повільний рівень вивільнення та ефективне поглинення антигену з мінімальними токсичними, алергенними, запальними, та іншими неочікуваними проявами в організмі господаря. Бажано, щоб ад'ювант був невіроцидним, здатним до біологічного розпаду, здатним послідовно створювати високий рівень імунітету, здатним стимулювати перехресний захист, сумісним з численними антигенами, дієздатним у численних різновидах, нетоксичним та безпечним для господаря (наприклад, без реакцій у місці ін'єкції). Іншими бажаними характеристиками ад'юванту є здатність до мікродозування, якщо доз недостатньо, чудова стійкість при зберіганні, він повинен піддаватися сушінню, може бути виконаний без додавання олій, може існувати як у твердому, так та у рідкому стані, бути ізотонічним, здатним до легкого виробництва, та недорогим. Зрештою, дуже бажано для ад'юванту бути здатним утворювати різні конфігурації для викликання гуморальної, або клітинної імунної відповіді, або обох, залежно від вимог сценарію вакцинації. Проте, кількість ад'ювантів, що може відповідати вищезгаданим умовам є обмеженою. Вибір ад'юванту залежить від потреб для вакцини, будь-то збільшення розміру або функції відповіді антитіл, збільшення клітинної імунної відповіді, індукції мукозного імунітету, або скорочення дози антигену. Було запропоновано кілька ад'ювантів, проте жоден, як було показано, не був ідеально придатним для всіх вакцин. Перший ад'ювант, описаний у літературі, був повний ад'ювант Фрейнда (FCA), який містить емульсію вода-в-олії та екстракти мікобактерій. На жаль, FCA погано переноситься та може викликати неконтрольоване запалення. Після відкриття FCA більш ніж 80 років тому були зроблені зусилля по скороченню небажаної побічної дії ад'ювантів. Деякі інші речовини, використані як ад'юванти охоплюють оксиди металів (наприклад, гідроксид алюмінію), галуни, неорганічні хелати солей, желатини, різні олії типу парафіну, синтезовані камеді, альгінати, мукоїдні та полісахаридні сполуки, казеїнати, та речовини, що було отримано з крові, такі як згустки фібрину. Хоча ці речовини є головним чином дієздатними у стимулюванні імунної системи, жодна з них не була повністю прийнятною через шкідливі 1 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прояви у організмі хазяїна (наприклад, створення стерильних абсцесів, пошкодження органу, канцерогенність, або алергенні реакції) або через неочікувані фармацевтичні властивості (наприклад, швидке розповсюдження або поганий контроль розповсюдження з місця ін'єкції, або набрякання речовини). Синтетичні олії та похідні нафти теж мали використання як ад'юванти, тому що вони проявляли відносно повільне розповсюдження у тілі хазяїна, але вони могли себе несподівано проявляти, так як вони часто розпадаються на ароматичні вуглеводні, які можуть бути канцерогенними. Більш того, деякі з цих речовин, як було виявлено, були здатні створювати стерильні абсцеси та не можуть бути повністю усунені організмом. Олії, коли вони є відповідно відібраними та виготовленими у відповідних концентраціях можуть бути відносно безпечними та нетоксичними. Сапоніни, отримані з кори південноамериканського дерева Quillaja saponaria деякий час теж використовувалися як ад'юванти. Див. Lacaille-Dubois, M та Wagner H. (A review of biological та pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386. 1996). Багато ветеринарних вакцин, що використовують зараз, містять Quil А, який є фракцією сапоніну з кори південноамериканського дерева Quillaja saponaria molina. Подальшим розділенням на фракції Quil А було отримано субфракції, що охоплюють QS-7, QS-17, QS-18, та QS-21. (Див. U. S. Pat. No. 5, 057, 540) Використання сапонінів як ад'ювантів пов'язано з численними незручностями. Сапоніни є розчинними, тому стимулюють виникнення неспецифічної імунної відповіді. Метою вакцинології, проте, є стимулювання цілеспрямованої відповіді на специфічний антиген або антигени. Сапоніни мають сильну взаємну прихильність до холестерину. Вони утворюють комплекс з холестерином, знайденим у клітинних мембранах, що спричиняє гемоліз клітини. Вони, як також було показано, викликають некроз у місці ін'єкції та їх важко зробити у вигляді окремих структур. При використанні у вакцинах, що містять модифіковані живі віруси у оболонці, сапоніни порушують вірусну оболонку та таким чином інактивують вірусні антигени. Для подолання гемолітичної та віроцидної властивостей Quil А, він був поєднаним з холестерином та фосфоліпідами, та була створена специфічна структура, знана як імуностимуляторний комплекс (ISCOM) або матриця ISCOM (ISCOMATRIX). Див. Ozel М., et. al.; J. Ultrastruc. та Molec. Struc. Re 102, 240-248 (1989). ISCOMи, коли вони є поєднаними з антигеном, головним чином викликають Th1 цитотоксинову Т-клітинну відповідь. Проте, хоча гемолітичні властивості Quil А були значно знижені, комбінування Quil А з холестерином не повністю їх усуває. Іншім обмеженням ISCOMів є те, що білок антигену повинен мати гідрофобні домени, достатньо великі для взаємодії з ISCOM для того, щоби приєднатися до нього. Білок який є високо гідрофільним не може бути приєднаним до ISCOM. Крім того, ISCOMи можуть стимулювати неочікувану автоімунну реакцію у суб'єкта. Імуномодулятори можуть бути використані як ад'юванти, наприклад, диметилдиоктадециламонію бромід (надалі, "DDA"), та авірдин. DDA - ліпофільна четвертинна сполука амонію (амін) з двома 18 карбоновими алкіловими ланцюгами та двома метильними групами, пов'язаними з позитивно зарядженою четвертинною молекулою амонію з молекулярною масою 631. Його використання як ад'юванту було відкрито Gall, (Immunol. V. 11, p. 369, 1966). DDA, як описано, стимулює сильні клітинні імунні відповіді, та також, як було показано, викликає гуморальні імунні відповіді. Крім того, було опубліковано багато документів, де показана ефективність DDA як ад'юванту для білкових антигенів, гаптенів, пухлин, вірусів, найпростіших та бактерій. (Див. Korsholm, К S., et al., Immunology, vol. 121, pp. 216-226, 2007.) Більшість досліджень було зроблено на лабораторних тваринах, поки тільки декілька досліджень було проведено на великих тваринах, таких як курчата (Див. Katz, D., et al. FEMS Immunol Med Microbiol. Vol 7(4):303-313, 1993.), свині, та велика рогата худоба. DDA є ефективним для викликання реакції гіперчутливості уповільненого типу (DTH) як у лабораторних тварин, так та у великих тварин. Проте, він погано розчиняється у воді. Полімери також використовують як ад'юванти, наприклад, діетил-аміноетил (ОЕАЕ)декстран, поліетиленгліколь, та поліакрилова кислота (наприклад, CARBOPOL®). Полісахарид DEAE-декстран, як відомо, є дуже сильним ад'ювантом. Проте, його дія пов'язана з неприпустимою реактогенністю. Полімери CARBOPOL® є полімерами акрилової кислоти, зшитими з поліалкеніловими естерами або дивінілгліколем. CARBOPOL® використовується у деяких вакцинах, але його використання як ад'юванту не засвідчено. Деякі ад'юванти, як показано, стимулюють Тh2 відповідь, наприклад N-(2-деокси-2-Lлейциламіно-b-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканоламіду гідроацетат, також відомий під торговельною маркою Bay R1005®, коли він є у формі ацетату та алюмінію. Bay R1005® у комбінації з очищеною вірусною вакциною або субодиничною вакциною приводить до 2 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підвищення виробництва антитіл у мишей, інфікованих вірусами. Доклінічні випробування на інших видах тварин (свині, вівці, коні) дали порівнянні результати відносно виробництва антитіл. Підвищення синтезу антитіл, яке викликано Bay R1005® особливо залежить від антигену та не є результатом поліклональної стимуляції. Перед цим винаходом не було у наявності такого препарату ад'юванту, який би мав широкий діапазон бажаних характеристик, що повинен мати ідеальний ад'ювант. Були зроблені зусилля, щоб знайти нові ад'юванти для вакцин, що можуть подолати недоліки традиційних ад'ювантів. Зокрема, дуже бажано було створити ад'ювант, що викликає потужні клітинні та гуморальні імунні відповіді до широкого ряду антигенів у людей та тварин, проте не має побічної дії та труднощів приготування, властивих звичайним ад'ювантам. Цей винахід стосується нових ад'ювантних, імуногенних, та вакцинних композицій. Зокрема, цей винахід стосується ад'ювантних препаратів, що містять Th1 ад'юванти, імуномодулятори, полімери, та Тh2 ад'юванти. Цей винахід також стосується імуногенних та вакцинних композицій, що містять такі ад'ювантні препарати та один або більше антигенів, так само, як і способи приготування ад'ювантних та вакцинних композицій. У одному втіленні, ад'ювантні композиції охоплюють комбінацію сапоніну, стеролу, та четвертинної сполуки амонію. У одному втіленні, сполука ад'юванту містить Quil А, холестерин та DDA. У іншому втіленні, ад'ювантні композиції складаються з комбінації сапоніну, стеролу, четвертинну сполуку амонію та полімеру. У одному втіленні, сполука ад'юванту - Quil А, холестерин, DDAта поліакрилова кислота. У іншому втіленні, ад'ювантні композиції складаються з комбінації сапоніну, стеролу, четвертинну сполуку амонію, полімеру та глюколіпіду. У одному втіленні, сполука ад'юванту Quil А, холестерин, DDA, поліакрилова кислота та Bay R1005®. У одному втіленні, імуногенна композиція, що містить препарат ад'юванту та імунологічну ефективну кількість антигену, де препарат ад'юванту, що охоплює сапонін, стерол, четвертинні сполуки амонію, та полімер, є отриманою способом, що полягає у: a) приготуванні сполуки антигену у буфері, b) додаванні сапоніну до сполуки за п. а; c) додаванні стеролу до сполуки за п. b; d) додаванні четвертинної сполуки амонію до сполуки за п. с; e) додаванні полімеру до сполуки за п. d. У одному втіленні цього процесу, сапонін - Quil А, стерол - холестерин, четвертинна сполука амонію - DDA, та полімер - поліакрилова кислота. У одному втіленні, вакцина, що містить препарат ад'юванту та імунологічну ефективну кількість антигену, де препарат ад'юванту містить сапонін, стерол, четвертинні сполуки амонію, полімер, та глюколіпід є отриманою способом, що полягає у: a) приготуванні композиції антигену у буфері, b) додаванні сапоніну до сполуки за п. а; c) додаванні стеролу до сполуки за п. b; d) додаванні четвертинної сполуки амонію до сполуки за п. с; e) додаванні полімеру до сполуки за п. d, та f) додаванні глюколіпіду до сполуки за п. e. У одному втіленні цього процесу, сапонін - Quil А, стерол - холестерин, четвертинна сполука амонію - DDA, полімер - поліакрилова кислота, та глюколіпід - Bay R1005®. Було встановлено, що вищезгадані ад'ювантні композиції мають несподівані та неочікувані властивості понад того, що можна було б очікувати від такої комбінації. Було несподівано знайдено, що віроцидна властивість Quil А/холестерину у цих композиціях є усуненою та вони є придатними як розчинники для ліофілізованих модифікованих живих вірусних антигенів. Ад'ювантні композиції, що описано тут, здатні створювати конфігурації для отримання надзвичайно сильної імунної відповіді, спрямованої як клітинна імунна відповідь, як гуморальна імунна відповідь, або як обидва типи відповіді. На додаток, при використанні цих ад'ювантних препаратів можна уникнути реакцій у місці ін'єкції. Реактогенність є значно нижче, ніж у деяких окремих компонентів, що входять у склад комбінації ад'ювантів. На додаток, ці ад'ювантні препарати мають здатність довго зберігатися. Заявники відкрили, що ці нові ад'ювантні композиції мають високу імуногенність, коли поєднані з одним або більшою кількістю різних антигенів у широкому діапазоні видів. Вони можуть бути використані з одним або більше вірусними, бактеріальними, паразитарними, рекомбінантно-білковими, та синтетичними пептидними антигенами, та їх комбінаціями. Нові 3 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вакцинні ад'ювантні композиції можуть бути використані у терапевтичних вакцинах для лікування раку. Отже, цей винахід забезпечує створення ад'ювантних, імуногенних, та вакцинних композицій. На додаток передбачено способи виробництва композицій. Також передбачено їх використання у лікуванні хвороб. Також передбачено їх використання у приготуванні ліків для лікування суб'єктів проти хвороб, особливо проти хвороб, описаних вище. Також передбачено їх використання у приготуванні ліків для профілактики або послаблення хвороби у суб'єкта. Більш того, передбачено їх використання у приготуванні ліків для лікування кішок проти інфекції, викликаної вірусом лейкемії кішок, для лікування птахів проти пташиного кокцидіозу, для лікування корів проти хвороб, спричинених Escherichia coli, для лікування корів проти хвороб, спричинених вірусом вірусного проносу корів, для лікування свиней проти хвороб, спричинених Mycoplasma hyopneumonia, для лікування кішок проти хвороб, спричинених вірусом котячого грипу, суб'єктів проти раку, для лікування собак проти хвороб, спричинених собачим коронавірусом, для лікування корів проти хвороб, спричинених ротавірусом корів, та для лікування собак проти хвороб, спричинених вірусом собачого грипу. Також передбачено використання ад'ювантів як маркера вакцини, щоб допомогти в ідентифікації тварин, які були вакциновані. Також передбачено використання CpG для посилення дії ад'ювантів. На кресленні зображено гель-перебіг при застосуванні радіоімунопреципітаціонного аналізу, де відображаються відмінності у профілі антитіл між NS2/3 білком та Е2 білком вірусу BVD. Група, що оброблена PreZent А показує відповідь антитіл на NS2/3 білки та Е2 білки, у той час як оброблені QCDC та QCDCR групи демонструють відповідь антитіл тільки до білка Е2 та відсутність відповіді до білків NS2/3. Поняття "приблизно" або "приблизно, " використовується у зв'язку з вимірними числовими перемінними, стосується вказаного значення перемінної, та всіх значень перемінної, що є у межах експериментальної похибки вказаного значення (наприклад, у довірчому інтервалі у 95 % для середнього значення) а бо у межах 10 відсотків від вказаного значення, що значно більше, за виключенням використання при посиланні на інтервали часу у тижнях, де "приблизно 3 тижнів, " означає 17-25 діб, та від приблизно 2 до 4 тижнів означає 10-40 діб. Терміни: "ад'ювант" головним чином стосується будь-якого препарату, що збільшує гуморальну або клітинну імунну відповідь на антиген. Ад'юванти більшим чином використовують для досягнення двох цілей - вони сповільнюють вивільнення антигенів з місця ін'єкції та стимулюють імунну систему. "Алкіл" стосується як та прямих, так і розгалужених насичених вуглеводневих груп. "Амін" стосується хімічної сполуки, яка містить нітроген. Аміни є групою сполук, що походять з аміаку шляхом заміни вуглеводневими групами атомів гідрогену. "Четвертинний амін" стосується сполуки на основі амонію з чотирма вуглеводневими групами. "Антитіло" стосується молекули імуноглобуліну, що може зв'язуватися з специфічним антигеном як результат імунної відповіді антигену. Імуноглобуліни є білками сироватки, що складаються з "легких" та "важких" поліпептидних ланцюгів, що мають "сталі" та "мінливі" частини та поділяються на класи (наприклад, IgA, IgD, IgE, IgG, та IgМ) на основі сполучення сталих частин. "Антиген" або "імуноген" стосується будь-яких речовин, що стимулюють імунну відповідь. Термін охоплює вбитих, інактивованих, послаблених, або модифікованих живих бактерій, вірусів, або паразитів. Термін "антиген" також охоплює полінуклеотиди, поліпептиди, рекомбінантні білки, синтетичні білки, екстракти білків, клітини (у тому числі пухлинні клітини), тканини, полісахариди, або ліпіди, або їх фрагменти, окремо або у будь-якої їх комбінації. Термін "антиген" також охоплює антитіла, такі як антиідіотипичні антитіла або їх фрагменти, та синтетичні пептидні мімотопи, що можуть імітувати антиген або антигенний детермінант (епітоп). "Бактерин" означає суспензію одної або більше вбитих бактерій, яка може бути використана як компонент вакцини або імуногенної композиції. "Буфер" означає хімічну систему, яка попереджає змінення у концентрації інших хімічних речовин, наприклад, протонові донорна та акцепторна системи служать як буфер, що попереджують значні змінення концентрації іонів гідрогену (рН). Іншім прикладом буферу є розчин, який містить суміш слабкої кислоти та її солі (сполучену основу) або слабкої основи та її солі (сполучена кислота). "Клітинна імунна відповідь" або "клітинні імунні відповіді" є опосередкованою Т-лімфоцитами або іншими білими клітинами крові або обома разом, та охоплює виробництво цитокінів, 4 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хемокінів та подібних молекул, що виробляються активованими Т-клітинами, білими клітинами крові, або обома разом. "Холестерин" стосується білої кристалічної речовини з хімічною формулою С27Н45ОН. Це циклічний вуглеводневий спирт, який класифікується як ліпід. Він є нерозчинним у воді, але розчиняється у деяких органічних розчинниках. "Гіперчутливість уповільненого типу (DTH)" стосується запальної реакції, що розвивається від 24 до 72 годин після дії антигену, який імунна систем визнає як сторонній. Цей тип імунної відповіді містить переважно Т-клітини, ніж антитіла (які виробляються В-клітинами). "Доза" стосується вакцини або імуногенної композиції, яку дають суб'єкту. Поняття "перша доза" або "первинна вакцина" стосується дозування такої композиції, яку дають у нульову добу. "Друга доза" або "третя доза" або "щорічна доза" стосується кількості такої композиції, що була дана слідом за першою дозою, яка може бути або ні той самою вакциною або імуногенною композицією, як у першій дозі. "Емульгатор" означає речовину, використання якої робить емульсію більш стабільною. "Емульсія" означає композицію двох не змішуваних рідин, у якій малі краплі однієї рідини знаходяться у суспензії з суцільною фазою іншої рідини. "Естери" стосується будь-якого з класу органічних сполук, подібних неорганічним солям, що є сформованими в результаті реакції конденсації, де молекула органічної кислоти з'єднується з молекулою спирту з усуненням молекули води. "Наповнювач" стосується будь-якого компонента вакцини, який не є антигеном. "Гомогенізація" стосується процесу змішування одного або більше компонентів, або однакових, або різних, у однорідну суміш. "Гуморальна імунна відповідь" стосується такої, що є опосередкованої антитілами. "Гідрофобні" означає нерозчинні у воді, які важко поглинають вологу, або на яких несприятливо впливає вода; або несумісні з водою, або з маленької спорідненістю до неї. "Імунна відповідь" у суб'єкта стосується розвитку гуморальної імунної відповіді, клітинної імунної відповіді, або гуморальної та клітинної імунної відповіді на антиген. Імунні відповіді можуть звичайно бути визначені з застосуванням стандартних відомих способів імуноаналізу та нейтралізації. "Імунологічно запобіжна кількість" або "імунологічно ефективна кількість" або "ефективна кількість для отримання імунної відповіді" на антиген є кількістю, яка буде ефективною для викликання імуногенної відповіді у реципієнта. Імуногенної відповіді може бути достатньо для діагностичних цілей або інших тестів, або може бути достатньо для попередження ознак або симптомів хвороб, в тому числі шкідливих наслідків для здоров'я або їх ускладнень, спричинених інфекцією агента хвороби. Як гуморальний імунітет, так та клітинноопосередкований імунітет, або обидва можуть бути викликані. Імуногенна відповідь тварин на імуногенну композицію може бути оцінена, наприклад, непрямим вимірюванням титрів антитіл, методами проліферації лімфоцитів, або безпосередньо через моніторинг ознак та симптомів після зараження штамом дикого типу, де захисний імунітет, наданий вакциною може бути оцінено шляхом вимірювання, наприклад, зниженням таких клінічних ознак як смертність, захворюваність, температура, загальний фізичний стан, та загальний стан здоров'я та характеристика суб'єкта. Імунна відповідь може охоплювати, без обмеження, індукцію клітинного та/або гуморального імунітету. "Імуногенний" означає такий, що викликає імунну або антигенну відповідь. Тому імуногенна композиція може бути будь-якою композицією, що викликає імунну відповідь. "Імуностимуляторний комплекс" або ISCOM належить до специфічної структури, яка формується, коли Quil А є поєднаним з холестерином та фосфоліпідами. "Імуноад'ювантна молекула" стосується молекули, що породжує імунну відповідь. "Ліпіди" стосується будь-якої групи органічних сполук, в тому числі жирів, олій, восків, стеролів та тригліцеридів, що є нерозчинними у воді, але розчиняються у неполярних органічних розчинниках, є оліїстими на дотик, та разом з вуглеводами та білками утворюють головний структурний матеріал живих клітин. "Ліпофільний" означає такий, що має відмічену схильність до ліпідів або розчинність у ліпідах. "Ліпосома" має відношення до мікроскопічної сферичної частинки, що сформована ліпідним подвійним шаром, яка має рідку серцевину та використовується у медичних цілях для переносу ліків, антигену, вакцини, ензиму, або інших речовин до цільових клітин у тілі. "Лікувальний агент" стосується будь-якого агента, який є корисним у попередженні, лікуванні, або послабленні хвороби, або у профілактиці деяких психологічних станів або випадків. 5 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Парентеральне введення" стосується введення речовини, такої як вакцина, у тіло суб'єкту будь-яким шляхом, що оминає травний тракт. Парентеральне введення охоплює підшкірне, внутрішньом'язове, введення крізь шкіру, внутрішньошкірне, внутрішньочеревне, внутрішньоочне та внутрішньовенне введення. "Фармацевтично прийнятний" стосується речовин, які є у межах відомих медичних обговорень, придатні для використання у контакті з тканинами суб'єктів без спричинення токсичних, подразнюючих, алергічних відповідей, та ін., з порівняно розумним співвідношенням ризику, та ефективні для їх призначеного використання. "Реактогенність" стосується побічної дії, викликаної у суб'єкта у відповідь на введення ад'юванту, імуногенної, або вакцинної композиції. Вона може трапитися приблизно місця введення, та її звичайно оцінюють з точки зору розвитку ряду симптомів. Ці симптоми можуть охоплювати запалення, почервоніння та абсцес. Їх також оцінюють з точки зору виникнення, тривалості та тяжкості. "Низькі" реакції можуть, наприклад, спричинювати опухлість, що можна визначити на дотик та неможливо побачити або вона може бути короткотривалою. Більш тяжкі реакції можуть, наприклад, бути довготривалими та їх прояви можна побачити візуально. "Кімнатна температура" означає температуру 18-25 °C. "Сапонін" стосується групи поверхнево-активних глікозидів рослинного походження, що складаються з гідрофільної частини (звичайно це декілька цукрових ланцюгів) у поєднанні з гідрофобною частиною або стероїдної або тритерпенової структури. "Стероїди" стосується будь-якої групи органічних сполук, що належать до біохімічного класу ліпідів, які є легко розчинними у органічних розчинниках та слабо розчиняються у воді. Стероїди містять систему з чотирьох конденсованих кілець - трьох конденсованих кілець циклогексану (6карбон) та четвертого циклопентанового (5-карбон) кільця. "Стероли" стосується сполук у тваринах, які є біологічно виробленими з терпеноїдних прекурсорів. Вони містять стероїдну кільцеву структуру, мають гідроксильну (ОН) групу, що звичайно прикріплена до карбону-3. Вуглеводневий ланцюг жирної кислоти-замісника змінюється у довжині, звичайно з 16-20 атомів карбону, та може бути насиченим або ненасиченим. Стероли звичайно містять один або більше подвійних зв'язків у кільцевій структурі, а також безліч замісників, прикріплених до кілець. Стероли та їх естери жирних кислот по суті є нерозчинними у воді. "Суб'єкт" стосується будь-якої тварини, для якої бажано введення ад'ювантної композиції. Цей термін охоплює ссавців та нессавців, в тому числі приматів, домашню худобу, домашніх тварин, лабораторних експериментальних тварин, спійманих диких тварин, птахів (включаючи яйця), рептилій та рибу. Отже, цей термін охоплює без обмежень мавп, людей, свиней; велику рогату худобу, баранів, кіз, коней, мишей, щурів, морських свинок, хом'яків, кролів, кішок, собак, курчат, індиків, качок, іншу свійську птицю, жаб та ящірок. "ТСID50 "стосується "інфекційної дози культури тканин" та визначається як розведення вірусу, який потрібен, щоб заразити 50 % із даної партії щеплених культур клітин. Різні способи можуть бути використані для обчислення ТСID50, в тому числі спосіб Spearman-Karber, який використовується в цієї специфікації. Опис способу Spearman-Karber, див. у В. W. Mahy & Н. О. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996). "Терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антигену або вакцини, що буде викликати імунну відповідь у суб'єкта, що отримав антиген або вакцину, якої достатньо для попередження або зниження ознак або симптомів хвороби, в тому числі шкідливих для здоров'я проявів або їх ускладнень, спричинених патогенними інфекціями, такими як вірусні або бактеріальні. Гуморальний імунітет або клітинно-опосередкований імунітет або як гуморальний, так і клітинно-опосередкований імунітет можуть бути викликані. Імуногенна реакції тварини на введення вакцини може бути оцінена, наприклад, непрямим вимірюванням титрів антитіл, аналізами проліферації лімфоцитів, або безпосередньо моніторингом ознак та симптомів після введення штаму дикого типу. Захисний імунітет, наданий вакциною може бути оцінено шляхом вимірювання, наприклад, скороченням клінічних ознак, таких як смертність, захворюваність, температура, загальний фізичний стан, загальний стан здоров'я та характеристика суб'єкта. Кількість вакцини, що є терапевтично ефективним може змінюватися залежно від конкретного використаного ад'юванту, конкретного використаного антигену, або від стану суб'єкта, та може бути визначений фахівцями у цій галузі. "Лікування" стосується попередження розладу, стану або хвороби, до якої застосовується такий термін, або для попередження або зниження одного або більше симптомів такого розладу, стану або хвороби. "Тритерпеноїди" стосується великого та різноманітного класу природних органічних молекул, похідних від шести одиниць п'ять-карбон ізопрену (2-метил-1,3-бутадієн), яких може 6 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бути зібрано та модифіковано у безліч способів. Більшість з них - мультициклічні структури, які відрізняються одна від іншої по функціональним групам та по їх базовим карбоновим скелетам. Ці молекули можуть бути знайдені у всіх класах живих істот. "Вакцина" стосується композиції, що охоплює антиген, як визначено тут. Введення вакцини суб'єкту спричинює імунну відповідь, головним чином проти однієї або більше специфічних хвороб. Кількість вакцини, що є терапевтично ефективною, може змінюватися залежно від конкретного використаного антигену або від стану суб'єкта та може бути визначена фахівцями у цієї галузі. Тритерпеноїди, придатні для використання у ад'ювантній композиції, можуть надходити з багатьох джерел, бути або рослинного походження або синтетичними еквівалентами, в тому числі, але без обмеження, Quillaja saponaria, томатин, екстракти женьшеню, гриби, та алкалоїдний глюкозид, структурно подібний до стероїдних сапонінів. Отже, тритерпеноїди, придатні для використання у ад'ювантних композиціях охоплюють сапоніни, сквален, та ланостерол. Кількість тритерпеноїдів, яка необхідна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаних тритерпенів. Тим не менш, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 5 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 1 мкг - 4 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 000 мкг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг - 100 мкг на дозу, та у кількості приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Якщо було використано сапонін, ад'ювантні композиції головним чином містять імунологічно активну фракцію сапоніну з кори Quillaja saponaria. Сапоніном може бути, наприклад, Quil А або іншій очищений або частково очищений препарат сапоніну, який може бути отриманий на комерційній основі. Отже, екстракти сапоніну можуть бути використані у вигляді суміші або очищених індивідуальних компонентів, таких як QS-7, QS-17, QS-18, та QS-21. У одному втіленні, Quil А має щонайменше 85 % чистоту. У інших втіленнях, Quil А має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % чистоту. CpG ODNn є нещодавно описаним класом фармакотерапевтичних агентів, що характеризуються присутністю неметильованого CG динуклеотиду у специфічних "основапослідовність" положеннях (CpG фрагмент). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs для Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, який є включеним тут, як вказано у посиланні). Ці CpG фрагменти не спостерігають у еукаріотичній ДНК, у який CG динуклеотиди є подавленими та, коли вони є у наявності, звичайно метильовані, але вони присутні у бактеріальної ДНК, яку вони наділяють імуностимуляторними властивостями. Ці імуностимуляторні властивості охоплюють індукцію відповіді Тh1-типу з помітним вивільненням IFN-Á, IL-12, та IL-18. CpG ODN (18-24 пар основ у довжину) мають імуномодуляторні властивості, подібні до бактеріальної ДНК. Білки клітинної поверхні можуть взаємодіяти з цими молекулами з перемінними результатами. Проте, з носієм, таким як QCDC, QCDCR та іншими комбінаціями, що наведені у межах цього патенту, імуномодуляційні властивості та поглинання CpG значно підсилюються. Кількість CpG для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного CpG та від передбачених видів. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 20 мг на дозу. Їх також використовують у кількості близько 1 мкг - 10 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 5 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 4 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 мг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 мг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, 10 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг 100 мкг на дозу, та у кількості приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Стероли, придатні для використання у ад'ювантних композиціях охоплюють β-сітостерол, стігмастерол, ергостерол, ергокальциферол, та холестерин. Ці стероли є добре відомі фахівцям та можуть бути комерційно придбані. Наприклад, холестерин є у Merck Index, 12th Ed., p. 369. Кількість стеролів, придатна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаних стеролів. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 5 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості близько 1 мкг - 4 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 000 мкг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг - 100 мкг на дозу, та приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. 7 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ад'ювантні композиції можуть, крім того, охоплювати один або більше імуномодуляторних агентів, таких, наприклад, як четвертинні сполуки амонію (наприклад, DDA), та інтерлейкіни, інтерферони, або інші цитокіни. Ці речовини можуть бути комерційно придбані. Кількість імуномодулятору, придатного для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного імуномодулятору та суб'єкта. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 5 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості близько 1 мкг 4 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 000 мкг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг - 100 мкг на дозу, та у кількості приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Як конкретний приклад, ад'ювантні композиції, які містять DDA можуть бути отримані простим змішуванням розчину антигену та свіжо приготованого розчину DDA. Ад'ювантні композиції можуть, крім того, містити один або більше полімерів, таких, наприклад, як DEAE декстран, поліетиленгліколь, поліакрилова кислота та поліметакрилова кислота (наприклад, CARBOPOL®). Такі речовини можуть бути комерційно придбані. Кількість полімерів, придатна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного полімеру. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 0,0001-75 об. %. у інших втіленнях, вони є використаними у кількості приблизно 0,001-50 об. %, приблизно 0,005-25 об. %, приблизно 0,01-10 об. %, приблизно 0,05-2 об. %, та приблизно 0,1-0,75 об. %. У іншому втіленні, вони є використаними у кількості приблизно 0,02-0,4 об. %. DEAE-декстран може мати молекулярну масу у межах від 50 000 Да до 5 000 000 Да, або вона може бути у межах від 500 000 Да до 2 000 000 Да. Такі речовини можуть бути комерційно придбані або приготовані з декстрану. Інші специфічні приклади - це поліакрилова кислота (наприклад, полімери CARBOPOL®), яка має середню еквівалентну масу 76. Вони вироблені з первинних полімерних частин приблизно 0,2 до 6,0 мікрон у середньому діаметрі. Полімери CARBOPOL® розбухають у воді більш ніж у 1000 разів від їх початкового об'єму та у десять разів від їх первісного діаметра з утвореннямгелю при дії рН середовища більше, ніж рKа карбоксилатної групи. При рН, більшім, ніж рKа карбоксилатної групи, карбоксилатні групи іонізуються в результаті відштовхування між негативними зарядами, яке веде до опухлості полімеру. Ад'ювантні композиції можуть, крім того, містити один або більше Тh2 ад'ювантів, таких як, наприклад, Bay R1005® та алюміній. Кількість Th2 ад'ювантів, придатна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного Th2 стимулятору. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 0,01-10 мг на дозу. У інших втіленнях, вони є використаними у кількості приблизно 0,05-7,5 мг на дозу, приблизно 0,1-5 мг на дозу, приблизно 0,5-2,5 мг на дозу, та 1-2 мг на дозу. Конкретним прикладом є Bay R1005®, глюколіпід з хімічним ім'ям "N-(2-деокси-2-L-лейциламіно-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканаміду ацетат. Він може бути синтезований відповідно типів лікувань, що можна знайти у Lockhoff, 0. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1611-1620; 1991). Його рекомендовано зберігати при 2-8 °C у герметичному контейнері. Його хімічні або фізичні властивості охоплюють легку гігроскопічність без утворювання поліморфних форм, він є хімічно стабільним у повітрі та світлі при температурі до 50 °C та у водних розчинниках при рН 2-12 при кімнатній температурі. Він є амфіфільною молекулою, яка утворює міцели у водних розчинах. Ад'ювантні композиції можуть містити один або більше антигенів. Антиген може бути будьяким з широкого кола речовин, здатних до продукування бажаної імунної відповіді у суб'єкта. Хоча сам Quil А є віроцидним, його можна позбавити токсичності додаванням холестерину при формуванні спіральних міцел (Див. US Patent № 7, 122, 191). Описані тут ад'ювантні композиції, як було виявлено, невіроцидні та негемолітичні або мембранолітичні. Отже, антигени, що використані з цими ад'ювантними композиціями можуть бути одним або кількома вірусами (інактивованими, послабленими, та живими модифікованими), бактеріями, паразитами, нуклеотидами, полінуклеотидами, пептидами, поліпептидами, рекомбінантними білками, синтетичними білками, екстрактами білків, клітин (охоплюючи пухлини клітин), тканинами, полісахаридами, вуглеводами, жирними кислотами, тейхоєвою кислотою, пептидоглюканами, ліпідами або глюколіпідами, поодинці або у будь-якій їх комбінації. Антигени, використані з ад'ювантами винаходу також містять імуногенні фрагменти нуклеотидів, полінуклеотидів, пептидів, поліпептидів, які можуть бути виділені з організмів, згаданих в цьому документі. Живі, живі модифіковані, та послаблені вірусні штами, що не викликають хвороб у суб'єкта, були виділені у невірулентній формі, або були послаблені з застосуванням способів, добре відомих фахівцям, в тому числі серійним пасажем у придатній лінії клітин або обробкою 8 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ультрафіолетовим світлом або хімічним мутагеном. Інактивовані або вбиті вірусні штами - ті, які інактивовані різними способами, відомими фахівцям, в тому числі обробкою формаліном, бетапропріолактодином (ВРЛ), бінарним етиленіміном (ВЕІ), стерилізацією радіацією, нагріванням, або такими іншими способами. Два або більше антигенів можуть бути поєднаними для виробництва полівалентної композиції, що може захистити суб'єкт проти широкого ряду хвороб, спричинених патогенами. Зараз комерційні виробники вакцин, так само, як і їх користувачі, віддають перевагу полівалентним вакцинним продуктам. Поки звичайні ад'юванти часто обмежені різновидами антигенів, з якими вони можуть бути ефективно використані (або моновалентно, або полівалентно), ад'юванти, що описані тут, можуть бути ефективно використані з широким рядом антигенів, як моновалентних, так і полівалентних. Отже, описані тут антигени можуть бути поєднаними у окрему композицію, що містить описані тут ад'юванти. Деякі приклади бактерій, які можуть бути використані як антигени з ад'ювантними композиціями містять, але без обмеження, Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracellulahs, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescensSIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraseuis, Salmonella newport, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, та різновиди Leptospira, такі як відомі патогени Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira Bratislava та їх комбінації. Як інактивовані віруси, так і послаблені живі віруси можуть бути використані у ад'ювантних композиціях. Деякі приклади вірусів, які можуть бути використані як антигени містять, але без обмеження, вірус герпесу птахів, віруси герпесу корів, віруси герпесу собак, віруси герпесу коней, вірус кошачого ринотрахеїту, вірус хвороби Марека, овечі віруси герпесу, віруси герпесу свиней, вірус псевдосказу, параміксовіруси птахів, респіраторний синцитіальний вірус корів, вірус собачої чуми, вірус собачого парагрипу, собачий аденовірус, собачий парвовірус, вірус парагрипу корів 3, вірус парагрипу овець 3, вірус чуми рогатої худоби, вірус граничної хвороби, вірус вірусного проносу корів (BVDV), BVDV типу І, та BVDV типу II, класичний вірус свинячої лихоманки, вірус лейкозу птахів, вірус імунодефіциту корів, вірус лейкемії корів, туберкульоз корів, вірус інфекційної анемії коней, вірус кошачого імунодефіциту, вірус кошачої лейкемії (FeLV), вірус хвороби Ньюкастла, вірус прогресивної пневмонії овець, вірус легеневої аденокарциноми овець, собачий коронавірус (CCV), пантропічний CCV, собачий респіраторний коронавірус, коронавірус корів, кошачий каліцивірус, кошачий ентеричний коронавірус, вірус кошачого інфекційного перитоніту, вірус свинячого проносу, вірус свинячого гемаглютинаціонного енцефаломілетиту, свинячий парвовірус, свинячий цирковірус (РСV) типу І та PCV типу II, вірус свинячого відтворювального та дихального синдрому (PRRS), вірус заразного гастроентеріту, індичий коронавірус, вірус короткочасної лихоманки корів, різні види сказу, ротовірус, вірус везикулярного стоматиту, лентовірус, вірус пташиного грипу, риновіруси, вірус грипу коней, вірус грипу свиней, вірус собачого грипу, вірус кошачого грипу, вірус грипу людини, східний вірус енцефаліту коней (ЕЕЕ), венесуельський вірус енцефаліту коней, вірус західного Нілу, західний вірус енцефаліту коней, вірус імунодефіциту людини, вірус папіломи 9 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людини, вірус вітряної віспи, вірус оперізувального лишаю, вірус гепатиту В, риновірус, вірус кору та їх комбінації. Приклади пептидних антигенів охоплюють Bordetella bronchiseptica p68, GnRH, IgE пептиди, FeI d1, та антигени раку та їх комбінації. Приклади інших антигенів охоплюють нуклеотиди, вуглеводи, ліпіди, глюколіпіди, пептиди, жирні кислоти, тейхоєву кислоту, пептидоглюкани, та їх комбінації. Деякі приклади паразитів, які можуть бути використані як антигени з ад'ювантними композиціями охоплюють, але без обмеження, Anaplasma, Fasciola hepatica (печінка камбали), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasm gondii, Giardia, Dirofilaria (серцеві глисти), Ancylostoma (крюкоподібні глисти), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, Isopsora, та їх комбінації. Також передбачено використання зовнішніх паразитів, що охоплюють, але без обмеження, кліщів, в тому числі Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, та різновидів Haemaphysalis, та їх комбінації. Кількість антигену, використаного для викликання імунної відповіді буде значно змінюватися залежно від використаного антигену, суб'єкту, від рівня бажаної відповіді, та може бути визначена фахівцями. Для вакцин, які містять модифіковані живі або послаблені віруси, 2 терапевтично ефективна кількість антигену головним чином зазвичай становить від 10 10 інфективної дози культури тканини (ТСID)50 до 10 TCID50, включно. Для багатьох таких вірусів, 2 8 терапевтично ефективна доза є головним чином у межах 10 ТСID50-10 ТСID50, включно. У 3 6 деяких втіленнях, терапевтично ефективні дози Haemaphysalis є приблизн о 10 ТСID50-10 TCID50, включно. У де яких інших втіленнях, межі терапевтично ефективних доз дорівнюють 4 5 приблизно 10 ТСID50-10 ТСID50, включно. Для вакцини, яка містить інактивовані віруси, терапевтично ефективна кількість антигену дорівнює головним чином щонайменше приблизно 100 відносних одиниць на дозу, та часто у межах приблизно 1 000-4500 відносних одиниць на дозу, включно. У інших втіленнях, терапевтично ефективна кількість антигену є у межах приблизно 250-4 000, включно, відносних одиниць на дозу, приблизно 500-3 000 включно, відносних одиниць на дозу, приблизно 750-2000 включно, відносних одиниць на дозу, або приблизно 1000-1500 включно, відносних одиниць на дозу. Терапевтично ефективна кількість антигену у вакцинах, які містять інактивовані віруси може також бути виміряна у межах відносної імуногенності (ВІ) на мл. Терапевтично ефективна кількість часто дорівнює приблизно 0,1-50 ВІ на мл, включно. У інших втіленнях, терапевтично ефективна кількість антигену дорівнює приблизно 0,5-30 ВІ на мл, включно, приблизно 1-25 ВІ на мл, включно, приблизно 2-20 ВІ на мл, включно, приблизно 3-15 ВІ на мл, включно, або приблизно 5-10 ВІ на мл, включно. У одному втіленні, антиген FeLV був вироблений з клітинної лінії FL74-UCD-1 (АТСС № CRL8012) яку було систематично інфіковано вірусним штамом KT-FeLV-UCD-1 вірусу котячої лейкемії Кількість антигену FeLV у вакцині може бут и виміряна як кількість вірусного білка gp70 на мл. Терапевтично ефективна кількість антигену FeLV, яка може бути виміряна як кількість вірусного білка gp70 на мл, головним чином є у межах приблизно 100-350 000, включно. У іншому втіленні - у межах приблизно 1 000-300 000 нг/мл, включно, або приблизно 2500-50 000 нг/мл, включно, або приблизно 4 000-220 000 нг/мл, включно, або приблизно 5 000-150 000 нг/мл, включно, або приблизно 10 000-100 000 нг/мл, включно. Кількість клітин для бактеріального антигену, введеного у вакцині, коливається у межах 6 10 приблизно 1×10 -5×10 одиниць, що формують колонію (СFU) на дозу, включно. У інших 7 10 втіленнях, кількість клітин коливається приблизно 1×10 -5×10 CFU на дозу, включно, або 8 10 приблизно 1×10 -5×10 CFU на дозу, включно. Ще у інших втіленнях, кількість клітин 2 10 4 9 коливається приблизно 1×10 -5×10 CFU на дозу, включно, або приблизно 1×10 -5×10 CFU на 5 9 6 9 дозу, включно, або приблизно 1×10 -5×10 CFU на дозу, включно, або приблизно 1×10 -5×10 6 8 7 CFU на дозу, включно, або приблизно 1×10 -5×10 CFU на дозу, включно, або приблизно 1×10 9 5×10 CFU на дозу, включно. 2 Кількість клітин для антигену паразиту, введеного у вакцині, коливається приблизно 1×10 10 3 9 1×10 на дозу, включно, у інших втіленнях, кількість клітин коливається приблизно 1×10 -1×10 4 8 5 7 на дозу, включно, або приблизно 1×10 -1×10 на дозу, включно, або приблизно 1×10 -1×10 на 6 8 дозу, включно, або приблизно 1×10 -1×10 на дозу, включно. При застосуванні звичайних ад'ювантів добре відомо, що значно більша кількість інактивованих вірусів, ніж модифікованих живих або послаблених вірусів необхідна для симулювання відповідного рівня серологічної відповіді. Проте, було несподівано знайдено, що з ад'ювантними композиціями, які тут описано, приблизно однакові кількості інактивованого вірусу та модифікованого живого вірусу стимулюють подібні рівні серологічної відповіді. На додаток, 10 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 менші кількості модифікованих живих, послаблених, та інактивованих вірусів необхідні разом з описаними тут ад'ювантами, порівняльно з звичайними ад'ювантами для досягнення того ж самого рівня серологічної відповіді. Ці неочікувані знахідки демонструють збереження ресурсів та скорочення витрат у процесі приготування імуногенних та вакцинних композицій. Для вакцин широкого споживання, потрібно виробництво мільйонів доз на рік, так що ця економія може бути суттєвою. Водні ад'юванти забезпечують певні переваги. Вони головним чином легкі для утворення та введення, та можуть викликати небагато або менш серйозні реакції у місці ін'єкції. Проте, водні ад'юванти з антигеном мають тенденцію розсіюватися з місця ін'єкції, очищуватися печінкою суб'єкта, та породжувати неочікувану неспецифічну імунну відповідь. Було несподівано знайдено, що описані тут водні ад'ювантні композиції залишаються у місці ін'єкції до біометаболізації, яка трапляється впродовж довгого періоду часу та забезпечують цільову імунну відповідь. Олія, коли її додано, як компонент ад'юванту, головним чином забезпечує довге та повільне вивільнення. У даному винаході, олія може бути здатною або не здатної до метаболізації. Олія може бути у вигляді "олія у воді", "вода у олії", або емульсії "вода у олії у воді". Олії, придатні для використання у цьому винаході охоплюють алкани, алкени, алкіни, та їх подібні кислоти та спирти, естери та їх складні естери, та їх суміші. Індивідуальні сполуки олій це легкі вуглеводневі сполуки, тобто, такі компоненти мають 6-30 атомів карбону. Олія може бути синтетично приготованою або отриманою з продуктів нафти. Група може мати пряму або розгалужену ланцюгову структуру. Вона може бути цілком насиченою або мати один або більше подвійних або потрійних зв'язків. Деякі нездатні до метаболізації олії, що можуть використовуватися у цьому винаході охоплюють, наприклад, мінеральні олії, парафінові олії, та циклопарафіни. Термін "олія" також охоплює термін "легка мінеральна олія", тобто, олія, яка так само отримана шляхом дистиляції нафти, але яка має трохи нижчу питому вагу ніж біла мінеральна олія. Здатні до метаболізації олії охоплюють здатні до метаболізації, нетоксичні олії. Олія може бути будь-якою олією рослинного, тваринного, або рибного походження, або синтетично приготованою олією, яка може бути метаболізована тілом суб'єкта, якому введено ад'ювант, та яка не є токсичною для суб'єкта. Джерела походження для рослинних олій охоплюють горіхи, насіння та зерно. Емульсія "олія у воді", передбачена цим винаходом складаються з препарату AMPHIGEN®. Цей препарат містить водний компонент, лецитин, мінеральну олію, та поверхнево-активні речовини. Компоненти цього препарату докладно викладені у патентах US 5, 084, 269 та US 6, 572, 861. Звичайно, компонент олії у цьому винаході присутній у кількості 1-50 об. %; або у кількості 10-45 об. %; або у кількості 20-40 об. %. Інші компоненти композицій можуть охоплювати фармацевтично прийнятні наповнювачі, такі як носії, розчинники, та розріджувачі, ізотонічні агенти, буферні агенти, стабілізатори, консерванти, судинозвужуючі агенти, антибактеріальні агенти, протигрибкові агенти, тощо. Типові носії, розчинники, та розріджувачі охоплюють воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерол, олію, тощо. Характерні ізотонічні агенти охоплюють натрію хлорид, декстрозу, манітол, сорбітол, лактозу, тощо. Корисні стабілізатори охоплюють желатин, альбумін та подібні. Поверхнево-активні речовини використані для стабілізації емульсії, відібраної для дії як носій для ад'юванту та антигену. Поверхнево-активні речовини, придатні для використання у даному винаході охоплюють природні біологічно сумісні поверхнево-активні речовини та неприродні синтетичні поверхнево-активні речовини. Біологічно сумісні поверхнево-активні речовини охоплюють фосфоліпідні сполуки або суміші фосфоліпідів. Бажаними фосфоліпідами є фосфатидилхоліни (лецитин), такі як соєвий або яєчний лецитин. Лецитин може бути отриманий як суміш фосфатидів та тригліцеридів миттям водою необробленої рослинної олії, та відділенням та висушуванням отриманих гідратованих речовин. Очищений продукт може бути отриманий шляхом фракціонування суміші до нерозчинних у ацетоні фосфоліпідів та глюколіпідів, які залишилися після усунення тригліцеридів та рослинної олії промиванням ацетоном. Крім того, лецитин може бути отриманий з різних торговельних джерел. Інші придатні фосфоліпіди охоплюють фосфатіділгліцерін, фосфатидилінозитол, фосфатидилсерин, фосфатидну кислоту, кардіоліпін, та фосфатидилетаноламін. Фосфоліпіди можуть бути отримані з природних джерел або синтезовані традиційним способом. 11 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Неприродні, синтетичні поверхнево-активні речовини, придатні для використання у цьому винаході охоплюють неіонні поверхнево-активні речовини на базі сорбітану, наприклад, заміщені жирними кислотами сорбітанові поверхнево-активні речовини (що є у продажу під торговельними марками SPAN® або ARLACEL®), естери жирної кислоти поліетоксилованого сорбітолу (TWEEN®), поліетиленгліколеві естери жирних кислот з таких джерел, як касторова олія (EMULFOR®); поліетоксилована жирна кислота (наприклад, стеаринова кислота, що є у наявності під торговельною маркою SIMULSOL М-53®), поліетоксилований полімер ізооктилфенолу/формальдегіду (TYLOXAPOL®), поліоксіетиленові жирні спиртові естери (BRIJ®); поліоксіетиленові нефенілові естери (TRITON® N), поліоксіетиленові ізооктилфенілові естери (TRITON® X). Взагалі кажучи, по верхнево-активна речовина, або комбінації поверхнево-активних речовин, якщо використано дві або більше поверхнево-активних речовин, присутні у емульсії у кількості 0,01-10 об. %, бажано, 0,1-6,0 об. %, більш бажано 0,2-5,0 об. %. Як використано тут, "фармацевтично прийнятний носій" охоплює будь-якій, та всі розчинники, дисперсні середовища, матеріали оболонки, ад'юванти, стабілізатори, розчинники, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, агенти затримки адсорбції, тощо. Носій (носії) повинен бути "прийнятним", тобто бути сумісним з іншими компонентами композиції та не бути шкідливим для суб'єкту. Звичайно, носії повинні бути стерильними, апірогенними, та відібраними залежно від вибраного способу введення. Фахівцям добре відомо, що бажані препарати для фармацевтично прийнятних носіїв, які містять композиції є затвердженими у відповідних положеннях, що встановлюються United States (US) Department of Agriculture or US Food and Drug Administration, або подібними урядовими органами у інших країнах. Отже, фармацевтично прийнятим носієм для комерційного виробництва композиції є носій, що вже затверджений або буде затверджений відповідною урядовою установою у Сполучених Штатах або у іншій країні. Композиції також можуть містити сумісні фармацевтично прийнятні (тобто стерильні або нетоксичні) рідкі, напівтверді, або тверді розчинники, які служать як фармацевтичні засоби для транспорту, наповнювачів, або посередників. Розчинники можуть містити воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Ізотонічні агенти можуть містити хлорид натрію, декстрозу, манітол, сорбітол та, серед іншого, лактозу. Стабілізатори містять, серед іншого, алюміній. Композиції можуть також містити антибіотики або консерванти, наприклад, гентаміцин, мертіолат, або хлорокрезол. Різні класи антибіотиків або консервантів, з яких можна підібрати бажані, добре відомі фахівцям. Отримання композицій Отримання композицій ад'ювантів ISCOM може бути приготований шляхом об'єднання сапоніну, стеролу, та фосфоліпіду. Наприклад, ISCOM може містити 5 % - 10 % від загальної маси Quil A, 1-5 % - холестерину та фосфоліпідів, та білок у залишку. Співвідношення сапоніну до стеролу у ад'ювантних препаратів звичайно дорівнює від 1:100 (співвідношення однієї маси до другої за масою до 5:1 за масою. У деяких втіленнях, присутній надлишок стеролу та співвідношення сапоніну до стеролу є щонайменше 1:2 за масою, або 1:5 за масою. У інших втіленнях, сапонін є у надлишку до стеролу, та використовується співвідношення сапоніну до стеролу приблизно 5:1 за масою. ISCOM та ISCOMATRIX є у наявності у продажу від Isconova AB (Sweden). У деяких втіленнях, CARBOPOL® використовується у комбінації з DDA у кількості щонайменше 0.1 частини маси CARBOPOL® на частину маси DDA. У інших втіленнях, використовується щонайменше 0.5 частини маси CARBOPOL® на частину маси DDA. Ще у інших втіленнях, використовується щонайменше 1 частина маси CARBOPOL® на частину маси DDA. Комбінація CARBOPOL® та DDA утворює комплекс, за допомогою чого функціональна група третинного аміну DDA надає імунні функції боковим групам карбонової кислоти полімеру. Це дозволяє специфічним імунним клітинам поцілювати одночасно у антиген та у ад'ювант та доставляти разом антиген та ад'ювант за оптимальний час та у оптимальній концентрації до вказаної клітини. Ад'юванти, що тут вказані, головним чином не потребують будь-яких специфічних носіїв, та можуть бути приготовані у водному або іншому фармацевтично прийнятному буфері. У деяких випадках, вакцини названих втілень можуть бути представлені з відповідним носієм, таким як, наприклад, додаткові ліпосоми, мікросфери або частини антигену у капсулах. Антиген може розміщатися на внутрішньому боці везикулярної мембрани, або розміщатися назовні. Головним чином, розчинні антигени містяться назовні, а гідрофобні або модифіковані ліпідами антигени розміщуються або всередині, або назовні мембрани. 12 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ад'ювантні композиції можуть бути виконані в різних формах, залежно від шляху введення, вимог зберігання, тощо. Наприклад, вони можуть бути виготовлені у вигляді стерильних водних розчинів або дисперсної суміші, придатних для введення шляхом ін'єкції, або виготовлені у ліофілізованих формах з застосуванням способів ліофілізації, вакуумного підсушування, або підсушування розпиленням. Ліофілізовані композиції можуть бути відтворені перед використанням у стабілізаційному розчині, наприклад, у фізіологічному розчині або HEPES. Отже, ад'ювантні композиції можуть бути використані у твердому, напівтвердому, або рідкому вигляді дозування. Ад'юванти можуть бути вироблені з застосуванням технологій, що відомі фахівцям. Наприклад, сапонін та холестерин можуть бути змішані у придатний детергент, після чого застосовується екстракція розчинника для утворення ліпосом або ISCOMів. Сапонін та холестерин також можуть бути поєднаними для створення спіральних міцел, як описано у US Patent № 7, 122, 191. Буферований фосфатом фізіологічний розчин (PBS) може бути використаний як водна буферна середа; рН буферу може бути нейтральним або слабо лужним або слабо кислим. Відповідно, рН може бути у межах рН 6-8. Загальним є рН приблизно 7,0-7,3. Сила буферу може бути 10-50 мМ Р04 та 10-150 мМ РО4. У одному прикладі, було використано 0,063 % PBS. РН може бути відрегульовано застосуванням NaOH або НСl, якщо це потрібно. Типові концентрації охоплюють 1N-10N НСl та 1N-10N NaOH. Кількість використаного ад'юванту залежить від антигену, до якого він використовується та від дозування антигену, яке повинно застосовуватися. Також це залежить від призначених видів та бажаного препарату. Звичайно кількість є у межах, які традиційно використовують для ад'ювантів. Наприклад, ад'юванти звичайно становлять приблизно 1-1000 мкг, включно, у 1-мл дозі. Так само, антибіотики звичайно становлять приблизно 1-60 мкг, включно, у 1-мл дозі. Препарати стимуляторів можуть бути гомогенізовані або мікрофлюїдовані. Препарати піддають первинному процесу змішування, звичайно, проходженням за один або разів крізь один або декілька гомогенізаторів. Для цієї мети може бути використано будь-який комерційно доступний гомогенізатор, наприклад, емульгатор Росса (Hauppauge, NY), Gaulin гомогенізатор (Everett, MA), або Microfluidics (Hoeton, MA). У одному втіленні, препарати були гомогенізовані впродовж трьох хвилин при 10 000 об./хв. Мікрофлюїдування може бути зроблено використанням комерційно доступного мікрофлюїдайзеру, такого як модель № 11OY, що можна придбати у Microfluidics, (Hoвton, Mass.); Gaulin модель 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); та Rainnie Minilab тип 8. 30Н (Miro Atomizer Food та Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Ці мікрофлюїдайзери працюють, примушуючи рідини проходити крізь малі отвори під високим тиском, таким, що два струмені рідини взаємодіють на великих швидкостях у камері взаємодії для формування суміші з крапель субмікронного розміру. У одному втіленні, препарати були мікрофлюїдовані проходженням крізь 200-мікронну камеру обмеженого розміру при 10 000+/-500 фунтів на квадратний дюйм. Ад'ювантні композиції, що описано тут можуть бути разом гомогенізованими та мікрофлюїдованими. У одному втіленні, антиген було додано до відповідного буферу. Розчин збовтували, та сапонін було повільно додано до розчину антигену. Далі повільно додали стерол до розчину антиген/сапонін, після цього до розчину антиген/сапонін/стерол повільно додавали четвертинну сполуку амонію. Отримана композиція була гомогенізована, та далі мікрофлюїдована. Після мікрофлюїдизації до мікрофлюїдованої композиції було додано полімер. Залежно від використаних компонентів, порядок цих кроків може бути змінений для покращення приготування композиції. Ад'ювантні композиції, що описано тут можуть бути використані у виробництві імуногенних та вакцинних композицій. Для вакцинних або імуногенних композицій, кожна доза містить терапевтично ефективну кількість антигену, або антигенів, що можуть змінюватися залежно від віку та загального стану суб'єкту, способу введення, походження антигену, та інших факторів. Кількості та концентрації інших компонентів вакцин або імуногенні композицій можуть бути відрегульовані зміненням фізичних та хімічних властивостей композиції, та можуть швидко бути визначені фахівцями. Переважною ознакою ад'ювантних композицій є те, що вони здатні повністю змінювати конфігурацію залежно від бажаної характеристики композиції. Наприклад, якщо бажаною буде побільшена Тh1 відповідь, то кількість стимулятору Тh1 може бути збільшена. Відповідно, якщо бажаною буде побільшена Th2 відповідь, то кількість стимулятору Тh2 може бути збільшена. Також може бути досягнута збалансована Th1/Th2 відповідь. Імуногенні та вакцинні композиції можуть також бути гомогенізовані або мікрофлюїдовані як описано вище. Розміри доз композицій звичайно є у межах приблизно 1 мл - 5 мл, включно, залежно від суб'єкту та антигену. Наприклад, для собак або кішок, звичайно використовують дози приблизно 13 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 мл, в той час як для великої рогатої худоби звичайно використають дози приблизно 2-5 мл. Проте, ці ад'юванти також можуть бути приготовані у мікродозах, де дози приблизно 100 мкл можуть бути використані. Способи введення ад'ювантних композицій охоплюють парентеральний, пероральний, ороназальний, інтраназальний, інтратрахеальний, місцевий, та введення у яйце. Будь-який придатний пристрій може бути використаний для введення композиції, в тому числі шприци, крапельниці, безголкові пристрої для ін'єкцій, пластирі, тощо. Спосіб та пристрій, відібраний для використання буде залежати від ад'ювантної композиції, антигену, та суб'єкту, та вони є добре відомими фахівцям. Одною з вимог для будь-якого приготування ад'юванту вакцини для комерційного використання є створення стабільності розчину ад'юванту на довгий строк зберігання. Надані тут ад'ювантні препарати є легкими у виробництві та стабільними щонайменше 18 місяців. У одному втіленні, препарати є стабільними приблизно 18 місяців. Уіншому втіленні, препарати є стабільними у межах 18-24 місяців. У іншому втіленні, препарати є стабільними приблизно 24 місяців. Способи прискореного тестування також показують, що препарати, які описані тут, є стабільними. Корисною рисою даних композицій ад'ювантів є те, що вони можуть бути безпечно та ефективно введені широкому ряду суб'єктів. У цієї галузі очікується, що комбінації ад'ювантів будуть показувати більшу реактогенність ніж індивідуальні компоненти. Проте, композиції, що описані тут, показують зменшену реактогенність порівняльно з композиціями, у яких будь-який один або два компонента були використані, в той час як зберігалася дія ад'юванту. Також було несподівано знайдено, що ад'ювантні композиції, описані тут показують безпечні поліпшення, порівняно з іншими композиціями ад'ювантів. Ад'ювантні композиції, що описані тут є корисними для продукування бажаної імунної відповіді у суб'єкті. Вони є дієздатними у численних видах. Придатним суб'єктом є будь-яка тварина, для якої є бажаним введення ад'ювантної композиції. Цей термін охоплює ссавців та не-ссавців, в тому числі приматів, домашню худобу, домашніх тварин, лабораторних дослідних тварин, спійманих диких тварин, птиць (в тому числі яйця), рептилій та рибу. Отже, цей термін охоплює без обмежень мавп, людей, свиней; велику рогату худобу, баранів, кіз, коней, мишей, щурів, морських свинок, хом'яків, кролів, кішок, собак, курчат, індиків, качок, іншу свійську птицю, жаб та ящірок. Ад'юванти, що описано тут можуть бути використані для того, щоби показати серологічну різницю між інфікованими та вакцинованими тваринами. Отже, вони може бути використані у маркерній вакцині, де антиген у вакцині викликає у вакцинованих тварин інші типи антитіл, ніж подібні при інфекції вірусом дикого типу. Маркерну вакцину головним чином використовують у поєднанні з супутнім діагностичним тестом, який показує різницю у типах антитіл та демонструє, які тварини були вакцинованими та які тварини є інфіковані вірусом дикого типу. Така технологія є корисною у контролі та у знищенні вірусів популяції суб'єкту. Наступні приклади присутні тут як ілюстративний матеріал, але не повинні бути використані для обмежень обсягу винаходу. Багато змінень, варіацій, модифікацій, та інших використань та додатків цього винаходу будуть очевидні для фахівців. Приклади Приклад 1. Розчини Quil А /холестерин (QC) Quil A (Superfos) був розчинений у воді та був приготований 50 мг/мл базовий розчин. Холестерин, (Fabri Chem Inc.) був розчинений у етанолі та був приготований 18 мг/мл базовий розчин. Базовий розчин холестерину далі був відфільтрований з застосуванням 0.2-мікронового фільтра. Концентрації Quil А та холестерину у різних препаратах були як низькі, як 1/1 мкг/мл Quil А до холестерину, так і високі, як 1000/1000 мкг/мл. Для приготування базового 50/50мкг/мл розчину Quil А/холестерину, базовий розчин Quil А був розбавлений водою до концентрації 50 мкг/мл. Поки цей розчин перемішувався, було повільно додано базовий розчин холестерину до кінцевої концентрації 50 мкг/мл. Приклад 2. Розчини DDA (D) Диметил діоктадецил амонію бромід (DDA; Fluka Analytical), був розчинений у етанолі, та був приготований 18 мг/мл базовий розчин. Базовий розчин DDA був відфільтрований з застосуванням 0,2-мікронового фільтра. Приклад 3. Розчини Quil A /холестерин/DDA (QCD) Базовий розчин Quil А/холестерин був приготований відповідно до Прикладу 1 до бажаної концентрації. Базовий розчин DDA був приготований відповідно до Прикладу 2 та повільно доданий до базового розчину Quil А/холестерин. Розчини були змішані до досягнення бажаної 14 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кінцевої концентрації. РН розчину був відрегульований з NaOH або НСl у кількості, яке було необхідно для досягнення бажаного рН, що головним чином був у межах приблизно 6,9-7,5. Приклад 4. Розчини CARBOPOL® (С) CARBOPOL® (Noveon, Mexico) був розчинений у деіонізованій воді та був приготований 1.5 % базовий розчин. У іншому втіленні, CARBOPOL® був розчинений у деіонізованій воді та був приготований 0,75 % базовий розчин. Приклад 5. Розчини DDA/CARBOPOL® (DC) Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2. Був приготований базовий розчин 0.75 % CARBOPOL® відповідно до Прикладу 4. Розчини були змішані до досягнення бажаної кінцевої концентрації. Приклад 6. Розчини Quil А/Холестерин/DDA/CARBOPOL® (QCDC) Був приготований базовий розчин Quil А/Холестерин/DDA відповідно до Прикладу 3. Був приготований базовий розчин 0,75 % CARBOPOL® відповідно до Прикладу 4. Базовий розчин CARBOPOL® був повільно доданий до базового розчину Quil А/Холестерин/DDA до досягнення бажаної кінцевої концентрації. РН розчину був відрегульований з NaOH або НСl у кількості, що було необхідно для досягнення бажаного рН, який головним чином був у межах приблизно 6,97,5. Приклад 7. Розчини Bay R1005® (R) Для приготування базового розчину Bay R1005®, глюколіпід N-(2-деокси-2-L-лейциламіно-βD-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканоіламід був розчинений у етанолі (60 об. %). Далі додали Tween 20 та крижану оцтову кислоту. У одному прикладі, 3. 49 г N-(2-деокси-2-Lлейциламіно-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканоіламід був розчинений у 44,64 мл суміші етанол/вода (60 об. %). Це було поєднано з 1,12 мл Tween 20 та 0,68 мл крижаної оцтової кислоти. Приклад 8. Розчини Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL®/Bay R1005® (QCDCR) Базовий розчин Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® був приготований відповідно до Прикладу 6. Базовий розчин Bay R1005® був приготований відповідно до Прикладу 7. Розчин Bay R1005® був повільно доданий до розчину Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® до досягнення бажаної кінцевої концентрації. РН розчину був відрегульований NaOH або НСl у кількості, що було необхідно для досягнення бажаного рН, який головним чином був у межах приблизно 6,9-7,5. Приклад 9. Розчини DEAE декстрану (X) Базовий розчин DEAE декстрану (X) був приготований розчиненням 200 мг/мл DEAE декстрану у воді. Розчин може бути нагріто у автоклаві приблизно 20 хвилин при 120° Centigrade (C). Приклад 10. Розчини Quil А/холестерин/DDA/DEAE (QCDX) Базовий розчин Quil А/холестерин/DDA був приготований відповідно до Прикладу 3. Базовий розчин DEAE був приготований відповідно до Прикладу 9. Розчини були поєднані додаванням їх безпосередньо у гомогенізатор. При змішуванні був застосований спосіб -1 швидкого змішування з використанням поперечного зсуву більш ніж 1 000 сек . Змішування було проведено додаванням водного розчину безпосередньо у олійну фазу, яка містила неполярні ад'юванти та антигенні компоненти та змішувалася, доки не була досягнута гомогенна стабільна суміш. Як правило, це може тривати як мінімум кілька хвилин або більше, залежно від бажаного розміру частинок. Приклад 11. Олійні композиції (О) Був приготований базовий розчин олії шляхом комбінування мінеральної олії Drakeol з Tween 85 та Span 85, нагріванням до приблизно 55 °C та далі охолодженням та стерильною фільтрацією. Ця суміш, таким чином, складається з олійної фази основного компонента з носієм у олійній фазі. Якщо холестерин та/або DDA були відібрані як співпрацюючі імуномодулятори для однієї з цих композицій, вони також повинні бути додані до цієї суміші перед фільтрацією, так як вони розчиняються у олійній фазі. Приклад 12. Quil А/холестерин/DDA/DEAE/олійні композиції (QCDXO) Базовий розчин Quil А/холестерин/DDA/DEAE був приготований відповідно до Прикладу 10. Олійна базова композиція була приготована відповідно до Прикладу 11. Розчини були поєднані з Quil-A, DEAE-декстраном та водою для досягнення кількості при вказаних концентраціях. Ця водна фаза була змішана постійним збовтуванням реакції протягом декілька хвилин або довше при кімнатній температурі або вище та далі була стерильно відфільтрована та зберігалася для додавання до олійної фази. Водна фаза була повільно додана до олійної фази, яку постійно змішували Приклад 13. Приготування імуногенних композицій або вакцинних композицій 15 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген та один з ад'ювантів, що описані вище, бажаний антиген був доданий до відповідного буферу. Далі компоненти бажаного ад'юванту були додані, як описано вище. Отриманий розчин був доведений до кінцевого обсягу з буфером. Приклад 13а. Антиген, Quil А, Холестерин, DDA, CARBOPOL® Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil А, холестерин, DDA, та CARBOPOL®, бажаний антиген був доданий до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil А відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антигену. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А/холестерин. Розчин Антиген/Quil А/холестерин/DDA був гомогенізований та мікрофлюїдований. Був приготований 0,75 % розчин CARBOPOL® відповідно до Прикладу 4. Після мікрофлюїдування, розчин CARBOPOL® (0,05 об. %) був доданий до мікрофлюїдованої композиції та рН був відрегульований з NaOH або НСl до 6,9-7,5. Приклад 13b. Антиген, Quil А, Холестерин, DDA, CARBOPOL®, Bay R1005® Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil А, холестерин, DDA, CARBOPOL®, та Bay R1005®, бажаний антиген був доданий до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil А відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антигену. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А/холестерин. Розчин антиген/Quil А/холестерин/DDA далі був гомогенізований та мікрофлюїдований. 0.75 % розчин CARBOPOL® був приготований відповідно до Прикладу 4. Після мікрофлюїдування, розчин CARBOPOL® (0.05 об. %) був доданий до мікрофлюїдованої композиції та рН був відрегульований з NaOH або НСl-6,9-7,5. Був приготований базовий розчин Bay R1005® відповідно до Прикладу 7. Компонент Bay R1005® був додано до водної фази додавання DDA. Приклад 13с. Антиген, Quil А, Холестерин, DDA, DEAE декстран Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil А, холестерин, DDA, та DEAE декстран, бажаний антиген був доданий до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil А відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антигену. Композиція була гомогенізована. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А розчину впродовж гомогенізації. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А/холестерин впродовж гомогенізації. Розчин DEAE декстрану був приготований відповідно до Прикладу 9. Впродовж гомогенізації, було додано розчин DEAE декстрану та отримана композиція була доведена до кінцевого обсягу. Приклад 13d. Антиген, Quil А, Холестерин, DDA, DEAE декстран, олія Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil А, холестерин, DDA, DEAE декстран, та олію, бажаний антиген було додано до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil А відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антигену. Композиція була гомогенізована. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А впродовж гомогенізації. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданий до розчину антиген/Quil А/холестерин впродовж гомогенізації. Був приготований розчин DEAE декстрану відповідно до Прикладу 9 та доданий впродовж гомогенізації. Олійна композиція була приготована відповідно до Прикладу 11. Впродовж гомогенізації, олійна композиція була додана додаванням водної фази у олійну фазу під час гомогенізації та отримана композиція була доведена до кінцевого обсягу. Приклад 14. Вакцини вірусу кошачої лейкемії (FeLV) Тварини були випадково розподілені по групам лікування з застосуванням схеми рандомізованих повних блоків. Таблиця 1 показує план досліджень. Групи були сформовані на основі дати народження та окоту. Тварини були відсортовані по даті народження та потім по окоту. Були використані блоки по чотири тварини. У межах блоку, тварини були випадково розподілені для лікування. Для стадії вакцинації, два консекутивних блоки були об'єднані зі створенням групи з восьми тварин. Групи тварин були випадково розподілені до двох кімнат, так, що у кожній кімнаті містилося п'ять груп (10 блоків) тварин. У межах групи, тварини були випадково розподілені до чотирьох кліток, розміщених рядом таким чином, що кожна клітка містила дві тварини з однаковим лікуванням. Для фази інфікування, тварини з однієї кімнати вакцинації були випадково розподілені до будь-якої однієї або двох кімнат інфікування. З однієї 16 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 кімнати вакцинації тварини відбиралися у дві кімнати інфікування, взагалі мали п'ять блоків, випадковим чином відібраних до кожної кімнати інфікування(2.5 груп; 20 тварини). Інші кімнати інфікування містили 10 блоків (5 груп; 40 тварини). У межах кімнати інфікування, тварини у однаковому блоку були випадково розподілені до чотирьох кліток, розміщених поруч. Вакцини для цих досліджень були приготовані відповідно до Прикладу 13 за виключенням того, що був використаний базовий розчин 1,5 % CARBOPOL®. Особливо, була приготований ® LEUKOCELL 2 (Pfizer, Inc.) шляхом поширення FeLV, субгрупи А, В, та С, у FeLVтрансформованих лімфоїдних клітинах. Вірусні антигени були хімічно інактивовані, поєднані з стерильним ад'ювантом для посилення імунної відповіді, та розфасовані у вигляді рідини. Був приготований дослідний ветеринарний продукт (IVP), який містив вірус кошачої лейкемії та 25 мкг Quil А/ алюмінію гідроксид (ALHYDROGEL®) у загальній кількості 100 мл. Всього 94,5 мл 5 1,106×10 нг/мл FeLV базового розчину повільно перемішувалося протягом 15 хвилин. РН був відрегульований до 5,9-6,1 за допомогою 4N НСl або 18 % NaOH, у разі необхідності. Впродовж перемішування, до розчину антигену було додано 0,5 мл 5,0 мг/мл розчину Quil А. Далі, було повільно додано 5,0 мл 100 об. % ALHYDROGEL®. Композиція перемішувалася мінімум 2 години при 4 °C РН був відрегульований до 7,0-7,3 за допомогою 18 % NaOH або 1N НСl у разі необхідності. IVP, що містив вірус кошачої лейкемії та 37,5 мкг Quil А/алюмінію гідроксид (ALHYDROGEL®) був приготований таким самим чином, як для 25 мкг Quil A IVP, але до розчину антигену було додано 7,5 мл базового розчину Quil А. Взагалі було приготовано 350 мл дослідного ветеринарного продукту (IVP), який містив вірус кошачої лейкемії Quil А, холестерин, 5 DDA, та CARBOPOL®. Впродовж перемішування 349,3 мл 1,106×10 нг/мл базового розчину FeLV, до розчину антигену було повільно додано 0,14 мл 50,0 мг/мл розчину Quil А. Далі, було повільно додано 0,39 мл 18 мг/мл розчину холестерин/етанол. Композиція була гомогенізована протягом трьох хвилин при 10 000 об/хв. Взагалі було додано 0,19 мл 18,0 мг/мл розчину DDA/етанол до композиції впродовж перемішування. Взагалі було повільно додано 5,0 мл 1,5 % розчину CARBOPOL® до 145,0 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil А, холестерину, та DDA. РН був відрегульований до 7,0-7,3 за допомогою 18 % NaOH або 1N НСl у разі необхідності. 30 Таблиця 1 План досліджень Група лікування 1 a IVP 2 № тварини 3 Т01 Фізіологічний розчин 20 Т02 LEUKOCELL ® 2 25 мкг Quil b A/Аl(ОН) 20 Фаза вакцинації Фаза інфікування Відбір проб День Доза Шлях День Дозa Шлях День вакцинації (мл) введення інфікування (мл) введення 4 5 6 7 8 9 10 -2, 35, 64, 85, d 37, 40, 42 , 106, c e 0, 21 1,0 SC 1,0 ON 44 127, 134. 141, 148, 155 -2, 35, 64, 85, d 37, 40, 42 , 106, 0, 21 1,0 ПШ 1,0 ОН 44 127, 134, 141, 148, 155 17 UA 114787 C2 Продовження таблиці 1 План досліджень 1 2 3 4 5 6 7 8 Т03 LEUKOCELL ® 2 37.5 мкг Quil b A/Аl(ОН) 20 0, 21 1,0 ПШ 37, 40, 42 , 1,0 44 Т04 Перероблений LEUKOCELL ® 2 20 мкг Quil A /Холестерин b /DDA/CARBOPOL® 20 0, 21 1.0 ПШ 37, 40, 42 , 1,0 44 9 d ОН d ОН 10 -2, 35, 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, 155 -2, 35, 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, 155 а Дослідний ветеринарний продукт Змішаний, що має відносну імуногенність порівняльно до зразкової вакцини (FeLV зразок Lot No. 12) c SC = Підшкірно d Depo-Medrol®: Доба 42 (приблизно 5.0 мг/кг) внутрішньом'язово e ON = Ороназально Quil A - Холестерин = Сапонін, ад'ювант Quil А, включений у ліпідні частини холестерину. CARBOPOL® = Карбомер DDA = Диметилдіоктодециламонію бромід. b 5 10 15 20 25 Всі тварини вдень спостерігалися та спостереження записувалися. Температура тіла була поміряна та записана у всіх тварин крізь вушний канал у першу добу перед першим введенням дози вакцини та у 20 добу перед другим введенням дози вакцини. Пробу крові (1,0-2,0 мл) було зібрано у кожної тварини проколом з яремної вени у другу добу. Седативні дози TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) були введені відповідно до маси тіла (приблизно 5,0 мг/кг), внутрішньом'язово, у намаганні зменшити стрес у тварин та ухилитися від пошкоджень персоналу під час відбору крові. Кров була зібрана у туби для розділення сироватки (SST) та оброблена для розділення сироватки. Сироватку зберігали при -20 °C або ще холодніше до випробування. Плацебо або вакцини FeLV були введені кошенятам підшкірно у дозі 1,0 мл. Перша вакцинація була проведена у нульову добу та друге введення вакцини було проведено у 21 добу. Всі тварини спостерігалися приблизно одну годину після першої та другої вакцинації для спостереження негайних місцевих больових реакцій (реакцій гострого болю). Спостереження були документально зафіксовані. Температура тіла всіх тварин були виміряна крізь вухо у 1 та 2 добу після першого введення дози вакцини, та у 22 та 23 добу після другого введення дози вакцини. Реакції у місці ін'єкції (опухлості) були також визначені у першу добу після першої вакцинації та у 22 та 23 добу після другої вакцинації. Проби крові (1,0-2,0 мл) були зібрані з кожної тварини проколом з яремної вени у 35 добу, оброблені для розділення сироватки, та зберігали при -20 °C або холодніше, до випробування. У 35 добу, тварини були розміщені у індивідуальних ізольованих клітках. Вірусом для інфікування був вірулентний вірус кошачої лейкемії (FeLV), штам Rickard, з приблизним титром 6.1 10 ТСID50/мл. Препарат для інфікування FeLV був розморожений та зберігався у вологому льоді перед введенням. Тварини були інфіковані на 37, 40, 42, та 44 добу, назальним 18 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 введенням 1,0 мл нерозбавленого препарату. 1 мл туберкуліновий шприц, без голки, був наповнений препаратом введення. Кожному кошеняті було введено приблизно 0,5 мл у ніздрю. У 42 добу, інфікування було проведено приблизно за 5 годин після введення DEPO-MEDROL®. Після кожної доби інфікування, зберігалася проба препарату введення для підтверджувального титрування. Після інфікування, пробу крові (1,0-2,0 мл) було зібрано з кожної тварин проколом з яремної вени, у 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, та 155 добу. Седативні дози TELAZOL® (Fort Dodge) були введені, як описано вище. Кров був зібрано у туби для розділення сироватки (SST), приготовані для розділення сироватки, та зберігалася при -20 °C або нижче до випробування. Проби сироватки були перевірені на присутність FeLV р27 антигену (маркер FeLV інфекції) від ELISA (IDEXX; Westbrook, ME). Кінцеві результати були оцінені по інтенсивності розповсюдження кольору та на спектрофотометрі при оптичної щільності 405/490 нм. Для чинного тесту, позитивний контроль оптичної щільності спадав між 0,131-2,999 та негативний контроль повинен був мати оптичну густину нижче або дорівнювати 0,0039. Виділення вірусу було проведено з застосуванням проб сироватки, зібраних у 2 та 35 добу. Проби сироватки 127-155 доби були розглядані для оцінки ефективності вакцини FeLV. Проби сироватки 127 доби (тиждень 12), 134 доби (тиждень 13), 141 доби (тиждень 14), 148 доби (тиждень 15) та 155 доби (тиждень 16) були перевірені на присутність FeLV p27 антигену. Тварина вважалася тривало інфікованою, якщо вона мала три або більше позитивних тесту на FeLV p27 антиген протягом 127 доби (тиждень 12) до 155 доби (тиждень 16). Температури були проаналізовані з застосуванням змішаної моделі лінійних повторних вимірювань, та були виконані попарні порівняння між групами лікування Т01 та Т02, Т03, та Т04 у кожному моменті часу, якщо прояви у загальному лікуванні та/або у лікуванні у моменті часу були істотні. Квадратні мінімуми означають 95 % довірчі інтервали, мінімуми та максимуми були обчислені для кожного лікування у кожному моменті часу. Частотні розподіли присутності реакцій гострого болю були обчислені для кожного лікування та дані моменті часу були зібрані. Частотні розподіли присутності опухлостей місця ін'єкції були обчислені для кожного лікування та дані на момент часу були зібрано. Частотні розподіли присутності пост-вакцинаційних системних реакцій були обчислені для кожного лікування. Негайні реакції не спостерігали у будь-якої з груп лікування протягом першої та другої вакцинації. Шкідливі реакції не спостерігалися у будь-якої з груп лікування протягом приблизно однієї години після першої та другої вакцинації. Ні пірексія (температура тіла ≥39,5 °C) ні гіпотермія (температура тіла 0,08). Опухлості у місці Ін'єкції не спостерігалися у будь-якої з груп лікування після першої та другої вакцинації. Кінцеві результати з 12 тижня до 16 тижня пост-інфікування показали, що 16 з 19 тварин (84 %) що отримали плацебо (Т01 група) були тривало віремічні до FeLV. 13 з 19 тварин (68 %) у групі Т02 були захищені від вірулентного інфікування FeLV. Рівень захисту був статистично значним (р = 0,0004) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 12 з 19 тварин (63 %) у групі Т03 були захищені від вірулентного інфікування FeLV. Рівень захисту був статистично значним (р = 0,0013) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 19 з 20 тварини (95 %) у групі Т04 були захищені від вірулентного інфікування FeLV. Рівень захисту був статистично значним, (р = 0,0001) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. Отже, всі вакцини, що були введені групам Т02, Т03 та Т04 продемонстрували безпечність у кошенят мінімального віку, при введенні у дводозовому режимі, три тижні окремо. На додаток, вакцини, введені цим групам були також здатні до суттєвого зниження рівню FeLV тривалої віремії у кошенят мінімального віку, коли вони введені при введенні у дводозовому режимі, три тижні окремо. Було статистично значне скорочення у створенні тривалої віремії FeLV кошенят у групах Т02, Т03 та Т04. На додаток, була статистично важлива різниця між Т04 та іншими вакцинованими групами (Т02, Т03). Було несподівано та неочікуване те, що вакцини, який містить новий препарат ад'юванту виявилися більш ефективними, ніж ті, які містять компоненти ад'юванту, що звичайно використовують у кішок. Приклад 15. Вакцини вірусу кошачої лейкемії Кошенята були акліматизовані 16 діб після прибуття. Тварини були далі випадково розподілені до кімнати, та у межах кімнати, були випадково розподілені на лікування (1 тварина на лікування у кожній кімнаті). Пробу крові(1,0-2,0 мл) було зібрано у кожній тварині проколом з яремної вени у - 1 добу досліджень. Седативні дози TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) були введені відповідно до маси тіла (приблизно 5,0 мг/кг) внутрішньом'язово у намаганні зменшити стрес у тварин та ухилитися від пошкоджень персоналу під час відбору крові. Кров було зібрано 19 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 у туби для розділення сироватки та оброблено для розділення сироватки. Всі тварини також спостерігалися протягом доби, та спостереження були записані. Вакцини були приготовані відповідно до Прикладу 13 за виключенням того, що був ® використаний 1.5 % базовий розчин CARBOPOL®. LEUKOCELL 2 був приготований шляхом поширення FeLV, субгрупи А, В, та С, у FeLV-трансформованих лімфоїдних клітинах. Вірусні антигени були хімічно інактивовані, поєднані з стерильним ад'ювантом для посилення імунної відповіді, та розфасовані у вигляді рідини. Загальна кількість 500.0 мл IVP, що містить вірус кошачої лейкемії з відносною ефективністю (ВІ) - 2, а також Quil А, холестерин, та DDA був приготований наступним способом. 20,7 мл базового розчину FeLV (50,0 ВІ/мл, де 1 ВІ = 3,624 нг/мл антигену) було додано до 478,2 мл 0,063 % PBS буферу. Впродовж перемішування, 0,21 мл 50,0 мг/мл розчину Quil А було повільно додано до розчину антигену. Далі, було повільно додано 0,58 мл 18 мг/мл розчину холестерин/етанол. Далі до композиції впродовж перемішування був повільно доданий розчин 0,29 мл 18,0 мг/мл DDA/етанол. Композиція була гомогенізована три хвилини при 10 000 об/хв. Композиція була далі мікрофлюїдована одним проходом крізь 200-мікронну камеру з обмеженим розміром при 10 000 (+500) фунтів на квадратний дюйм. Впродовж перемішування, 10,0 мл 1,5 % розчину CARBOPOL® було повільно додано до 290,0 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil А, холестерину, та DDA. РН був відрегульований до 7,0-7,3 додаванням 18 % NaOH або 1N НСl у разі необхідності. IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 5 був приготований таким само чином, як IVP з а ВІ - 2, з застосуванням 51,7 мл базового розчину FeLV та 447,2 мл 0,063 % PBS буфера, кількості інших компонентів залишаються незмінними. IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 10 був приготований таким саме чином, як IVP з ВІ - 2, з застосуванням 93,1 мл базового розчину FeLV, 355,9 мл 0,063 % PBS буферу, 0,19 мл розчину Quil A, 0,52 мл розчину холестерину, та 0,26 мл розчину DDA (загальний обсяг 450 мл). Далі, 8,3 мл 1,5 % розчин CARBOPOL® був повільно доданий до 241,7 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil А, холестерину, та DDA. IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 15 був приготований таким само чином, як IVP з ВІ - 10 з застосуванням 139.7 мл базового розчину FeLV та 309.4 мл 0.063 % PBS буферу, кількості інших компонентів залишаються незмінними. IVP який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 20 був приготований таким саме чином, як IVP з ВІ - 2 з застосуванням 206.9 мл базового розчину FeLV та 292,0 мл 0,063 % PBS буферу, кількості інших компонентів залишаються незмінними. Для введення 0,5 мл дози, 300,0 мл IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 5, Quil А, холестерин, DDA, та CARBOPOL® був приготований наступним способом. 21,7 мл базового розчину FeLV (35,8 ВІ/мл, де 1 ВІ = 1,864 мкг /мл антигену) було додано до 277.7 мл 0,063 % PBS буферу. Впродовж перемішування, 0,12 мл 50,0 мг/мл розчину Quil А було повільно додано до розчину антигену. Далі, було повільно додано 0,35 мл 18 мг/мл розчину холестерин/етанол. Загалом до композиції впродовж перемішування було повільно додано 0,17 мл 18,0 мг/мл розчину DDA/етанол. Композиція була гомогенізована три хвилини при 10 000 об/хв. Далі композиція була мікрофлюїдована одним проходом крізь 200-мікронову камеру з обмеженим розміром при 10 000 (+ 500) фунтів на квадратний дюйм. Впродовж перемішування, 3.3 мл 1.5 % розчин CARBOPOL® було повільно додано до 96.7 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil А, холестерину, та DDA. РН був відрегульований до 7,0-7,3 додаванням 18 % NaOH або 1N НСl, у разі потреби. IVP для введення а 1.0 мл дози вірусу кошачої лейкемії з ВІ - 5, Quil A, холестерином, DDA, та CARBOPOL® був приготований таким само чином, як для 0.5 мл дози з відповідно відрегульованими кількостями. Взагалі було приготовано 300.0 мл IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 10 та CARBOPOL®. 62,1 мл базового розчину FeLV (50.0 ВІ/мл, де 1 ВІ = 3,624 мкг /мл антигену) було додано до 237,9 мл 0,063 % PBS буферу. Композиція була гомогенізована три хвилини при 10 000 об./хв. Далі композиція була мікрофлюїдована одним проходом крізь 200-мікронну камеру з обмеженим розміром при 10 000 (+500) фунтів на квадратний дюйм. Впродовж перемішування, 3,3 мл 1,5 % розчин CARBOPOL® було повільно додано до 96,7 мл композиції вірусу кошачої лейкемії. РН був відрегульований до 7,0-7,3 додаванням 18 % NaOH або 1N НСl у разі необхідності. Плацебо та вакцини FeLV (Таблиця 2) були введені кошенятам підшкірно з застосуванням голки 22 калібру х ¾" та 3 сс шприцу у 0 та 20 добу досліджень. Групі лікування Т01 був введений плацебо вакцини з дозою 1,0 мл. Групам лікування Т02, Т04, Т05, Т06, Т07, Т08 та Т09 були введені вакцини FeLV з дозою 1,0 мл. Групі лікування Т03 було введено вакцину FeLV з 20 UA 114787 C2 дозою 0,5 мл. Групі лікування Т10 було введено FeLV пташиного вірусу (canarypox) вакцину (Meriaл) внутрішньошкірно з застосуванням внутрішньошкірногопістолетного ін'єктора. Таблиця 2 План досліджень Група № лікування тварини Т01 Т02 10 Т06 10 Т07 10 Т08 10 Т09 10 Т10 20 10 Т05 15 10 Т04 10 10 Т03 5 10 10 Цільова відносна ефективність Шлях введення N.А. ПШ Вакцина PBS Ад'ювант No ад'юванту Quil A Інактивований Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Quil A Інактивований 5 ВІ ПШ / 0.5 мл Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Quil A Інактивований 20 ВІ ПШ Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Quil A Інактивований 15 ВІ ПШ Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Quil A Інактивований 10 ВІ НІН Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Quil A Інактивований 5 ВІ ПШ Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Quil A Інактивований 2 ВІ ПШ Холестерин DDA FeLV CARBOPOL® Інактивований 10 ВІ ПШ CARBOPOL® FeLV Живий rFeLV Живий rFeLV ID Без ад'юванту (Merial) (Merial) 5 ВІ ПШ Середа культури клітин Нормальний фізіологічний розчин RPMI RPMI Cellgro Cellgro Cellgro Cellgro Cellgro Cellgro Приватний (Merial) Всіх тварин спостерігали після першої вакцинації (0 доба досліджень) та другої вакцинації (20 доба досліджень) для спостереження ознак болю під час введення тестової вакцини, в тому числі застосування голосу, дряпання/кусання, проявів агресії та спроб втечі. Також був документально зафіксований пост-вакцинаційний стан тварин (нормальний або ненормальний). Всі тварини спостерігалися приблизно одну годину після введення вакцини у 0 добу досліджень та 20 добу досліджень для спостережень розвитку шкідливих систематичних реакцій. Спостереження були документально зафіксовані. Місця вакцинації були пальповані, та записані випадки болю у місці ін'єкції, почервоніння у місці ін'єкції, опухлості у місці ін'єкції та розмір опухлості у місці ін'єкції. Спостереження були проведені на 2,5 та 9 добу досліджень після першої вакцинації, та на 25, 28 та 32 добу досліджень після другої вакцинації. Спостереження були документально зафіксовані. Пробу крові (1,0-2,0 мл) було зібрано з кожної тварини проколом з яремної вени на 32 добу досліджень (преінфікування). Тварини були інфіковані на 34, 36, 39, та 41 добу досліджень назальним введенням 1,0 мл нерозбавленого препарату введення. 1 мл туберкуліновий шприц, без голки, був наповнений препаратом введення. Кожне кошеня отримало приблизно 0,5 мл у 6.1 ніздрю. Препарат для інфікування FeLV мав середній титр 10 ТСID50/мл. Пробу крові (1,0-2,0 мл) далі було зібрано з кожної тварини проколом з яремної вени на 61, 83, 106, 126, 133, 138, 146, та 152 добу досліджень. Протягом першої (0 доба досліджень) вакцинації, три тварини у групі лікування Т09 показали негайну реакцію типу гострого болю. Протягом другої вакцинації (20 доба досліджень), одна 21 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 тварина з групі лікування Т05, чотири з групі лікування Т08, та дві з групі лікування Т09 продемонстрували негайні реакції типу гострого болю. Протягом першої вакцинації, три тварини у групі лікування Т09 продемонстрували слабке застосування голосу. У тварин, які відчували біль при першій вакцинації також у той час спостерігалося слабке застосування голосу. Протягом другої вакцинації, одна тварина у групі лікування Т05, чотири у групі лікування Т08, та дві у групі лікування Т09 продемонстрували слабке застосування голосу. У тварин, які відчували біль при другій вакцинації також у той час спостерігалося слабке застосування голосу. Протягом першої вакцинації, три тварини у групі лікування Т09 продемонстрували агресивну поведінку/спробу до втечі. Протягом другої вакцинації, одна тварина у групі лікування Т05, чотири у групі лікування Т08, та дві у групі лікування Т09 продемонстрували агресивну поведінку/спробу до втечі. Жодна з груп лікування не проявила випадків дряпання/кусання у місці ін'єкції під час першої або другої вакцинації. Реакції у місці ін'єкції не спостерігалися у жодної з груп лікування після першої або другої вакцинації. Шкідливі реакції також не спостерігалися у жодної з груп лікування. Всі тварини були негативними на FeLV p27 антиген перед вакцинацією, як свідчать проби сироватки, що були зібрані у - 1 добу. Всі тварини також виявилися негативними на FeLV p27 антиген перед інфікуванням, як свідчать проби сироватки, що були зібрані у добу 32. Загальні результати з 12 тижня по 16 тиждень після інфікування (Таблиця 3) показали, що 9 з 10 тварин (90 %) у групі лікування Т01 (плацебо) були тривало віремічні до FeLV. Результати того ж самого періоду показали, що 6 з 10 тварин (60 %) у групі лікування Т02 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту не був статистично значним (р = 0,0573), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 9 з 10 тварин (90 %) у групі лікування Т03 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (р = 0,0011) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 10 з 10 тварин (100 %) у групі лікування Т04 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (р = 0,0001), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 10 з 10 тварин (100 %) у групі лікування Т05 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (р = 0,0001), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 7 з 10 тварин (70 %) у групі лікування Т06 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (р = 0,0198), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 10 з 10 тварин (100 %) у групі лікування Т07 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (р = 0,0001), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 8 з 10 тварин (80 %) у групі лікування Т08 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (р = 0,0055), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 5 з 10 тварин (50 %) у групі лікуванняТ09 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту не був статистично значним (р = 0,1409), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. Зрештою, 6 з 10 тварин (60 %) у групі лікування Т10 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту не був статистично значним (р = 0,0573), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. Таблиця 3 Резюме рівня захисту Група лікування Т01 Т02 Т03 Т04 T05 Т06 Т07 Т08 Т09 45 Відносна ефективність вакцини NA 4,58 4,58 26,32 18,58 11,16 4,77 1,64 11,12 Рівень захисту 10 % 60 % 90 % 100 % 100 % 70 % 100 % 80 % 50 % Профілактичне розділення 55,6 % 88,9 % 100 % 100 % 66,7 % 100 % 77,8 % 44,4 % Вакцини, що було використано у групах лікування Т02, Т03, Т04, Т06 та Т07 продемонстрували задовільний рівень безпечності протягом першої вакцинації, так як у цей час 22 UA 114787 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ніяких реакцій не було спостережено. Одна тварина у групі лікування Т05 продемонструвала негайну реакцію (біль при введенні, слабке застосування голосу та агресивні прояви/спробу втечі) при другій вакцинації. Ця подія більш може бути пов'язана з ускладненою відповіддю на вакцинацію для конкретної тварини, ніж до проблем препарату вакцини. Всі вакцини продемонстрували задовільний рівень безпечності протягом пост-вакцинації, так як ніяких місцевих реакцій або шкідливої дії, пов'язаних з вакцинацією не спостерігалися. Вакцини FeLV, введені до груп лікування Т03, Т04, Т05, Т07 та Т08 продемонстрували задовільну ефективність, оскільки після інфікування вірулентним FeLV був досягнутий ≥80 % захист (≥75 % превентивної частки). Ця вакцина, яку отримала група Т07 забезпечила 100 % захист, що було несподівано та неочікуване, так як тварини у цій групі отримали 25 % та 33 % від дози антигену тварин у групах Т04 та Т05, відповідно. Явною перевагою ад'ювантів, виявлених та перевірених тут є те, що вони дозволяють застосовувати менші дози антигену, в той же час повністю викликаючи захисну імунну відповідь. Вакцини, введені групам лікування Т02, Т06 та Т09 продемонстрували дещо понижену ефективність (