Нові ад’ювантні композиції
Номер патенту: 104138
Опубліковано: 10.01.2014
Автори: Доміновскі Пол Джозеф, Чілдерс Тедд Алан, Зан Шучен, Вератна Рісіні Дамміка, Маннан Рамасамі Маннар, Кребс Річард Лі, Баґі Седо Мартін, Ольсен Марі Кетрін, Янсей Роберт Джон Джр., Томпсон Джеймс Річард
Формула / Реферат
1. Імуногенна композиція, що включає композицію ад'юванту та імунологічно ефективну кількість антигенного компоненту, де композиція ад'юванту містить сапонін, стерол, сполуку четвертинного амонію, полімер, який є поліакриловим полімером, ODN/ORN та, необов'язково, гліколіпід.
2. Імуногенна композиція за п. 1, де сапонін є присутнім у кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 5000 мкг на дозу, стерол є присутнім у кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 5000 мкг на дозу, сполука четвертинного амонію є присутньою у кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 5000 мкг на дозу, та полімер є присутнім у кількості від приблизно 0,0001 об.% до приблизно 75 об.%.
3. Імуногенна композиція за п. 1, де сапонін являє собою Quil А або його очищену фракцію, стерол являє собою холестерин, сполуки четвертинного амонію являють собою диметил діоктадецил амоній бромід (DDA), ODN/ORN являє собою CpG, а вказаний необов'язково присутній гліколіпід являє собою N-(2-дeзoкcи-2-L-лeйцилaмiнo-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканамід ацетат.
4. Імуногенна композиція за п. 1, що включає гліколіпід, який являє собою N-(2-дeзoкcи-2-L-лeйцилaмiнo-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканамід ацетат.
5. Імуногенна композиція за п. 4, де гліколіпід є присутнім у кількості від приблизно 0,01 мг до приблизно 10 мг на дозу.
6. Імуногенна композиція за п. 1, де вказаний антигенний компонент містить інактивований вірус.
7. Спосіб отримання імуногенної композиції за п. 1, що включає:
a) отримання композиції антигенного компоненту у буфері та додавання ODN/ORN до вказаної композиції;
b) додавання сапоніну до композиції етапу а;
c) додавання стеролу до композиції етапу b;
d) додавання четвертинної сполуки амонію до композиції етапу c;
e) додавання полімеру до композиції етапу d; та, необов'язково,
f) додавання гліколіпіду до композиції етапу e.
8. Спосіб за п. 7, де сапонін являє собою Quil А або його очищену фракцію, стерол являє собою холестерин, сполуки четвертинного амонію являють собою DDA, ODN/ORN являє собою CpG, а вказаний необов'язково присутній гліколіпід являє собою N-(2-дeзoкcи-2-L-лeйцилaмiнo-β-D-глюкoпipaнoзил)-N-oктaдeцилдoдeкaнaмiд ацетат.
9. Спосіб за п. 7, що додатково включає етап гомогенізації композиції етапу а та безперервну гомогенізацію під час кожного з етапів а - d.
10. Спосіб за п. 9, що додатково включає етап мікрофлюїдизації композиції етапу d.
11. Спосіб за п. 7, де гліколіпід являє собою N-(2-дeзoкcи-2-L-лeйцилaмiнo-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканамід ацетат.
12. Вакцинна композиція, що включає ад'ювантну композицію та терапевтично ефективну кількість антигенного компоненту, де ад'ювантна композиція включає сапонін, стерол, сполуку четвертинного амонію, полімер, який є поліакриловим полімером, ODN/ORN та, необов'язково, гліколіпід.
13. Вакцинна композиція за п.12, де сапонін є присутнім у кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 5000 мкг на дозу, стерол є присутнім у кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 5000 мкг на дозу, сполука четвертинного амонію є присутньою у кількості від приблизно 1 мкг до приблизно 5000 мкг на дозу, та полімер є присутнім у кількості від приблизно 0,0001 об.% до приблизно 75 об.%.
14. Вакцинна композиція за п. 12, де сапонін являє собою Quil А або його очищену фракцію, стерол являє собою холестерин, сполуки четвертинного амонію являють собою DDA, а полімер є поліакриловою кислотою.
15. Вакцинна композиція за п. 12, що додатково включає гліколіпід, який являє собою N-(2-дезокси-2-L-лейциламіно-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканамід ацетат.
16. Вакцинна композиція за п. 15, де гліколіпід являє собою N-(2-дезокси-2-L-лeйцилaмiнo-β-D-глюкoпіpaнoзил)-N-oктaдeцилдoдeкaнaмiд ацетат.
17. Вакцинна композиція за п. 15, де гліколіпід є присутнім у кількості від приблизно 0,01 мг до приблизно 10 мг на дозу.
18. Вакцинна композиція за п. 12, де вказаний антигенний компонент включає інактивований вірус.
19. Спосіб одержання вакцинної композиції за п. 12, що включає:
a) отримання композиції антигенного компоненту у буфері та додавання ODN/ORN до вказаної композиції;
b) додавання сапоніну до композиції етапу а;
c) додавання стеролу до композиції етапу b;
d) додавання четвертинної сполуки амонію до композиції етапу с;
е) додавання полімеру до композиції етапу d; та, необов'язково,
f) додавання гліколіпіду до композиції етапу е.
20. Спосіб за п. 19, де сапонін являє собою Quil А або його очищену фракцію, стерол являє собою холестерин, а сполука четвертинного амонію являє собою DDA.
21. Спосіб за п. 19, що додатково включає етап гомогенізації композиції та безперервну гомогенізацію протягом кожного з етапів а - d.
22. Спосіб за п. 21, що додатково включає етап мікрофлюїдизації композиції етапу d.
23. Спосіб за п. 19, де гліколіпід являє собою N-(2-дeзoкcи-2-L-лeйцилaмiнo-β-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканамід ацетат.
24. Імуногенна композиція за п. 1, що додатково включає олію.
25. Вакцинна композиція за п. 12, що додатково включає олію.
26. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, де антигенний компонент включає вірус котячої лейкемії.
27. Спосіб за будь-яким одним з пп.7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає вірус котячої лейкемії.
28. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає вірус котячої лейкемії.
29. Вакцинна композиція за п. 28, де вірус котячої лейкемії є присутнім у кількості від приблизно 100 нг/мл до приблизно 350000 нг/мл включно.
30. Вакцинна композиція за п. 1, де антигенний компонент включає gp70, одержаний за допомогою клітинної лінії FL-74, персистентно інфікованої вірусом котячої лейкемії штаму KT-FeLV-UCD-1.
31. Спосіб лікування кішок від інфекції, спричиненої вірусом котячої лейкемії, що включає введення кішці вакцинної композиції за п. 28.
32. Застосування вакцини за п. 28 у приготуванні лікарського засобу для лікування кішок від інфекції,спричиненої вірусом котячої лейкемії.
33. Вакцина проти пташиного кокцидіозу для введення in ovo, яка містить:
(a) ад'ювант, що включає Quil А або його очищену фракцію, включаючи QS21, холестерин, CARBOPOL, DDА та R1005; та
(b) протозойний антиген, який являє собою рекомбінантний білок Е. maxima (білок 3-1Е) або сирий клітинний екстракт Е. maxima.
34. Імуногенна композиція за будь-яким одним з пп. 1-6 та 24, де антигенний компонент включає бактерин Escherichia coli штаму J-5.
35. Спосіб за будь-яким одним з пп. 7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає бактерин Escherichia coli штаму J-5.
36. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18 та 25, де антигенний компонент включає бактерин Escherichia coli штаму J-5.
37. Спосіб лікування корів від інфекції, спричиненої Escherichia coli, що включає введення великій рогатій худобі вакцинної композиції за п. 36.
38. Застосування вакцинної композиції за п. 36 у приготуванні лікарського засобу для лікування великої рогатої худоби від інфекції, спричиненої Escherichia coli.
39. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, де антигенний компонент включає вірус діареї великої рогатої худоби (BVDV).
40. Імуногенна композиція за п. 39, де антигенний компонент включає BVDV типу 1 (BVDV-1) та BVDV типу 2 (BVDV-2).
41. Спосіб за будь-яким одним з пп.7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає BVDV.
42. Спосіб за п. 41, де антигенний компонент включає BVDV-1 та BVDV-2.
43. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає BVDV.
44. Вакцинна композиція за п. 43, де антигенний компонент включає BVDV-1 та BVDV-2.
45. Спосіб лікування великої рогатої худоби від інфекції, спричиненої BVDV, що включає введення великій рогатій худобі вакцинної композиції за п. 43 або п. 44.
46. Застосування вакцинної композиції за п. 43 або п. 44 у приготуванні лікарського засобу для лікування великої рогатої худоби від інфекції, спричиненої BVDV.
47. Імуногенна композиція за будь-яким одним з пп. 1-6, де антигенний компонент включає Mycoplasma hyopneumonia (М. hyopneumonia).
48. Спосіб за будь-яким одним з пп.7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає М. hyopneumonia.
49. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає М. hyopneumonia.
50. Спосіб лікування свиней від інфекції, спричиненої М. hyopneumonia, що включає введення свині вакцинної композиції за п. 49.
51. Застосування вакцинної композиції за п. 49 у приготуванні лікарського засобу для лікування свиней від інфекції, спричиненої М. hyopneumonia.
52. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, де антигенний компонент включає вірус котячого грипу (FIV).
53. Спосіб за будь яким одним з пп. 7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає FIV.
54. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп.12-18, де антигенний компонент включає FIV.
55. Спосіб лікування кішок від інфекції, спричиненої FIV, що включає введення кішці вакцинної композиції за п. 54.
56. Застосування вакцинної композиції за п. 54 у приготуванні лікарського засобу для лікування кішок від інфекції, спричиненої FIV.
57. Імуногенна композиція за будь-яким одним з пп. 1-6 , де антигенний компонент включає раковий антиген.
58. Спосіб за будь-яким одним з пп.7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає раковий антиген.
59. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає раковий антиген.
60. Спосіб лікування суб'єкта від раку, що включає введення суб'єктові вакцинної композиції за п. 59.
61. Застосування вакцинної композиції за п. 59 у приготуванні лікарського засобу для лікування суб'єкта від раку.
62. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1, 2, 4, 5, 6, 24, де ORN/ODN являє собою CpG.
63. Спосіб за будь-яким одним з пп. 7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де ORN/ODN являє собою CpG.
64. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, та п.25, де ORN/ODN являє собою CpG.
65. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, де антигенний компонент включає собачий коронавірус (CCV).
66. Спосіб за будь-яким одним з пп. 7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає CCV.
67. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає CCV.
68. Спосіб лікування собак від інфекції, спричиненої CCV, що включає введення собаці вакцинної композиції за п. 67.
69. Застосування вакцинної композиції за п. 67 у приготуванні лікарського засобу для лікування собак від інфекції, спричиненої CCV.
70. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, де антиген включає ротавірус великої рогатої худоби.
71. Спосіб за будь-яким одним з пп. 7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає ротавірус великої рогатої худоби.
72. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає ротавірус великої рогатої худоби.
73. Спосіб лікування великої рогатої худоби від інфекції, спричиненої ротавірусом великої рогатої худоби, що включає введення великій рогатій худобі вакцинної композиції за п. 72.
74. Застосування вакцинної композиції за п. 72 у приготуванні лікарського засобу для лікування великої рогатої худоби від інфекції, спричиненої ротавірусом великої рогатої худоби.
75. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-6, де антигенний компонент включає вірус собачого грипу (CIV).
76. Спосіб за будь-яким одним з пп. 7-11 та будь-яким одним з пп. 19-23, де антигенний компонент включає CIV.
77. Вакцинна композиція за будь-яким одним з пп. 12-18, де антигенний компонент включає CIV.
78. Спосіб лікування собак від інфекції, спричиненої CIV, що включає введення собаці вакцинної композиції за п. 77.
79. Застосування вакцинної композиції за п. 77 у приготуванні лікарського засобу для лікування собак від інфекції, спричиненої CIV.
Текст
Реферат: Винахід стосується імуногенної композиції, що включає композицію ад'юванту та імунологічно ефективну кількість антигенного компоненту, де композиція ад'юванту містить сапонін, стерол, сполуку четвертинного амонію, полімер, який є поліакриловим полімером, ODN/ORN та, необов'язково, гліколіпід. UA 104138 C2 (12) UA 104138 C2 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід головним чином стосується нових ад'ювантних препаратів для підсилення імунної відповіді на антигени для використання у імуногенних та вакцинних композиціях, без продукування токсичних або неочікуваних побічної дії у суб'єкті. Цей винахід також стосується способів приготування та використання ад'юванту, імуногенних та вакцинних композицій. Бактеріальні, вірусні, та спричинені паразитами інфекції є широко поширеними у людей та тварин. Хвороби, спричинені цими інфекційними агентами є часто стійкими до антимікробної фармацевтичної терапії, без ефективних засобів лікування. Отже, шлях створення вакцин все частіше використовують для контролю інфекційних захворювань. Цілий інфекційний патоген може бути зроблений придатним для використання у препараті вакцини після хімічної інактивації або відповідної генетичної маніпуляції. Крім того, білкова субодиниця патогену може бути експресована у рекомбінантній системі експресії та очищена для використання у препараті вакцини. Вакцини можуть бути зроблені більш дієздатними додаванням у композицію відповідного ад'юванту. Також є підвищений інтерес у застосуванні вакцинології для лікування раку у тварин та людей. Цей терапевтичний підхід до лікування рака полягає у вакцинації пацієнтів, хворих на рак вакциною, що містить специфічний до пухлин антиген та ад'ювант. Проте, жодна з багатьох подібних вакцин не була схвалена регулювальними органами. Не показано, що вакцини здатні зменшувати пухлини, застосування стандартних засобів ліків проти раку є більш дієвим. Термін "ад'ювант" головним чином стосується будь-якого препарату, що збільшує гуморальну або клітинну імунну відповідь на антиген. Ад'юванти використовують для досягнення двох цілей - вони сповільнюють вивільнення антигенів з місця ін'єкції та вони стимулюють імунну систему. Традиційні вакцини головним чином складаються з грубого приготування інактивованих або вбитих або модифікованих живих патогенних мікроорганізмів. Домішки, пов'язані з цими культурами патологічних мікроорганізмів можуть виступати в якості ад'юванту для посилення імунної відповіді. Проте, імунітет, викликаний вакцинами, де як антигени використовують гомогенні препарати патологічних мікроорганізмів або очищені білкові субодиниці, часто низький. Отже, становиться необхідним додавання певних екзогенних речовин, таких як ад'юванти. Більш того, виробництво синтетичних та субодиничних вакцин багато коштує. Додавання ад'юванту може дозволити використання поменшеної дози антигену для стимуляції подібної імунної відповіді, таким чином знижуючи ціну виробництва вакцини. Отже, ефективність деяких придатних для введення шляхом ін'єкції лікувальних агентів може бути суттєво підвищена, коли агент є поєднаним з ад'ювантом. Багато факторів повинні бути прийняті до уваги при підборі ад'юванту. Ад'ювант повинен викликати відносно повільний рівень вивільнення та ефективне поглинення антигену з мінімальними токсичними, алергенними, запальними, та іншими неочікуваними проявами в організмі господаря. Бажано, щоб ад'ювант був невіроцидним, здатним до біологічного розпаду, здатним послідовно створювати високий рівень імунітету, здатним стимулювати перехресний захист, сумісним з численними антигенами, дієздатним у численних різновидах, нетоксичним та безпечним для господаря(наприклад, без реакцій у місті ін'єкції). Іншими бажаними характеристиками ад'юванту є здатність до мікродозування, якщо доз недостатньо, чудова стійкість при зберіганні, він повинен піддаватися сушінню, може бути зроблений без додавання олій, може існувати як у твердому, так та у рідкому стані, бути ізотонічним, здатним до легкого виробництва, та недорогим. Зрештою, дуже бажано для ад'юванту бути здатним утворювати різні конфігурації для викликання гуморальної, або клітинної імунної відповіді, або обох, у залежності від вимог сценарію вакцинації. Проте, кількість ад'ювантів, що може відповідати вищезгаданим умовам є обмеженою. Вибір ад'юванту залежить від потреб для вакцини, будь-то збільшення розміру або функції відповіді антитіл, збільшення клітинної імунної відповіді, індукції мукозного імунітету, або скорочення дози антигену. Було запропоновано кілька ад'ювантів, проте, жоден, як було показано, не був ідеально придатним для всіх вакцин. Перший ад'ювант, описаний у літературі, був повний ад'ювант Фрейнда (FCA), який містить емульсію вода-в-олії та екстракти мікобактерій. На жаль, FCA погано переноситься та може викликати неконтрольоване запалення. Після відкриття FCA більш ніж 80 років тому були зроблені зусилля по скороченню небажаної побічної дії ад'ювантів. Деякі інші речовини, використані у якості ад'ювантів охоплюють оксиди металів (наприклад, гідроксид алюмінію), галун, неорганічні хелати солей, желатини, різні олії типу парафіну, синтезовані камеді, альгінати, мукоїдні та полісахаридні сполуки, казеїнати, та речовини, що було отримано з крові, такі як згустки фібрину. Хоча ці речовини є головним чином дієздатними у стимулюванні імунної системи, жодна з них не була повністю прийнятною через шкідливі 1 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прояви у організмі хазяїна (наприклад, створення стерильних абсцесів, пошкодження органу, канцерогенність, або алергенні реакції) або через неочікувані фармацевтичні властивості (наприклад, швидке розповсюдження або поганий контроль розповсюдження з місця ін'єкції, або набрякання речовини). Синтетичні олії та похідні нафти теж мали використання у якості ад'ювантів, тому що вони проявляли відносно повільне розповсюдження у тілі хазяїна, але вони могли себе несподівано проявляти, так як вони часто розпадаються на ароматичні вуглеводні, які можуть бути канцерогенними. Більш того, деякі з цих речовин, як було виявлено, були здатні створювати стерильні абсцеси та не можуть бути повністю усунені організмом. Олії, коли вони є відповідно відібраними та зробленими у відповідних концентраціях можуть бути відносно безпечними та нетоксичними. Сапоніни, отримані з кори південноамериканського дерева Quillaja saponaria деякій час теж використалися у якості ад'ювантів. Див. Lacaille-Dubois, M та Wagner H. (A review of biological та pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386. 1996). Багато ветеринарних вакцин, що використовують зараз, містять Quil A, який є фракцією сапоніну з кори південноамериканського дерева Quillaja saponaria molina. Подальшим розділенням на фракції Quil A було отримано суб-фракції, що охоплюють QS-7, QS-17, QS-18, та QS-21. (Див. U. S. Pat. No. 5, 057, 540) Використання сапонінів у якості ад'ювантів пов'язано з численними незручностями. Сапоніни є розчинними, тому стимулюють виникнення неспецифічної імунної відповіді. Метою вакцинології, проте, є стимулювання цілеспрямованої відповіді на специфічний антиген або антигени. Сапоніни мають сильну взаємну прихильність до холестерину. Вони утворюють комплекс з холестерином, знайденим у клітинних мембранах, що спричинює гемоліз клітини. Вони, як також було показано, викликають некроз у місці ін'єкції та їх важко зробити у вигляді окремих структур. При використанні у вакцинах, що містять модифіковані живі віруси у оболонці, сапоніни порушують вірусну оболонку та таким чином інактивують вірусні антигени. Для подолання гемолітичної та віроцидної властивостей Quil A, він був поєднаним з холестерином та фосфоліпідами, та була створена специфічна структура, знана як імуностимуляторний комплекс (ISCOM) або матриця ISCOM (ISCOMATRIX). Див. Ozel M., et. al.; J. Ultrastruc. та Molec. Struc. Re 102, 240-248 (1989). ISCOMи, коли вони є поєднаними з антигеном, головним чином викликають Th1 цитотоксинову T-клітинну відповідь. Проте, хоча гемолітичні властивості Quil A були значно знижені, комбінування Quil A з холестерином не повністю їх усуває. Іншім обмеженням ISCOMів є те, що білок антигену повинен мати гідрофобні домени, достатньо великі для взаємодії з ISCOM для того, щоби приєднатися до нього. Білок який є високо гідрофільним не може бути приєднаним до ISCOM. Крім того, ISCOMи можуть стимулювати неочікувану автоімунну реакцію у суб'єкта. Імуномодулятори можуть бути використані у якості ад'ювантів, наприклад, диметилдиоктадециламонію бромід (надалі, "DDA"), та авірдин. DDA - ліпофільна четвертинна сполука амонію (амін) з двома 18 карбоновими алкіловими ланцюгами та двома метильними групами, пов'язаними з позитивно зарядженою четвертинною молекулою амонію з молекулярною масою 631. Його використання у якості ад'юванту було відкрито Gall, (Immunol. V. 11, p. 369, 1966). DDA, як описано, стимулює сильні клітинні імунні відповіді, та також, як було показано, викликає гуморальні імунні відповіді. Крім того, було опубліковано багато документів, де показана ефективність DDA у якості ад'юванту для білкових антигенів, гаптенів, пухлин, вірусів, найпростіших та бактерій. (Див. Korsholm, K S., et al., Immunology, vol. 121, pp. 216-226, 2007.) Більшість досліджень було зроблено на лабораторних тваринах, поки тільки декілька досліджень було проведено на великих тваринах, таких як курчата (Див. Katz, D., et al. FEMS Immunol Med Microbiol. Vol 7(4):303-313, 1993.), свині, та велика рогата худоба. DDA є ефективним для викликання реакції гіперчутливості уповільненого типу (DTH) як у лабораторних тварин, так та у великих тварин. Проте, він погано розчиняється у воді. Полімери також використовують у якості ад'ювантів, наприклад, діетил-аміноетил (DEAE)декстран, поліетиленгліколь, та поліакрилова кислота (наприклад, CARBOPOL®). Полісахарид DEAE-декстран, як відомо, є дуже сильним ад'ювантом. Проте, його дія пов'язана з неприпустимою реактогенністю. Полімери CARBOPOL® є полімерами акрилової кислоти, зшитими з поліалкеніловими естерами або дивінілгліколем. CARBOPOL® використовується у деяких вакцинах, але його використання як ад'юванту не засвідчено. Деякі ад'юванти, як показано, стимулюють Th2 відповідь, наприклад N-(2-деоксі-2-Lлейциламіно-b-D-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканоламіду гідроацетат, також відомий під торгівельною маркою Bay R1005®, коли він є у формі ацетату та алюмінію. Bay R1005® у комбінації з очищеною вірусною вакциною або субодиничною вакциною приводить до 2 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підвищення виробництва антитіл у мишей, інфікованих вірусами. Доклінічні випробування на інших видах тварин (свині, вівці, коні) дали порівнянні результати відносно виробництва антитіл. Підвищення синтезу антитіл, яке викликано Bay R1005® особливо залежить від антигену та не є результатом поліклональної стимуляції. Перед цім винаходом не було у наявності такого препарату ад'юванту, який би мав широкий діапазон бажаних характеристик, що повинен мати ідеальний ад'ювант. Були зроблені зусилля, щоб знайти нові ад'юванти для вакцин, що можуть подолати недоліки традиційних ад'ювантів. Зокрема, дуже бажано було створити ад'ювант, що викликає потужні клітинні та гуморальні імунні відповіді до широкого ряду антигенів у людей та тварин, проте не має побічної дії та труднощів приготування, властивих звичайним ад'ювантам. Цей винахід стосується нових ад'ювантних, імуногенних, та вакцинних композицій. Зокрема, цей винахід стосується ад'ювантних препаратів, що містять Th1 ад'юванти, імуномодулятори, полімери, та Th2 ад'юванти. Цей винахід також стосується імуногенних та вакцинних композицій, що містять такі ад'ювантні препарати та один або більше антигенів, так само, як і способи приготування ад'ювантних та вакцинних композицій. У одному втіленні, ад'ювантні композиції охоплюють комбінацію сапоніну, стеролу, та четвертинної сполуки амонію. У одному втіленні, сполука ад'юванту містить Quil A, холестерин, та DDA. У іншому втіленні, ад'ювантні композиції складаються з комбінації сапоніну, стеролу, четвертинну сполуку амонію, та полімеру. У одному втіленні, сполука ад'юванту - Quil A, холестерин, DDA, та поліакрилова кислота. У іншому втіленні, ад'ювантні композиції складаються з комбінації сапоніну, стеролу, четвертинну сполуку амонію, полімеру, та глюколіпіду. У одному втіленні, сполука ад'юванту Quil A, холестерин, DDA, поліакрилова кислота, та Bay R1005®. У одному втіленні, імуногенна композиція, що містить препарат ад'юванту та імунологічну ефективну кількість антигену, де препарат ад'юванту, що охоплює сапонін, стерол, четвертинні сполуки амонію, та полімер, є отриманою способом, що полягає у: a) приготуванні сполуки антигену у буфері, b) додаванні сапоніну до сполуки за п. a; c) додаванні стеролу до сполуки за п. b; d) додаванні четвертинної сполуки амонію до сполуки за п. c, e) додаванні полімеру до сполуки за п. d. У одному втіленні цього процесу, сапонін - Quil A, стерол - холестерин, четвертинна сполука амонію - DDA, та полімер - поліакрилова кислота. У одному втіленні, вакцина, що містить препарат ад'юванту та імунологічну ефективну кількість антигену, де препарат ад'юванту містить сапонін, стерол, четвертинні сполуки амонію, полімер, та глюколіпід є отриманою способом, що полягає у: a) приготуванні композиції антигену у буфері, b) додаванні сапоніну до сполуки за п. a; c) додаванні стеролу до сполуки за п. b; d) додаванні четвертинної сполуки амонію до сполуки за п. c, e) додаванні полімеру до сполуки за п. d, та f) додаванні глюколіпіду до сполуки за п. e. У одному втіленні цього процесу, сапонін - Quil A, стерол - холестерин, четвертинна сполука амонію - DDA, полімер - поліакрилова кислота, та глюколіпід - Bay R1005®. Було встановлено, що вищезгадані ад'ювантні композиції мають несподівані та неочікувані властивості понад того, що можнабуло б очікувати від такої комбінації. Було несподівано знайдено, що віроцидна властивість Quil A/холестерину у цих композиціях є усуненою та вони є придатними у якості розчинників для ліофілізованих модифікованих живих вірусних антигенів. Ад'ювантні композиції, що описано тут, здатні створювати конфігурації для отримання надзвичайно сильної імунної відповіді, спрямованої, як клітинна імунна відповідь, як гуморальна імунна відповідь, або як обидва типи відповіді. На додаток, при використанні цих ад'ювантних препаратів можна уникнути реакцій у місці ін'єкції. Реактогенність є значно нижче, ніж у деяких окремих компонентів, що входять у склад комбінації ад'ювантів. На додаток, ці ад'ювантні препарати мають здатність довго зберігатися. Заявники відкрили, що ці нові ад'ювантні композиції мають високу імуногенність, коли поєднані з одним або більшою кількістю різних антигенів у широкому діапазоні видів. Вони можуть бути використані з одним або більше вірусними, бактеріальними, паразитарними, рекомбінантно-білковими, та синтетичними пептидними антигенами, та їх комбінаціями. Нові 3 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вакцинні ад'ювантні композиції можуть бути використані у терапевтичних вакцинах для лікування раку. Отже, цей винахід забезпечує створення ад'ювантних, імуногенних, та вакцинних композицій. На додаток передбачено способи виробництва композицій. Також передбачено їх використання у лікуванні хвороб. Також передбачено їх використання у приготуванні ліків для лікування суб'єктів проти хвороб, особливо проти хвороб, описаних вище. Також передбачено їх використання у приготуванні ліків для профілактики або послаблення хвороби у суб'єкта. Більш того, передбачено їх використання у приготуванні ліків для лікування кішок проти інфекції, викликаної вірусом лейкемії кішок, для лікування птахів проти пташиного кокцидіозу, для лікування корів проти хвороб, спричинених Escherichia coli, для лікування корів проти хвороб, спричинених вірусом вірусного проносу корів, для лікування свиней проти хвороб, спричинених Mycoplasma hyopneumonia, для лікування кішок проти хвороб, спричинених вірусом котячого грипу, суб'єктів проти раку, для лікування собак проти хвороб, спричинених собачим коронавірусом, для лікування корів проти хвороб, спричинених ротавірусом корів, та для лікування собак проти хвороб, спричинених вірусом собачого грипу. Також передбачено використання ад'ювантів в якості маркера вакцини, щоб допомогти в ідентифікації тварин, які були вакциновані. Також передбачено використання CpG для посилення дії ад'ювантів. Фіг. 1 зображує гель-перебіг при застосуванні радіоіммунопреципітаціонного аналізу, де відображаються відмінності у профілі антитіл між NS2/3 білком та E2 білком вірусу BVD. Група, що оброблена PreZent A показує відповідь антитіл на NS2/3 білки та E2 білки, у той час як оброблені QCDC та QCDCR групи демонструють відповідь антитіл тільки до білку E2 та відсутність відповіді до білків NS2/3. Поняття "приблизно" або "приблизно, ” використовується у зв'язку з вимірними числовими перемінними, стосується вказаного значення перемінної, та всіх значень перемінної, що є у межах експериментальної похибки вказаного значення (наприклад, у довірчому інтервалі у 95 % для середнього значення) або у межах 10 відсотків від вказаного значення, що значно більше, за виключенням використання при посиланні на інтервали часу у тижнях, де "приблизно 3 тижнів, ” означає 17-25 діб, та від приблизно 2 до 4 тижнів означає 10-40 діб. Термін "ад'ювант" головним чином стосується будь-якого препарату, що збільшує гуморальну або клітинну імунну відповідь на антиген. Ад'юванти більшим чином використовують для досягнення двох цілей - вони сповільнюють вивільнення антигенів з місця ін'єкції та стимулюють імунну систему. "Алкіл" стосується як та прямих, так і розгалужених насичених вуглеводневих груп. "Амін" стосується хімічної сполуки, яка містить нітроген. Аміни є групою сполук, що походять з аміаку шляхом заміни вуглеводневими групами атомів гідрогену. "Четвертинний амін" стосується сполуки на основі амонію з чотирма вуглеводневими групами. "Антитіло" стосується молекули імуноглобуліну, що може зв'язуватися з специфічним антигеном як результат імунної відповіді антигену. Імуноглобуліни є білками сироватки, що складаються з "легких" та "важких" поліпептидних ланцюгів, що мають "сталі" та "мінливі" частини та поділяються на класи (наприклад, IgA, IgD, IgE, IgG, та IgM) на основі сполучення сталих частин. "Антиген" або "імуноген" стосується будь-яких речовин, що стимулюють імунну відповідь. Термін охоплює вбитих, інактивованих, послаблених, або модифікованих живих бактерій, вірусів, або паразитів. Термін "антиген" також охоплює полінуклеотиди, поліпептиди, рекомбінантні білки, синтетичні білки, екстракти білків, клітини (у тому числі пухлинні клітини), тканини, полісахариди, або ліпіди, або їх фрагменти, окремо або у будь-якої їх комбінації. Термін "антиген" також охоплює антитіла, такі як анті-ідіотипичні антитіла або їх фрагменти, та синтетичні пептидні мімотопи, що можуть імітувати антиген або антигенний детермінант(епітоп). "Бактерин" означає суспензію одної або більше вбитих бактерій, яка може бути використана як компонент вакцини або імуногенної композиції. "Буфер" означає хімічну систему, яка попереджає змінення у концентрації інших хімічних речовин, наприклад, протонові донорна та акцепторна системи служать у якості буферів, що попереджують значні змінення концентрації іонів гідрогену (pH). Іншім прикладом буферу є розчин, який містить суміш слабкої кислоти та її солі (сполучену основу) або слабкої основи та її солі (сполучена кислота). "Клітинна імунна відповідь" або "клітинні імунні відповіді" є опосередкованою T-лімфоцитами або іншими білими клітинами крові або обома разом, та охоплює виробництво цитокінів, хемокінів та подібних молекул, що виробляються активованими T-клітинами, білими клітинами крові, або обома разом. 4 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Холестерин" стосується білої кристалічної речовини з хімічною формулою C 27H45OH. Це циклічний вуглеводневий спирт, який класифікується як ліпід. Він є нерозчинним у воді, але розчиняється у деяких органічних розчинниках. "Гіперчутливість уповільненого типу (DTH)” стосується запальної реакції, що розвивається від 24 до 72 годин після дії антигену, який імунна систем визнає як сторонній. Цей тип імунної відповіді містить переважно T-клітини, ніж антитіла (які виробляються B-клітинами). "Доза" стосується вакцини або імуногенної композиції, яку дають суб'єкту. Поняття "перша доза" або "первинна вакцина" стосується дозування такої композиції, яку дають у нульову добу. "Друга доза" або "третя доза" або "щорічна доза" стосується кількості такої композиції, що була дана слідом за першою дозою, яка може бути або ні той самою вакциною або імуногенною композицією, як у першій дозі. "Емульгатор" означає речовину, використання якої робить емульсію більш стабільною. "Емульсія" означає композицію двох не змішуваних рідин, у який малі краплі однієї рідини знаходяться у суспензії з суцільною фазою іншої рідини. "Естери" стосується будь-якого з класу органічних сполук, подібних неорганічним солям, що є сформованими в результаті реакції конденсації, де молекула органічної кислоти з'єднується з молекулою спирту з усуненням молекули води. "Наповнювач" стосується будь-якого компонента вакцини, який не є антигеном. "Гомогенізація" стосується процесу змішування одного або більше компонентів, або однакових, або різних, у однорідну суміш. "Гуморальна імунна відповідь" стосується такої, що є опосередкованої антитілами. "Гідрофобні" означає нерозчинні у воді, які важко поглинають вологу, або на яких несприятливо впливає вода; або несумісні з водою, або з маленької спорідненістю до неї. "Імунна відповідь" у суб'єкта стосується розвитку гуморальної імунної відповіді, клітинної імунної відповіді, або гуморальної та клітинної імунної відповіді на антиген. Імунні відповіді можуть звичайно бути визначені з застосуванням стандартних відомих способів імуноаналізу та нейтралізації. "Імунологічно запобіжна кількість ” або "імунологічно ефективна кількість ” або "ефективна кількість для отримання імунної відповіді" на антиген є кількістю, яка буде ефективною для викликання імуногенної відповіді у реципієнта. Імуногенної відповіді може бути достатньо для діагностичних цілей або інших тестів, або може бути достатньо для попередження ознаків або симптомів хвороб, в тому числі шкідливих наслідків для здоров'я або їх ускладнень, спричинених інфекцією агента хвороби. Як гуморальний імунітет, так та клітинноопосередкований імунітет, або обидва можуть бути викликані. Імуногенна відповідь тварин на імуногенну композицію може бути оцінена, наприклад, непрямим вимірюванням титрів антитіл, методами проліферації лімфоцитів, або безпосередньо через моніторинг ознаків та симптомів після зараження штамом дикого типу, де захисний імунітет, наданий вакциною може бути оцінено шляхом вимірювання, наприклад, зниженням таких клінічних ознак як смертність, захворюваність, температура, загальний фізичний стан, та загальний стан здоров'я та характеристика суб'єкта. Імунна відповідь може охоплювати, без обмеження, індукцію клітинного та/або гуморального імунітету. "Імуногенний" означає такий, що викликає імунну або антигенну відповідь. Тому імуногенна композиція може бути будь-якою композицією, що викликає імунну відповідь. "Імуностимуляторний комплекс" або ISCOM відноситься до специфічної структури, яка формується, коли Quil A є поєднаним з холестерином та фосфоліпідами. "Імуноад'ювантна молекула" стосується молекули, що породжує імунну відповідь. "Ліпіди" стосується будь-якої групи органічних сполук, в тому числі жирів, олій, вісків, стеролів та тригліцеридів, що є нерозчинними у воді, але розчиняються у неполярних органічних розчинниках, є оліїстими на дотик, та разом з вуглеводами та білками утворюють головний структурний матеріал живих клітин. "Ліпофільний" означає такий, що має відмічену схильність до ліпідів або розчинність у ліпідах. "Ліпосома" має відношення до мікроскопічної сферичної частинки, що сформована ліпідним подвійним шаром, яка має рідку серцевину та використовується у медичних цілях для переносу ліків, антигену, вакцини, ензиму, або інших речовин до цільових клітин у тілі. "Лікувальний агент" стосується будь-якого агенту, який є корисним у попередженні, лікуванні, або послабленні хвороби, або у профілактиці деяких психологічних станів або випадків. "Парентеральне введення" стосується введення речовини, такої як вакцина, у тіло суб'єкту будь-яким шляхом, що оминає травний тракт.. Парентеральне введення охоплює підшкірне, 5 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 внутрішньом'язове, введення крізь шкіру, внутрішньошкірне, внутрішньочеревне, внутрішньоочне та внутрішньовенне введення. "Фармацевтично прийнятний" стосується речовин, які є у межах відомих медичних обговорень, придатні для використання у контакті з тканинами суб'єктів без спричинення токсичних, подразнюючих, алергічних відповідей, та ін., з порівняно розумним співвідношенням ризику, та ефективні для їх призначеного використання. "Реактогенність" стосується побічної дії, викликаної у суб'єкта у відповідь на введення ад'юванту, імуногенної, або вакцинної композиції. Вона може трапитися приблизно місця введення, та її звичайно оцінюють з точки зору розвитку ряду симптомів. Ці симптоми можуть охоплювати запалення, почервоніння, та абсцес. Їх також оцінюють з точки зору виникнення, тривалості, та суворості. "Низькі" реакції можуть, наприклад, спричинювати опухлість, що можна визначити на дотик та неможливо побачити, або вона може бути короткотривалою. Більш суворі реакції можуть, наприклад, бути довготривалими та їх прояви можна побачити візуально. "Кімнатна температура" означає температуру 18-25 ºC. "Сапонін" стосується групи поверхнево-активних глікозидів рослинного походження, що складаються з гідрофільної частини (звичайно це декілька цукрових ланцюгів) у поєднанні з гідрофобною частиною або стероїдної або тритерпенової структури. "Стероїди" стосується будь-якої групи органічних сполук, що належать до біохімічного класу ліпідів, які є легко розчинними у органічних розчинниках та слабо розчиняються у воді. Стероїди містять систему з чотирьох конденсованих кілець - трьох конденсованих кілець циклогексану (6карбон) та четвертого циклопентанового (5 - карбон) кільця. "Стероли" стосується сполук у тваринах, які є біологічно виробленими з терпеноїдних прекурсорів. Вони містять стероїдну кільцеву структуру, мають гідроксильну (OH) групу, що звичайно прикріплена до карбону-3. Вуглеводневий ланцюг жирної кислоти-замісника змінюється у довжині, звичайно з 16-20 атомів карбону, та може бути насиченим або ненасиченим. Стероли звичайно містять один або більше подвійних зв'язків у кільцевій структурі, а також безліч замісників, прикріплених до кілець. Стероли та їх естери жирних кислот по суті є нерозчинними у воді. "Суб'єкт" стосується будь-якої тварини, для якої бажано введення ад'ювантної композиції. Цей термін охоплює ссавців та не-ссавців, в тому числі приматів, домашню худобу, домашніх тварин, лабораторних експериментальних тварин, спійманих диких тварин, птахів (включаючи яйця), рептилій та рибу. Отже, цей термін охоплює без обмежень мавп, людей, свиней; велику рогату худобу, баранів, кіз, коней, мишей, щурів, морських свинок, хом'яків, кролів, кішок, собак, курчат, індиків, качок, іншу свійську птицю, жаб, та ящірок. "TCID50”стосується "інфекційної дози культури тканин" та визначається як розведення вірусу, якого потрібно, щоб заразити 50 % із даної партії щеплених культур клітин. Різні способи можуть бути використані для обчислення TCID50, в тому числі спосіб Spearman-Karber, який використовується в цієї специфікації. Опис способу Spearman-Karber, див. у B. W. Mahy & H. O. Kangro, Virology Methods Manual, p. 25-46 (1996). "Терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антигену або вакцини, що буде викликати імунну відповідь у суб'єкта, що отримав антиген або вакцину, якої достатньо для попередження або зниження ознак або симптомів хвороби, в тому числі шкідливих для здоров'я проявів або їх ускладнень, спричинених патогенними інфекціями, такими як вірусні або бактеріальні. Гуморальний імунітет або клітинно-опосередкований імунітет або як гуморальний, так і клітинно-опосередкований імунітет можуть бути викликані. Імуногенна реакції тварини на введення вакцини може бути оцінена, наприклад, непрямим вимірюванням титрів антитіл, аналізами проліферації лімфоцитів, або безпосередньо моніторингом ознак та симптомів після введення штаму дикого типу. Захисний імунітет, наданий вакциною може бути оцінено шляхом вимірювання, наприклад, скороченням клінічних ознак, таких як смертність, захворюваність, температура, загальний фізичний стан, загальний стан здоров'я та характеристика суб'єкта. Кількість вакцини, що є терапевтично ефективним може змінюватися у залежності від конкретного використаного ад'юванту, конкретного використаного антигену, або від стана суб'єкта, та може бути визначений фахівцями у цій галузі. “ Лікування" стосується попередження розладу, стану, або хвороби, до якої застосовується такий термін, або для попередження або зниження одного або більше симптомів такого розладу, стану, або хвороби. "Tритерпеноїди" стосується великого та різноманітного класу природних органічних молекул, похідних від шести одиниць п'ять-карбон ізопрену (2-метил-1, 3-бутадіен), яких може бути зібрано та модифіковано у безліч способів. Більшість з них - мультициклічні структури, які 6 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відрізняються одна від іншої по функціональним групам та по їх базовим карбоновим скелетам. Ці молекули можуть бути знайдені у всіх класах живих істот. "Вакцина" стосується композиції, що охоплює антиген, як визначено тут. Введення вакцини до суб'єкта спричинює імунну відповідь, головним чином проти однієї або більше специфічних хвороб. Кількість вакцини, що є терапевтично ефективною може змінюватися у залежності від конкретного використаного антигену, або від стану суб'єкту, та може бути визначена фахівцями у цієї галузі. Тритерпеноїди, придатні для використання у ад'ювантній композиції, можуть надходити з багатьох джерел, бути або рослинного походження або синтетичними еквівалентами, в тому числі, але без обмеження, Quillaja saponaria, томатін, екстракти женьшеню, гриби, та алкалоїдний глюкозид, структурно подібний до стероїдних сапонінів. Отже, тритерпеноїди, придатні для використання у ад'ювантних композиціях охоплюють сапоніни, сквален, та ланостерол. Кількість тритерпеноїдів, яка необхідна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаних тритерпенів. Тим не менш, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 5 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 1 мкг - 4 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 000 мкг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг - 100 мкг на дозу, та у кількості приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Якщо було використано сапонін, ад'ювантні композиції головним чином містять імунологічно активну фракцію сапоніну з кори Quillaja saponaria. Сапоніном може бути, наприклад, Quil A або іншій очищений або частково очищений препарат сапоніну, який може бути отриманий на комерційній основі. Отже, екстракти сапоніну можуть бути використані у вигляді суміші або очищених індивідуальних компонентів, таких як QS-7, QS-17, QS-18, та QS-21. У одному втіленні, Quil A має щонайменше 85 % чистоту. У інших втіленнях, Quil A має щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або 99 % чистоту. CpG ODNи є нещодавно описаним класом фармакотерапевтичних агентів, що характеризуються присутністю неметильованого CG динуклеотиду у специфічних "основапослідовність" положеннях (CpG фрагмент). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs для Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, який є включеним тут, як вказано у посиланні) Ці CpG фрагменти не спостерігають у еукаріотичній ДНК, у який CG динуклеотиди є подавленими та, коли вони є у наявності, звичайно метильовані, але вони присутні у бактеріальної ДНК, яку вони наділяють імуностимуляторними властивостями. Ці імуностимуляторні властивості охоплюють індукцію відповіді Th1-типу з помітним вивільненням IFN-Á, IL-12, та IL-18. CpG ODN (18-24 пар основ у довжину) мають імуномодуляторні властивості, подібні до бактеріальної ДНК. Білки клітинної поверхні можуть взаємодіяти з цими молекулами з перемінними результатами. Проте, з носієм, такім як QCDC, QCDCR та іншими комбінаціями, що приведені у межах цього патенту, імуномодуляційні властивості та поглинання CpG значно підсилюються. Кількість CpG для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного CpG та від передбачених видів. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 20 мг на дозу. Їх також використовують у кількості біля1 мкг - 10 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 5 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 4 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 мг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 мг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 мг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, 10 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг 100 мкг на дозу, та у кількості приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Стероли, придатні для використання у ад'ювантних композиціях охоплюють β-сітостерол, стігмастерол, ергостерол, ергокальциферол, та холестерин. Ці стероли є добре відомі фахівцям та можуть бути комерційно придбані. Наприклад, холестерин є у Merck Index, 12th Ed., p. 369. Кількість стеролів, придатна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаних стеролів. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 5 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості біля1 мкг - 4 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 000 мкг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг - 100 мкг на дозу, та приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Ад'ювантні композиції можуть, крім того, охоплювати один або більше імуномодуляторних агентів, таких, наприклад, як четвертинні сполуки амонію (наприклад, DDA), та інтерлейкіни, 7 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтерферони, або інші цитокіни. Ці речовини можуть бути комерційно придбані. Кількість імуномодулятору, придатного для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного імуномодулятору та суб'єкта. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 1 мкг - 5 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості біля1 мкг - 4 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 3 000 мкг на дозу, приблизно 1 мкг - 2 000 мкг на дозу, та приблизно 1 мкг - 1 000 мкг на дозу. Їх також використовують у кількості приблизно 5 мкг - 750 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 500 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 200 мкг на дозу, приблизно 5 мкг - 100 мкг на дозу, приблизно 15 мкг - 100 мкг на дозу, та у кількості приблизно 30 мкг - 75 мкг на дозу. Як конкретний приклад, ад'ювантні композиції, які містять DDA можуть бути отримані простим змішуванням розчину антигену та свіжо приготованого розчину DDA. Ад'ювантні композиції можуть, крім того, містити один або більше полімерів, таких, наприклад, як DEAE декстран, поліетиленгліколь, поліакрилова кислота та поліметакрилова кислота (наприклад, CARBOPOL®). Такі речовини можуть бути комерційно придбані. Кількість полімерів, придатна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного полімеру. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 0. 0001-75 об%. у інших втіленнях, вони є використаними у кількості приблизно 0. 001 об% - 50 об%, приблизно 0. 005 об% - 25 об%, приблизно 0. 01 об% - 10 об%, приблизно 0. 05 об% - 2 об%, та приблизно 0. 1 об% - 0. 75 об%. У іншому втіленні, вони є використаними у кількості приблизно 0. 02-0. 4 об%. DEAE-декстран може мати молекулярну масу у межах від 50 000 Да до 5 000 000 Да, або вона може бути у межах від 500 000 Да до 2 000 000 Да. Такі речовини можуть бути комерційно придбані або приготовані з декстрану. Інші специфічні приклади - це поліакрилова кислота (наприклад, полімери CARBOPOL®), яка має середню еквівалентну масу 76. Вони вироблені з первинних полімерних частин приблизно 0. 2 до 6. 0 мікрон у середньому діаметрі. Полімери CARBOPOL® розбухають у воді більш ніж у 1000 разів від їх початкового об'єму та у десять разів від їх первісного діаметра з утворенням гелю при дії рН середовища більше, ніж pKa карбоксилатної групи. При pH, більшім, ніж pKa карбоксилатної групи, карбоксилатні групи іонізуються в результаті відштовхування між негативними зарядами, яке веде до опухлості полімеру. Ад'ювантні композиції можуть, крім того, містити один або більше Th2 ад'ювантів, таких як, наприклад, Bay R1005® та алюміній. Кількість Th2 ад'ювантів, придатна для використання у ад'ювантних композиціях залежить від походження використаного Th2 стимулятору. Проте, їх зазвичай використовують у кількості приблизно 0. 01 мг - 10 мг на дозу. У інших втіленнях, вони є використаними у кількості приблизно 0. 05 мг - 7. 5 мг на дозу, приблизно 0. 1 мг - 5 мг на дозу, приблизно 0. 5 мг - 2. 5 мг на дозу, та 1 мг - 2 мг на дозу. Конкретним прикладом є Bay R1005®, глюколіпід з хімічним ім'ям "N(2-деокси-2-L-лейциламіно-β-D-глюкопіранозил)-Nоктадецилдодеканаміду ацетат. ” Він може бути синтезований відповідно типів лікувань, що можна знайти у Lockhoff, 0. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:1611-1620; 1991). Його рекомендовано зберігати при 2-8° C у герметичному контейнері. Його хімічні або фізичні властивості охоплюють легку гігроскопічність без утворювання поліморфних форм, він є хімічно стабільним у повітрі та світлі при температурі до 50° C та у водних розчинниках при pH 2-12 при кімнатній температурі. Він є амфіфільною молекулою, яка утворює міцели у водних розчинах. Ад'ювантні композиції можуть містити один або більше антигенів. Антиген може бути будьяким з широкого кола речовин, здатних до продукування бажаної імунної відповіді у суб'єкта. Хоча сам Quil A є віроцидним, його можна позбавити токсичності додаванням холестерину при формуванні спіральних міцел (Див. US Patent № 7, 122, 191). Описані тут ад'ювантні композиції, як було виявлено, невіроцидні та негемолітичні або мембранолітичні. Отже, антигени, що використані з цими ад'ювантними композиціями можуть бути одним або кількома вірусами (інактивованими, послабленими, та живими модифікованими), бактеріями, паразитами, нуклеотидами, полінуклеотидами, пептидами, поліпептидами, рекомбінантними білками, синтетичними білками, екстрактами білків, клітин (охоплюючи пухлини клітин), тканинами, полісахаридами, вуглеводами, жирними кислотами, тейхоєвою кислотою, пептидоглюканами, ліпідами або глюколіпідами, поодинці або у будь-якій їх комбінації. Антигени, використані з ад'ювантами винаходу також містять імуногенні фрагменти нуклеотидів, полінуклеотидів, пептидів, поліпептидів, які можуть бути виділені з організмів, згаданих в цьому документі. Живі, живі модифіковані, та послаблені вірусні штами, що не викликають хвороб у суб'єкта, були виділені у невірулентній формі, або були послаблені з застосуванням способів, добре відомих фахівцям, в тому числі серійним пасажем у придатній лінії клітин або обробкою ультрафіолетовим світлом або хімічним мутагеном. Інактивовані або вбиті вірусні штами – ті, які інактивовані різними способами, відомими фахівцям, в тому числі обробкою формаліном, 8 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бетапропріолактодином (BPЛ), бінарним етиленіміном (BEI), стерилізацією радіацією, нагріванням, або такими іншими способами. Два або більше антигенів можуть бути поєднаними для виробництва полівалентної композиції, що може захистити суб'єкт проти широкого ряду хвороб, спричинених патогенами. Зараз комерційні виробники вакцин, так само, як і їх користувачі, віддають перевагу полівалентним вакцинним продуктам. Поки звичайні ад'юванти часто обмежені різновидами антигенів, з якими вони можуть бути ефективно використані (або моновалентно, або полівалентно), ад'юванти, що описані тут, можуть бути ефективно використані з широким рядoм антигенів, як моновалентних, так і полівалентних. Отже, описані тут антигени можуть бути поєднаними у окрему композицію, що містить описані тут ад'юванти. Деякі приклади бактерій, які можуть бути використані у якості антигенів з ад'ювантними композиціями містять, але без обмеження, Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Helicobacter suis, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraseuis, Salmonella newport, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, та різновиди Leptospira, такі як відомі патогени Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, та Leptospira bratislava, та їх комбінації. Як інактивовані віруси, так і послаблені живі віруси можуть бути використані у ад'ювантних композиціях. Деякі приклади вірусів, які можуть бути використані як антигени містять, але без обмеження, вірус герпесу птахів, віруси герпесу корів, віруси герпесу собак, віруси герпесу коней, вірус кошачого рінотрахеіту, вірус хвороби Марека, овечі віруси герпесу, віруси герпесу свиней, вірус псевдосказу, параміксовіруси птахів, респіраторний синцитіальний вірус корів, вірус собачої чуми, вірус собачого парагрипу, собачий аденовірус, собачий парвовірус, вірус парагрипу корів 3, вірус парагрипу овець 3, вірус чуми рогатої худоби, вірус граничної хвороби, вірус вірусного проносу корів (BVDV), BVDV типу I, та BVDV типу II, класичний вірус свинячої лихоманки, вірус лейкозу птахів, вірус імунодефіциту корів, вірус лейкемії корів, туберкульоз корів, вірус інфекційної анемії коней, вірус кошачого імунодефіциту, вірус кошачої лейкемії(FeLV), вірус хвороби Ньюкастла, вірус прогресивної пневмонії овець, вірус легеневої аденокарциноми овець, собачий коронавірус (CCV), пантропічний CCV, собачий респіраторний коронавірус, коронавірус корів, кошачий каліцивірус, кошачий ентеричний коронавірус, вірус кошачого інфекційного перитоніту, вірус свинячого проносу, вірус свинячого гемаглютинаціонного енцефаломілетиту, свинячий парвовірус, свинячий цирковірус(PCV) типу I та PCV типу II, вірус свинячого відтворювального та дихального синдрому (PRRS), вірус заразного гастроентеріту, індичий коронавірус, вірус короткочасної лихоманки корів, різні види сказу, ротовірус, вірус везикулярного стоматиту, лентовірус, вірус пташиного грипу, ріновіруси, вірус грипу коней, вірус грипу свиней, вірус собачого грипу, вірус кошачого грипу, вірус грипу людини, східний вірус енцефаліту коней(EEE), венесуельський вірус енцефаліту коней, вірус західного Нілу, західний вірус енцефаліту коней, вірус імунодефіциту людини, вірус папіломи людини, вірус вітряної віспи, вірус оперізувального лишаю, вірус гепатиту B, риновірус, вірус кіру та їх комбінації. 9 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклади пептидних антигенів охоплюють Bordetella bronchiseptica p68, GnRH, IgE пептиди, Fel d1, та антигени раку та їх комбінації. Приклади інших антигенів охоплюють нуклеотиди, вуглеводи, ліпіди, глюколіпіди, пептиди, жирні кислоти, тейхоєву кислоту, пептидоглюкани, та їх комбінації. Деякі приклади паразитів, які можуть бути використані як антигени з ад'ювантними композиціями охоплюють, але без обмеження, Anaplasma, Fasciola hepatica (печінка камбали), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoрlаsm gondii, Giardia, Dirofilaria (серцеві глисти), Ancylostoma (крюкоподібні глисти), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, Isopsora, та їх комбінації. Також передбачено використання зовнішніх паразитів, що охоплюють, але без обмеження, кліщів, в тому числі Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, та різновидів Haemaphysalis, та їх комбінації. Кількість антигену, використаного для викликання імунної відповіді буде значно змінюватися у залежності від використаного антигену, суб'єкту, від рівня бажаної відповіді, та може бути визначена фахівцями. Для вакцин, які містять модифіковані живі або послаблені віруси, 2 терапевтично ефективна кількість антигену головним чином зазвичай становить від 10 10 інфективної дози культури тканини (TCID)50 до 10 TCID50, включно. Для багатьох таких вірусів, 2 8 терапевтично ефективна доза є головним чином у межах 10 TCID50-10 TCID50, включно. У 3 6 деяких втіленнях, терапевтично ефективні дози Haemaphysalis є приблизно 10 TCID50-10 TCID50, включно. У деяких інших втіленнях, межі терапевтично ефективних доз дорівнюють 4 5 приблизно 10 TCID50-10 TCID50, включно. Для вакцини, яка містить інактивовані віруси, терапевтично ефективна кількість антигену дорівнює головним чином щонайменше приблизно 100 відносних одиниць на дозу, та часто у межах приблизно 1 000-4500 відносних одиниць на дозу, включно. У інших втіленнях, терапевтично ефективна кількість антигену є у межах приблизно 250-4 000, включно, відносних одиниць на дозу, приблизно 500-3 000 включно, відносних одиниць на дозу, приблизно 750-2 000 включно, відносних одиниць на дозу, або приблизно 1 000-1500 включно, відносних одиниць на дозу. Терапевтично ефективна кількість антигену у вакцинах, які містять інактивовані віруси може також бути виміряна у межах відносної імуногенності (ВІ) на мл. Терапевтично ефективна кількість часто дорівнює приблизно 0. 1-50 ВІ на мл, включно. У інших втіленнях, терапевтично ефективна кількість антигену дорівнює приблизно 0. 5-30 ВІ на мл, включно, приблизно 1-25 ВІ на мл, включно, приблизно 2-20 ВІ на мл, включно, приблизно 3-15 ВІ на мл, включно, або приблизно 5-10 ВІ на мл, включно. У одному втіленні, антиген FeLV був вироблений з клітинної лінії FL74-UCD-1 (ATCC № CRL8012) яку було систематично інфіковано вірусним штамом KT-FeLV-UCD-1 вірусу котячої лейкемії Кількість антигену FeLV у вакцині може бути виміряна як кількість вірусного білку gp70 на мл. Терапевтично ефективна кількість антигену FeLV, яка може бути виміряна як кількість вірусного білку gp70 на мл, головним чином є у межах приблизно 100-350 000, включно. У іншому втіленні – у межах приблизно 1 000-300 000 нг/мл, включно, або приблизно 2500-250 000 нг/мл, включно, або приблизно 4 000-220 000 нг/мл, включно, або приблизно 5 000-150 000 нг/мл, включно, або приблизно 10 000 нг/мл - 100 000 нг/мл, включно. Кількість клітин для бактеріального антигену, введеного у вакцині, коливається у межах 6 10 приблизно 1 × 10 -5 × 10 одиниць, що формують колонію(CFU) на дозу, включно. У інших 7 10 втіленнях, кількість клітин коливається приблизно 1 × 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно, або 8 10 приблизно 1 × 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно. Ще у інших втіленнях, кількість клітин 2 10 4 9 коливається приблизно 1 × 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно, або приблизно 1 × 10 -5 × 10 5 9 CFU на дозу, включно, або приблизно 1 × 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно, або приблизно 1 × 6 9 6 8 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно, або приблизно 1 × 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно, або 7 9 приблизно 1 × 10 -5 × 10 CFU на дозу, включно. 2 Кількість клітин для антигену паразиту, введеного у вакцині, коливається приблизно 1xl0 10 3 1xl0 на дозу, включно. у інших втіленнях, кількість клітин коливається приблизно 1 × 10 -1 × 9 4 8 5 10 на дозу, включно, або приблизно 1 × 10 -1 × 10 на дозу, включно, або приблизно 1 × 10 -1 × 7 6 8 10 на дозу, включно, або приблизно 1 × 10 -1 × 10 на дозу, включно. При застосуванні звичайних ад'ювантів добре відомо, що значно більша кількість інактивованих вірусів, ніж модифікованих живих або послаблених вірусів необхідна для симулювання відповідного рівня серологічної відповіді, . Проте, було несподівано знайдено, що з ад'ювантними композиціями, які тут описано, приблизно однакові кількості інактивованого вірусу та модифікованого живого вірусу стимулюють подібні рівні серологічної відповіді. На додаток, менші кількості модифікованих живих, послаблених, та інактивованих вірусів необхідні разом з описаними тут ад'ювантами, порівняльно з звичайними ад'ювантами для досягнення 10 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 того ж самого рівня серологічної відповіді. Ці неочікувані знахідки демонструють збереження ресурсів та скорочення витрат у процесі приготування імуногенних та вакцинних композицій. Для вакцин широкого споживання, потрібно виробництво мільйонів доз на рік, так що ця економія може бути суттєвою. Водні ад'юванти забезпечують певні переваги. Вони головним чином легкі для утворення та введення, та можуть викликати небагато або менш серйозні реакції у місці ін'єкції. Проте, водні ад'юванти з антигеном мають тенденцію розсіюватися з місця ін'єкції, очищуватися печінкою суб'єкта, та породжувати неочікувану неспецифічну імунну відповідь. Було несподівано знайдено, що описані тут водні ад'ювантні композиції залишаються у місці ін'єкції до біометаболізації, яка трапляється впродовж довгого періоду часу та забезпечують цільову імунну відповідь. Олія, коли її додано, як компонент ад'юванту, головним чином забезпечує довге та повільне вивільнення. У даному винаході, олія може бути здатною або не здатної до метаболізації. Олія може бути у вигляді "олія у воді", "вода у олії", або емульсії "вода у олії у воді". Олії, придатні для використання у цьому винаході охоплюють алкани, алкени, алкіни, та їх подібні кислоти та спирти, естери та їх складні естери, та їх суміші. Індивідуальні сполуки олій це легкі вуглеводневі сполуки, тобто, такі компоненти мають 6-30 атомів карбону. Олія може бути синтетично приготованою або отриманою з продуктів нафти. Група може мати пряму або розгалужену ланцюгову структуру. Вона може бути цілком насиченою або мати один або більше подвійних або потрійних зв'язків. Деякі нездатні до метаболізації олії, що можуть використовуватися у цьому винаході охоплюють, наприклад, мінеральні олії, парафінові олії, та циклопарафіни. Термін "олія" також охоплює термін "легка мінеральна олія", тобто, олія, яка так само отримана шляхом дистиляції нафти, але яка має трохи нижчу питому вагу ніж біла мінеральна олія. Здатні до метаболізації олії охоплюють здатні до метаболізації, нетоксичні олії. Олія може бути будь-якою олією рослинного, тваринного, або рибного походження, або синтетично приготованою олією, яка може бути метаболізована тілом суб'єкта, якому введено ад'ювант, та яка не є токсичною для суб'єкта. Джерела походження для рослинних олій охоплюють горіхи, насіння та зерно. Емульсія "олія у воді", передбачена цим винаходом складаються з препарату AMPHIGEN®. Цей препарат містить водний компонент, лецитин, мінеральну олію, та поверхнево-активні речовини. Компоненти цього препарату докладно викладені у патентах US 5, 084, 269 та US 6, 572, 861. Звичайно, компонент олії у цьому винаході присутній у кількості 1 % - 50 об%; або у кількості 10 % - 45 %; або у кількості 20 % - 40 %. Інші компоненти композицій можуть охоплювати фармацевтично прийнятні наповнювачі, такі як носії, розчинники, та розріджувачі, ізотонічні агенти, буферні агенти, стабілізатори, консерванти, судинозвужуючи агенти, антибактеріальні агенти, протигрибкові агенти, тощо. Типові носії, розчинники, та розріджувачі охоплюють воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерол, олію, тощо. Характерні ізотонічні агенти охоплюють натрію хлорид, декстрозу, манітол, сорбітол, лактозу, тощо. Корисні стабілізатори охоплюють желатин, альбумін, та подібн. Поверхнево-активні речовини використані для стабілізації емульсії, відібраної для дії у якості носія для ад'юванту та антигену. Поверхнево-активні речовини, придатні для використання у даному винаході охоплюють природні біологічно сумісні поверхнево-активні речовини та не-природні синтетичні поверхнево-активні речовини. Біологічно сумісні поверхнево-активні речовини охоплюють фосфоліпідні сполуки або суміші фосфоліпідів. Бажаними фосфоліпідами є фосфатидилхоліни (лецитин), такі як соєвий або яєчний лецитин. Лецитин може бути отриманий як суміш фосфатидів та тригліцеридів миттям водою необробленої рослинної олії, та відділенням та висушуванням отриманих гідратованих речовин. Очищений продукт може бути отриманий шляхом фракціонування суміші до нерозчинних у ацетоні фосфоліпідів та глюколіпідів, які залишилися після усунення тригліцеридів та рослинної олії промиванням ацетоном. Крім того, лецитин може бути отриманий з різних торгівельних джерел. Інші придатні фосфоліпіди охоплюють фосфатіділгліцерін, фосфатидилінозитол, фосфатидилсерин, фосфатидну кислоту, кардіоліпін, та фосфатидилетаноламін. Фосфоліпіди можуть бути отримані з природних джерел або синтезовані традиційним способом. Неприродні, синтетичні поверхнево-активні речовини, придатні для використання у цьому винаході охоплюють неіонні поверхнево-активні речовини на базі сорбітану, наприклад, заміщені жирними кислотами сорбітанові поверхнево-активні речовини (що є у продажу під 11 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 торгівельними марками SPAN® або ARLACEL®), естери жирної кислоти поліетоксилованого сорбітолу (TWEEN®), поліетиленгліколеві естери жирних кислот з таких джерел, як касторова олія (EMULFOR®); поліетоксілована жирна кислота (наприклад, стеаринова кислота, що є у наявності під торгівельною маркою SIMULSOL M-53®), поліетоксілований полімер ізооктилфенолу/формальдегіду (TYLOXAPOL®), поліоксиетиленові жирні спиртові естери (BRIJ®); поліоксиетиленові нефенилові естери (TRITON® N), поліоксиетиленові ізооктилфенілові естери (TRITON® X). Взагалі кажучи, поверхнево-активна речовина, або комбінації поверхнево-активних речовин, якщо використано дві або більше поверхнево-активних речовин, присутні у емульсії у кількості 0. 01 % - 10 об%, бажано, 0. 1 % - 6. 0 %, більш бажано 0. 2 % - 5. 0 %. Як використано тут, " фармацевтично прийнятний носій" охоплює будь-якій, та всі розчинники, дисперсні середовища, матеріали оболонки, ад'юванти, стабілізатори, розчинники, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, агенти затримки адсорбції, тощо. Носій(носії) повинен бути "прийнятним", тобто бути сумісним з іншими компонентами композиції та не бути шкідливим для суб'єкту. Звичайно, носії повинні бути стерильними, апірогенними, та відібраними в залежності від обраного способу введення. Фахівцям добре відомо, що бажані препарати для фармацевтично прийнятних носіїв, які містять композиції є затвердженими у відповідних положеннях, що встановлюються United States (US) Department of Agriculture or US Food and Drug Administration, або подібними урядовими органами у інших країнах. Отже, фармацевтично прийнятим носієм для комерційного виробництва композиції є носій, що вже затверджений або буде затверджений відповідною урядовою установою у Сполучених Штатах або у іншій країні. Композиції також можуть містити сумісні фармацевтично прийнятні (тобто стерильні або нетоксичні) рідкі, напівтверді, або тверді розчинники, які служать у якості фармацевтичних засобів для транспорту, наповнювачів, або посередників. Розчинники можуть містити воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Ізотонічні агенти можуть містити хлорид натрію, декстрозу, манітол, сорбітол, та, серед іншого, лактозу. Стабілізатори містять, серед іншого, алюміній. Композиції можуть також містити антибіотики або консерванти, наприклад, гентаміцин, мертіолат, або хлорокрезол. Різні класи антибіотиків або консервантів, з яких можна підібрати бажані, добре відомі фахівцям. Отримання композицій Отримання композицій ад'ювантів ISCOM може бути приготований шляхом об'єднання сапоніну, стеролу, та фосфоліпіду. Наприклад, ISCOM може містити 5 % - 10 % від загальної маси Quil A, 1 % - 5 % - холестерину та фосфоліпідів, та білок у залишку. Співвідношення сапоніну до стеролу у ад'ювантних препаратів звичайно дорівнює від 1:100 (співвідношення однієї маси до другої за масою до 5:1 за масою. У деяких втіленнях, присутній надлишок стеролу та співвідношення сапоніну до стеролу є щонайменше 1:2 за масою, або 1:5 за масою. У інших втіленнях, сапонін є у надлишку до стеролу, та використовується співвідношення сапоніну до стеролу приблизно 5:1 за масою. ISCOM та ISCOMATRIX є у наявності у продажу від Isconova AB (Sweden). У деяких втіленнях, CARBOPOL® використовується у комбінації з DDA у кількості щонайменше 0. 1 частини маси CARBOPOL® на частину маси DDA. У інших втіленнях, використовується щонайменше 0. 5 частини маси CARBOPOL® на частину маси DDA. Ще у інших втіленнях, використовується щонайменше 1 частина маси CARBOPOL® на частину маси DDA. Комбінація CARBOPOL® та DDA утворює комплекс, за допомогою чого функціональна група третинного аміну DDA надає імунні функції боковим групам карбонової кислоти полімеру. Це дозволяє специфічним імунним клітинам поцілювати одночасно у антиген та у ад'ювант та доставляти разом антиген та ад'ювант за оптимальний час та у оптимальній концентрації до вказаної клітини. Ад'юванти, що тут вказані, головним чином не потребують будь-яких специфічних носіїв, та можуть бути приготовані у водному або іншому фармацевтично прийнятному буфері. У деяких випадках, вакцини названих втілень можуть бути представлені з відповідним носієм, такім як, наприклад, додаткові ліпосоми, мікросфери або частини антигену у капсулах. Антиген може розміщатися на внутрішньому боці везикулярної мембрани, або розміщатися назовні. Головним чином, розчинні антигени містяться назовні, а гідрофобні або модифіковані ліпідами антигени розміщуються або всередині, або назовні мембрани. Ад'ювантні композиції можуть бути зроблені в різних формах, залежно від шляху введення, вимог зберігання, тощо. Наприклад, вони можуть бути зроблені у вигляді стерильних водних розчинів або дисперсної суміші, придатних для введення шляхом ін'єкції, або зроблені у ліофілізованих формах з застосуванням способів ліофілізації, вакуумного підсушування, або 12 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підсушування розпиленням. Ліофілізовані композиції можуть бути відтворені перед використанням у стабілізаційному розчині, наприклад, у фізіологічному розчині або HEPES. Отже, ад'ювантні композиції можуть бути використані у твердому, напівтвердому, або рідкому вигляді дозування. Ад'юванти можуть бути вироблені з застосуванням технологій, що відомі фахівцям. Наприклад, сапонін та холестерин можуть бути змішані у придатний детергент, після чого застосовується екстракція розчинника для утворення ліпосом або ISCOMів. Сапонін та холестерин також можуть бути поєднаними для створення спіральних міцел, як описано у US Patent № 7, 122, 191. Буферований фосфатом фізіологічний розчин (PBS) може бути використаний як водна буферна середа; pH буферу може бути нейтральним або слабо лужним або слабо кислим. Відповідно, pH може бути у межах pH 6-8. Загальним є pH приблизно 7. 0-7. 3. Сила буферу може бути 10-50 мМ P04 та 10-150 мМ PO4. У одному прикладі, було використано 0. 063 % PBS. PH може бути відрегульовано застосуванням NaOH або HCl, якщо це потрібно. Типові концентрації охоплюють 1N-10N HCl та 1N-10N NaOH. Кількість використаного ад'юванту залежить від антигену, до якого він використовується та від дозування антигену, яке повинно застосовуватися. Також це залежить від призначених видів та бажаного препарату. Звичайно кількість є у межах, які традиційно використовують для ад'ювантів. Наприклад, ад'юванти звичайно становлять приблизно 1 мкг - 1000 мкг, включно, у 1-мл дозі. Так само, антибіотики звичайно становлять приблизно 1 мкг - 60 мкг, включно, у 1-мл дозі. Препарати стимуляторів можуть бути гомогенізовані або мікрофлюїдовані. Препарати піддають первинному процесу змішування, звичайно, проходженням за один або разів крізь один або декілька гомогенізаторів. Для цієї мети може бути використано будь-який комерційно доступний гомогенізатор, наприклад, емульгатор Росса (Hauppauge, NY), Gaulin гомогенізатор (Everett, MA), або Microfluidics (Новton, MA). У одному втіленні, препарати були гомогенізовані впродовж трьох хвилин при 10 000 об. /хв. Мікрофлюїдування може бути зроблено використанням комерційно доступного мікрофлюїдайзеру, такого як модель № 11OY, що можна придбати у Microfluidics, (Новton, Mass.); Gaulin модель 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); та Rainnie Minilab тип 8. 30H (Miro Atomizer Food та Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Ці мікрофлюїдайзери працюють, примушуючи рідини проходити крізь малі отвори під високим тиском, таким, що два струмені рідини взаємодіють на великих швидкостях у камері взаємодії для формування суміші з крапель субмікронного розміру. У одному втіленні, препарати були мікрофлюїдовані проходженням крізь 200-мікронну камеру обмеженого розміру при 10 000 +/- 500 фунтів на квадратний дюйм. Ад'ювантні композиції, що описано тут можуть бути разом гомогенізованими та мікрофлюїдованими. У одному втіленні, антиген було додано до відповідного буферу. Розчин збовтували, та сапонін було повільно додано до розчину антигену. Далі повільно додали стерол до розчину антиген/сапонін, після цього до розчину антиген/сапонін/стерол повільно додавали четвертинну сполуку амонію. Отримана композиція була гомогенізована, та далі мікрофлюїдована. Після мікрофлюїдизації до мікрофлюїдованої композиції було додано полімер. У залежності від використаних компонентів, порядок цих кроків може бути змінений для покращення приготування композиції. Ад'ювантні композиції, що описано тут можуть бути використані у виробництві імуногенних та вакцинних композицій. Для вакцинних або імуногенних композицій, кожна доза містить терапевтично ефективну кількість антигену, або антигенів, що можуть змінюватися у залежності від віку та загального стану суб'єкту, способу введення, походження антигену, та інших факторів. Кількості та концентрації інших компонентів вакцин або імуногенні композицій можуть бути відрегульовані зміненням фізичних та хімічних властивостей композиції, та можуть швидко бути визначені фахівцями. Переважною ознакою ад'ювантних композицій є те, що вони здатні повністю змінювати конфігурацію у залежності від бажаної характеристики композиції. Наприклад, якщо бажаною буде побільшена Th1 відповідь, то кількість стимулятору Th1 може бути збільшена. Відповідно, якщо бажаною буде побільшена Th2 відповідь, то кількість стимулятору Th2 може бути збільшена. Також може бути досягнута збалансована Th1/Th2 відповідь. Імуногенні та вакцинні композиції можуть також бути гомогенізовані або мікрофлюїдовані як описано вище. Розміри доз композицій звичайно є у межах приблизно 1 мл - 5 мл, включно, у залежності від суб'єкту та антигену. Наприклад, для собак або кішок, звичайно використовують дози приблизно 1 мл, в той час як для великої рогатої худоби звичайно використають дози приблизно 2-5 мл. Проте, ці ад'юванти також можуть бути приготовані у мікродозах, де дози приблизно 100 мкл можуть бути використані. 13 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Способи введення ад'ювантних композицій охоплюють парентеральний, пероральний, ороназальний, інтраназальний, інтратрахеальний, місцевий, та введення у яйце. Будь-який придатний пристрій може бути використаний для введення композиції, в тому числі шприци, крапельниці, безголкові пристрої для ін'єкцій, пластирі, тощо. Спосіб та пристрій, відібраний для використання буде залежити від ад'ювантної композиції, антигену, та суб'єкту, та вони є добре відомими фахівцям. Одною з вимог для будь-якого приготування ад'юванту вакцини для комерційного використання є створення стабільності розчину ад'юванту на довгий строк зберігання. Надані тут ад'ювантні препарати є легкими у виробництві та стабільними щонайменше 18 місяців. У одному втіленні, препарати є стабільними приблизно 18 місяців. У іншому втіленні, препарати є стабільними у межах 18-24 місяців. У іншому втіленні, препарати є стабільними приблизно 24 місяців. Способи прискореного тестування також показують, що препарати, які описані тут, є стабільними. Корисною рисою даних композицій ад'ювантів є те, що вони можуть бути безпечно та ефективно введені широкому ряду суб'єктів. У цієї галузі очікується, що комбінації ад'ювантів будуть показувати більшу реактогенність ніж індивідуальні компоненти. Проте, композиції, що описані тут, показують зменшену реактогенність порівняльно з композиціями, у яких будь-який один або два компонента були використані, в той час як зберігалася дія ад'юванту. Також було несподівано знайдено, що ад'ювантні композиції, описані тут показують безпечні поліпшення, порівняно з іншими композиціями ад'ювантів. Ад'ювантні композиції, що описані тут є корисними для продукування бажаної імунної відповіді у суб'єкті. Вони є дієздатними у численних видах. Придатним суб'єктом є будь-яка тварина, для якої є бажаним введення ад'ювантної композиції. Цей термін охоплює ссавців та не-ссавців, в тому числі приматів, домашню худобу, домашніх тварин, лабораторних дослідних тварин, спійманих диких тварин, птиць (в тому числі яйця), рептилій, та рибу. Отже, цей термін охоплює без обмежень мавп, людей, свиней; велику рогату худобу, баранів, кіз, коней, мишей, щурів, морських свинок, хом'яків, кролів, кішок, собак, курчат, індиків, качок, іншу свійську птицю, жаб, та ящірок. Ад'юванти, що описано тут можуть бути використані для того, щоби показати серологічну різницю між інфікованими та вакцинованими тваринами. Отже, вони може бути використані у маркерній вакцині, де антиген у вакцині викликає у вакцинованих тварин інші типи антитіл, ніж подібні при інфекції вірусом дикого типу. Маркерну вакцину головним чином використовують у поєднанні з супутнім діагностичним тестом, який показує різницю у типах антитіл та демонструє, які тварини були вакцинованими та які тварини є інфіковані вірусом дикого типу. Така технологія є корисною у контролі та у знищенні вірусів популяції суб'єкту. Наступні приклади присутні тут як ілюстративний матеріал, але не повинні бути використані для обмежень обсягу винаходу. Багато змінень, варіацій, модифікацій, та інших використань та додатків цього винаходу будуть очевидні для фахівців. Приклади Приклад 1. Розчини Quil A /холестерин (QC). Quil A (Superfos) був розчинений у воді та був приготований 50 мг/мл базовий розчин. Холестерин, (Fabri Chem Inc.) був розчинений у етанолі та був приготований 18мг/мл базовий розчин. Базовий розчин холестерину далі був відфільтрований з застосуванням 0. 2мікронового фільтру. Концентрації Quil A та холестерину у різних препаратах були як низькі, як 1/1 мкг/мл Quil A до холестерину, так і високі, як 1000/1000 мкг/мл. Для приготування базового 50/50мкг/мл розчину Quil A/холестерину, базовий розчин Quil A був розбавлений водою до концентрації 50мкг/мл. Поки цей розчин перемішувався, було повільно додано базовий розчин холестерину до кінцевої концентрації 50мкг/мл. Приклад 2. Розчини DDA (D). Диметил діоктадецил амонію бромід (DDA; Fluka Analytical), був розчинений у етанолі, та був приготований 18мг/мл базовий розчин. Базовий розчин DDA був відфільтрований з застосуванням 0. 2-мікронового фільтру. Приклад 3. Розчини Quil A /холестерин/DDA (QCD). Базовий розчин Quil A/холестерин був приготований відповідно до Прикладу 1 до бажаної концентрації. Базовий розчин DDA був приготований відповідно до Прикладу 2 та повільно доданій до базового розчину Quil A/холестерин. Розчини були змішані до досягнення бажаної кінцевої концентрації. PH розчину був відрегульований з NaOH або HCl у кількості, яке було необхідно для досягнення бажаного рН, що головним чином був у межах приблизно 6. 9-7. 5. Приклад 4. Розчини CARBOPOL® (C). 14 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CARBOPOL® (Noveon, Mexico) був розчинений у деіонізованій воді та був приготований 1. 5 % базовий розчин. У іншому втіленні, CARBOPOL® був розчинений у деіонізованій воді та був приготований 0. 75 % базовий розчин. Приклад 5. Розчини DDA/CARBOPOL® (DC). Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2. Був приготований базовий розчин 0. 75 % CARBOPOL® відповідно до Прикладу 4. Розчини були змішані до досягнення бажаної кінцевої концентрації. Приклад 6. Розчини Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® (QCDC). Був приготований базовий розчин Quil A/Холестерин/DDA відповідно до Прикладу 3. Був приготований базовий розчин 0. 75 % CARBOPOL® відповідно до Прикладу 4. Базовий розчин CARBOPOL® був повільно доданій до базового розчину Quil A/Холестерин/DDA до досягнення бажаної кінцевої концентрації. PH розчину був відрегульований з NaOH або HCl у кількості, що було необхідно для досягнення бажаного рН, який головним чином був у межах приблизно 6. 97. 5. Приклад 7. Розчини Bay R1005® (R). Для приготування базового розчину Bay R1005®, глюколіпід N-(2-деокси-2-L-лейциламіно-βD-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканоіламід був розчинений у етанолі (60 об%). Далі додали Tween 20 та крижану оцтову кислоту. У одному прикладі, 3. 49 г N-(2-деокси-2-L-лейциламіно-βD-глюкопіранозил)-N-октадецилдодеканоіламід був розчинений у 44. 64 мл суміші етанол/вода (60 об%). Це було поєднано з 1. 12 мл Tween 20 та 0. 68 мл крижаної оцтової кислоти. Приклад 8. Розчини Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL®/Bay R1005® (QCDCR). Базовий розчин Quil A/холестерин/DDA/CARBOPOL® був приготований відповідно до Прикладу 6. Базовий розчин Bay R1005® був приготований відповідно до Прикладу 7. Розчин Bay R1005® був повільно доданій до розчину Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® до досягнення бажаної кінцевої концентрації. PH розчину був відрегульований NaOH або HCl у кількості, що було необхідно для досягнення бажаного рН, який головним чином був у межах приблизно 6. 9-7. 5. Приклад 9. Розчини DEAE декстрану (X). Базовий розчин DEAE декстрану (X) був приготований розчиненням 200 мг/мл DEAE декстрану у воді. Розчин може бути нагріто у автоклаві приблизно 20 хвилин при 120° Centigrade (C). Приклад 10. Розчини Quil A/холестерин/DDA/DEAE (QCDX). Базовий розчин Quil A/холестерин/DDA був приготований відповідно до Прикладу 3. Базовий розчин DEAE був приготований відповідно до Прикладу 9. Розчини були поєднані додаванням їх безпосередньо у гомогенізатор. При змішуванні був застосований спосіб швидкого змішування з використанням поперечного зсуву більш ніж 1 000 сек-1. Змішування було проведено додаванням водного розчину безпосередньо у олійну фазу, яка містила неполярні ад'юванти та антигенні компоненти та змішувалася, доки не була досягнута гомогенна стабільна суміш. Як правило, це може тривати як мінімум кілька хвилин або більше, в залежності від бажаного розміру частинок. Приклад 11. Олійні композиції (O). Був приготований базовий розчин олії шляхом комбінування мінеральної олії Drakeol з Tween 85 та Span 85, нагріванням до приблизно 55° C та далі охолодженням та стерильною фільтрацією. Ця суміш, таким чином, складається з олійної фази основного компонента з носієм у олійній фазі. Якщо холестерин та/або DDA були відібрані у якості співпрацюючих імуномодуляторів для однієї з цих композицій, вони також повинні бути додані до цієї суміші перед фільтрацією, так як вони розчиняються у олійній фазі. Приклад 12. Quil A/холестерин/DDA/DEAE/олійні композиції (QCDXO). Базовий розчин Quil A/холестерин/DDA/DEAE був приготований відповідно до Прикладу 10. Олійна базова композиція була приготована відповідно до Прикладу 11. Розчини були поєднані з Quil-A, DEAE-декстраном та водою для досягнення кількості при вказаних концентраціях. Ця водна фаза була змішана постійним збовтуванням реакції протягом декілька хвилин або довше при кімнатній температурі або вище та далі була стерильно відфільтрована та зберігалася для додавання до олійної фази. Водна фаза була повільно додана до олійної фази, яку постійно змішували. Приклад 13. Приготування імуногенних композицій або вакцинних композицій. Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген та один з ад'ювантів, що описані вище, бажаний антиген був доданій до відповідного буферу. Далі компоненти бажаного ад'юванту були додані, як описано вище. Отриманий розчин був доведений до кінцевого обсягу з буфером. 15 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 13a. Антиген, Quil A, Холестерин, DDA, CARBOPOL® Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil A, холестерин, DDA, та CARBOPOL®, бажаний антиген був доданій до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil A відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антигену. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A/холестерин. Розчин Антиген/Quil A/холестерин/DDA був гомогенізований та мікрофлюїдований. Був приготований 0. 75 % розчин CARBOPOL® відповідно до Прикладу 4. Після мікрофлюїдування, розчин CARBOPOL® (0. 05 об%) був доданій до мікрофлюїдованої композиції та pH був відрегульований з NaOH або HCl до 6. 9-7. 5. Приклад 13b. Антиген, Quil A, Холестерин, DDA, CARBOPOL®, Bay R1005®. Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil A, холестерин, DDA, CARBOPOL®, та Bay R1005®, бажаний антиген був доданій до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil A відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антигену. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A/холестерин. Розчин антиген/Quil A/холестерин/DDA далі був гомогенізований та мікрофлюїдований. 0. 75 % розчин CARBOPOL® був приготований відповідно до Прикладу 4. Після мікрофлюїдування, розчин CARBOPOL® (0. 05 об%) був доданій до мікрофлюїдованої композиції та pH був відрегульований з NaOH або HCl-6. 9-7. 5. Був приготований базовий розчин Bay R1005® відповідно до Прикладу 7. Компонент Bay R1005® був додано до водної фази додавання DDA. Приклад 13c. Антиген, Quil A, Холестерин, DDA, DEAE декстран. Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil A, холестерин, DDA, та DEAE декстран, бажаний антиген був доданій до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil A відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антигену. Композиція була гомогенізована. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A розчину впродовж гомогенізації. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A/холестерин впродовж гомогенізації. Розчин DEAE декстрану був приготований відповідно до Прикладу 9. Впродовж гомогенізації, було додано розчин DEAE декстрану та отримана композиція була доведена до кінцевого обсягу. Приклад 13d. Антиген, Quil A, Холестерин, DDA, DEAE декстран, олія. Для приготування імуногенної композиції або вакцинної композиції, що містить антиген, Quil A, холестерин, DDA, DEAE декстран, та олію, бажаний антиген було додано до відповідного буферу. Був приготований базовий розчин Quil A відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антигену. Композиція була гомогенізована. Був приготований базовий розчин холестерину відповідно до Прикладу 1 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A впродовж гомогенізації. Був приготований базовий розчин DDA відповідно до Прикладу 2 та повільно доданій до розчину антиген/Quil A/холестерин впродовж гомогенізації. Був приготований розчин DEAE декстрану відповідно до Прикладу 9 та доданій впродовж гомогенізації. Олійна композиція була приготована відповідно до Прикладу 11. Впродовж гомогенізації, олійна композиція була додана додаванням водної фази у олійну фазу під час гомогенізації та отримана композиція була доведена до кінцевого обсягу. Приклад 14. Вакцини вірусу кошачої лейкемії (FeLV). Тварини були випадково розподілені по групам лікування з застосуванням схеми рандомізованих повних блоків. Таблиця 1 показує план досліджень. Групи були сформовані на основі дати народження та окоту. Тварини були відсортовані по даті народження та потім по окоту. Були використані блоки по чотири тварини. У межах блоку, тварини були випадково розподілені для лікування. Для стадії вакцинації, два консекутивних блоки були об'єднані зі створенням групи з восьми тварин. Групи тварин були випадково розподілені до двох кімнат, так, що у кожній кімнаті містилося п'ять груп (10 блоків) тварин. У межах групи, тварини були випадково розподілені до чотирьох кліток, розміщених рядом таким чином, що кожна клітка містила дві тварини з однаковим лікуванням. Для фази інфікування, тварини з однієї кімнати вакцинації були випадково розподілені до будь-якої однієї або двох кімнат інфікування. З однієї кімнати вакцинації тварини відбиралися у дві кімнати інфікування, взагалі мали п'ять блоків, випадковим чином відібраних до кожної кімнати інфікування(2. 5 груп; 20 тварини). Інші кімнати 16 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 інфікування містили 10 блоків (5 груп; 40 тварини). У межах кімнати інфікування, тварини у однаковому блоку були випадково розподілені до чотирьох кліток, розміщених поруч. Вакцини для цих досліджень були приготовані відповідно до Прикладу 13 за виключенням того, що був використаний базовий розчин 1. 5 % CARBOPOL®. Особливо, була приготований ® LEUKOCELL 2 (Pfizer, Inc.) шляхом поширення FeLV, субгрупи A, B, та C, у FeLVтрансформованих лімфоїдних клітинах. Вірусні антигени були хімічно інактивовані, поєднані з стерильним ад'ювантом для посилення імунної відповіді, та розфасовані у вигляді рідини. Був приготований дослідний ветеринарний продукт (IVP), який містив вірус кошачої лейкемії та 25 мкг Quil A/ алюмінію гідроксид (ALHYDROGEL®) у загальній кількості 100 мл. Всього 94. 5 мл 1. 5 106 × 10 нг/мл FeLV базового розчину повільно перемішувалося протягом 15 хвилин. PH був відрегульований до 5. 9-6. 1 за допомогою 4N HCl або 18 % NaOH, у разі необхідності. Впродовж перемішування, до розчину антигену було додано 0. 5 мл 5. 0 мг/мл розчину Quil A. Далі, було повільно додано 5. 0 мл 100 об% ALHYDROGEL®. Композиція перемішувалася мінімум 2 години при 4° C. PH був відрегульований до 7. 0-7. 3 за допомогою 18 % NaOH або 1N HCl у разі необхідності. IVP, що містив вірус кошачої лейкемії та 37. 5 мкг Quil A/ алюмінію гідроксид (ALHYDROGEL®) був приготований таким самим чином, як для 25 мкг Quil A IVP, але до розчину антигену було додано 7. 5 мл базового розчину Quil A. Взагалі було приготовано 350 мл дослідного ветеринарного продукту (IVP), який містив вірус кошачої лейкемії Quil A, холестерин, 5 DDA, та CARBOPOL®.. Впродовж перемішування 349. 3 мл 1. 106 × 10 нг/мл базового розчину FeLV, до розчину антигену було повільно додано 0. 14 мл 50. 0 мг/мл розчину Quil A. Далі, було повільно додано 0. 39 мл 18 мг/мл розчину холестерин/етанол. Композиція була гомогенізована протягом трьох хвилин при 10 000 об/хв. Взагалі було додано 0. 19 мл 18. 0 мг/мл розчину DDA/етанол до композиції впродовж перемішування. Взагалі було повільно додано 5. 0 мл 1. 5 % розчину CARBOPOL® до 145. 0 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil A, холестерину, та DDA. PH був відрегульований до 7. 0-7. 3 за допомогою 18 % NaOH або 1N HCl у разі необхідності. Таблиця 1 План досліджень Фаза вакцинації Група лікування IVP № тварини T01 Фізіологічний розчин 20 0, 21 1. 0 T02 LEUKOCELL® 2 25 мкг Quil A / b Al(OH) 20 0, 21 1. 0 a Фаза інфікування День День Доза(мл) День вакцинації інфікування 17 Відбір проб Доза Шлях День (мл) введення -2, 35, 64, 85, 106, c d e SC 37, 40, 42 , 44 1. 0 ON 127, 134, 141, 148, 155 -2, 35, 64, 85, 106, d ПШ 37, 40, 42 , 44 1. 0 ОН 127, 134, 141, 148, 155 UA 104138 C2 Продовження таблиці 1 T03 LEUKOCELL® 2 37. 5 мкг Quil A b / Al(OH) 20 0, 21 1. 0 ПШ 37, 40, 42 , 44 1. 0 T04 Перероблений LEUKOCELL® 2 20 мкг Quil A / Холестерин / DDA / b CARBOPOL® 20 0, 21 1. 0 ПШ 37, 40, 42 , 44 1. 0 d ОН d ОН -2, 35, 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, 155 -2, 35, 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, 155 a Дослідний ветеринарний продукт Змішаний, що має відносну імуногенність порівняльно до зразкової вакцини (FeLV зразок Lot No. 12) c SC = Підшкірно d Depo-Medrol®: Доба 42 (приблизно 5. 0 мг/кг) внутрішньом'язово e ON=Oроназально Quil A – Холестерин = Сапонін, ад'ювант Quil A, включений у ліпідні частини холестерину. CARBOPOL® = Карбомер DDA = Диметилдіоктодециламонію бромід. b 5 10 15 20 25 30 35 Всі тварини вдень спостерігалися та спостереження записувалися. Температура тіла була поміряна та записана у всіх тварин крізь вушний канал у першу добу перед першим введенням дози вакцини та у 20 добу перед другим введенням дози вакцини. Пробу крові(1. 0 – 2. 0 мл) було зібрано у кожної тварини проколом з яремної вени у другу добу. Седативні дози TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) були введені відповідно до маси тіла (приблизно 5. 0 мг/кг), внутрішньом'язево, у намаганні зменшити стрес у тварин та ухилитися від пошкоджень персоналу під час відбору крові. Кров була зібрана у туби для розділення сироватки (SST) та оброблена для розділення сироватки. Сироватку зберігали при –20 °C або ще холодніше до випробування. Плацебо або вакцини FeLV були введені кошенятам підшкірно у дозі 1. 0 мл. Перша вакцинація була проведена у нульову добу та друге введення вакцини було проведено у 21 добу. Всі тварини спостерігалися приблизно одну годину після першої та другої вакцинації для спостереження негайних місцевих больових реакцій (реакцій гострого болю). Спостереження були документально зафіксовані. Температура тіла всіх тварин були виміряна крізь вухо у 1 та 2 добу після першого введення дози вакцини, та у 22 та 23 добу після другого введення дози вакцини. Реакції у місці ін'єкції (опухлості) були також визначені у першу добу після першої вакцинації та у 22 та 23 добу після другої вакцинації. Проби крові(1. 0 – 2. 0 мл) були зібрані з кожної тварини проколом з яремної вени у 35 добу, оброблені для розділення сироватки, та зберігали при –20 °C або холодніше, до випробування. У 35 добу, тварини були розміщені у індивідуальних ізольованих клітках. Вірусом для інфікування був вірулентний вірус кошачої лейкемії(FeLV), штам Rickard, з приблизним титром 6. 1 10 TCID50/мл. Препарат для інфікування FeLV був розморожений та зберігався у вологому льоді перед введенням. Тварини були інфіковані на 37, 40, 42, та 44 добу, назальним введенням 1. 0 мл нерозбавленого препарату. 1 мл туберкуліновий шприц, без голки, був наповнений препаратом введення. Кожному кошеняті було введено приблизно 0. 5 мл у ніздрю. У 42 добу, інфікування було проведено приблизно за 5 годин після введення DEPO-MEDROL®. 18 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Після кожної доби інфікування, зберігалася проба препарату введення для підтверджувального титрування.Після інфікування, пробу крові(1. 0 – 2. 0 мл) було зібрано з кожної тварин проколом з яремної вени, у 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148, та 155 добу. Седативні дози TELAZOL® (Fort Dodge) були введені, як описано вище. Кров був зібрано у туби для розділення сироватки (SST), приготовані для розділення сироватки, та зберігалася при –20 °C або нижче до випробування. Проби сироватки були перевірені на присутність FeLV p27 антигену (маркер FeLV інфекції) від ELISA (IDEXX; Westbrook, ME). Кінцеві результати були оцінені по інтенсивності розповсюдження кольору та на спектрофотометрі при оптичної щільності 405/490 нм. Для чинного тесту, позитивний контроль оптичної щільності спадав між 0. 131-2. 999 та негативний контроль повинен був мати оптичну густину нижче або дорівнювати 0. 0039. Виділення вірусу було проведено з застосуванням проб сироватки, зібраних у 2 та 35 добу. Проби сироватки 127-155 доби були розглядані для оцінки ефективності вакцини FeLV. Проби сироватки 127 доби (тиждень 12), 134 доби (тиждень 13), 141 доби (тиждень 14), 148 доби (тиждень 15) та 155 доби (тиждень 16) були перевірені на присутність FeLV p27 антигену. Тварина вважалася тривало інфікованою, якщо вона мала три або більше позитивних тесту на FeLV p27 антиген протягом 127 доби (тиждень 12) до 155 доби (тиждень 16). Температури були проаналізовані з застосуванням змішаної моделі лінійних повторних вимірювань, та були зроблені попарні порівняння між групами лікування T01 та T02, T03, та T04 у кожному моменті часу, якщо прояви у загальному лікуванні та/або у лікуванні у моменті часу були істотні. Квадратні мінімуми означають 95 % довірчі інтервали, мінімуми та максимуми були обчислені для кожного лікування у кожному моменті часу. Частотні розподіли присутності реакцій гострого болю були обчислені для кожного лікування та дані моменті часу були зібрані. Частотні розподіли присутності опухлостей місця ін'єкції були обчислені для кожного лікування та дані на момент часу були зібрано. Частотні розподіли присутності пост-вакцинаційних системних реакцій були обчислені для кожного лікування. Негайні реакції не спостерігали у будь-якої з груп лікування протягом першої та другої вакцинації. Шкідливі реакції не спостерігалися у будь-якої з груп лікування протягом приблизно однієї години після першої та другої вакцинації. Ні пірексия (температура тіла > 39. 5C) ні гіпотермія (температура тіла 0. 08). Опухлості у місті Ін'єкції не спостерігалися у будь-якої з груп лікування після першої та другої вакцинації. Кінцеві результати з 12 тижня до 16 тижня пост-інфікування показали, що 16 з 19 тварин (84 %) що отримали плацебо (T01 група) були тривало віремічні до FeLV. 13 з 19 тварин (68 %) у групі T02 були захищені від вірулентного інфікування FeLV. Рівень захисту був статистично значним (p=0. 0004) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 12 з 19 тварин (63 %) у групі T03 були захищені від вірулентного інфікування FeLV. Рівень захисту був статистично значним (p=0. 0013) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 19 з 20 тварини (95 %) у групі T04 були захищені від вірулентного інфікування FeLV. Рівень захисту був статистично значним, (p=0. 0001) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. Отже, всі вакцини, що були введені групам T02, T03 та T04 продемонстрували безпечність у кошенят мінімального віку, при введенні у дводозовому режимі, три тижні по окремості. На додаток, вакцини, введені цім групам були також здатні до суттєвого зниження рівню FeLV тривалої віремії у кошенят мінімального віку, коли вони введені при введенні у дводозовому режимі, три тижні по окремості. Було статистично значне скорочення у створенні тривалої віремії FeLV кошенят у групах T02, T03 та T04. На додаток, була статистично важлива різниця між T04 та іншими вакцинованими групами (T02, T03). Було несподівано та неочікуване те, що вакцини, який містить новий препарат ад'юванту виявилися більш ефективними, ніж ті, які містять компоненти ад'юванту, що звичайно використовують у кішок. Приклад 15. Вакцини вірусу кошачої лейкемії. Кошенята були акліматизовані 16 діб після прибуття. Тварини були далі випадково розподілені до кімнати, та у межах кімнати, були випадково розподілені на лікування (1 тварина на лікування у кожній кімнаті). Пробу крові(1. 0 – 2. 0 мл) було зібрано у кожній тварині проколом з яремної вени у – 1 добу досліджень. Седативні дози TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) були введені відповідно до маси тіла (приблизно 5. 0 мг/кг) внутрішньом'язево у намаганні зменшити стрес у тварин та ухилитися від пошкоджень персоналу під час відбору крові. Кров було зібрано у туби для розділення сироватки та оброблено для розділення сироватки. Всі тварини також спостерігалися протягом доби, та спостереження були записані. 19 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вакцини були приготовані відповідно до Прикладу 13 за виключенням того, що був ® використаний 1. 5 % базовий розчин CARBOPOL®. LEUKOCELL 2 був приготований шляхом поширення FeLV, субгрупи A, B, та C, у FeLV-трансформованих лімфоїдних клітинах. Вірусні антигени були хімічно інактивовані, поєднані з стерильним ад'ювантом для посилення імунної відповіді, та розфасовані у вигляді рідини. Загальна кількість 500. 0 мл IVP, що містить вірус кошачої лейкемії з відносною ефективністю (ВІ) - 2, а також Quil A, холестерин, та DDA був приготований наступним способом. 20. 7 мл базового розчину FeLV (50. 0 ВІ/мл, де 1 ВІ = 3, 624 нг/мл антигену) було додано до 478. 2 мл 0. 063 % PBS буферу. Впродовж перемішування, 0. 21 мл 50. 0 мг/мл розчину Quil A було повільно додано до розчину антигену. Далі, було повільно додано 0. 58 мл18 мг/мл розчину холестерин/етанол. Далі до композиції впродовж перемішування був повільно доданій розчин 0. 29 мл18. 0 мг/мл DDA/етанол. Композиція була гомогенізована три хвилини при 10 000 об/хв. Композиція була далі мікрофлюїдована одним проходом крізь 200-мікронову камеру з обмеженим розміром при 10 000 (+ 500) фунтів на квадратний дюйм. Впродовж перемішування, 10. 0 м 1. 5 % розчину CARBOPOL® було повільно додано до 290. 0 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil A, холестерину, та DDA. PH був відрегульований до 7. 0-7. 3 додаванням 18 % NaOH або 1N HCl у разі необхідності. IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 5 був приготований таким само чином, як IVP з a ВІ – 2, з застосуванням 51. 7 мл базового розчину FeLV та 447. 2 мл 0. 063 % PBS буфера, кількості інших компонентів залишаються незмінними. IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 10 був приготований таким само чином, як IVP з ВІ - 2, з застосуванням 93. 1 мл базового розчину FeLV, 355. 9 мл 0. 063 % PBS буферу, 0. 19 мл розчину Quil A, 0. 52 мл розчину холестерину, та 0. 26 мл розчину DDA (загальний обсяг 450 мл). Далі, 8. 3 мл 1. 5 % розчин CARBOPOL® був повільно доданій до 241. 7 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil A, холестерину, та DDA. IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 15 був приготований таким само чином, як IVP з ВІ - 10 з застосуванням 139. 7 мл базового розчину FeLV та 309. 4 мл 0. 063 % PBS буферу, кількості інших компонентів залишаються незмінними. IVP який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 20 був приготований таким само чином, як IVP з ВІ - 2 з застосуванням 206. 9 мл базового розчину FeLV та 292. 0 мл 0. 063 % PBS буферу, кількості інших компонентів залишаються незмінними. Для введення 0. 5 мл дози, 300. 0 мл IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 5, Quil A, холестерин, DDA, та CARBOPOL® був приготований наступним способом. 21. 7 мл базового розчину FeLV (35. 8 ВІ/мл, де 1 ВІ = 1, 864 мкг /мл антигену) було додано до 277. 7 мл 0. 063 % PBS буферу. Впродовж перемішування, 0. 12 мл 50. 0 мг/мл розчину Quil A було повільно додано до розчину антигену. Далі, було повільно додано 0. 35 мл 18 мг/мл розчину холестерин/етанол. Загалом до композиції впродовж перемішування було повільно додано 0. 17 мл 18. 0 мг/мл розчину DDA/етанол. Композиція була гомогенізована три хвилини при 10 000 об/хв. Далі композиція була мікрофлюїдована одним проходом крізь 200-мікронову камеру з обмеженим розміром при 10 000 (+ 500) фунтів на квадратний дюйм. Впродовж перемішування, 3. 3 мл1. 5 % розчин CARBOPOL® було повільно додано до 96. 7 мл композиції вірусу кошачої лейкемії, Quil A, холестерину, та DDA. PH був відрегульований до 7. 0-7. 3 додаванням 18 % NaOH або 1N HCl, у разі потреби. IVP для введення a 1. 0 мл дози вірусу кошачої лейкемії з ВІ - 5, Quil A, холестерином, DDA, та CARBOPOL® був приготований таким само чином, як для 0. 5 мл дози з відповідно відрегульованими кількостями. Взагалі було приготовано 300. 0 мл IVP, який містить вірус кошачої лейкемії з ВІ - 10 та CARBOPOL®. 62. 1 мл базового розчину FeLV (50. 0 ВІ/мл, де 1 ВІ = 3, 624 мкг /мл антигену) було додано до 237. 9 мл 0. 063 % PBS буферу. Композиція була гомогенізована три хвилини при 10 000 об/хв. Далі композиція була мікрофлюїдована одним проходом крізь 200-мікронову камеру з обмеженим розміром при 10 000 (+ 500) фунтів на квадратний дюйм. Впродовж перемішування, 3. 3 мл1. 5 % розчин CARBOPOL® було повільно додано до 96. 7 мл композиції вірусу кошачої лейкемії. PH був відрегульований до 7. 0-7. 3 додаванням 18 % NaOH або 1N HCl у разі необхідності. Плацебо та вакцини FeLV (Таблиця 2) були введені кошенятам підшкірно з застосуванням голки 22 калібру x ¾’’ та 3 cc шприцу у 0 та 20 добу досліджень. Групі лікуванняT01 був введений плацебо вакцини з дозою 1. 0 мл. Групам лікування T02, T04, T05, T06, T07, T08 та T09 були введені вакцини FeLV з дозою 1. 0 мл. Групі лікуванняT03 було введено вакцину FeLV з дозою 0. 5 мл. Групі лікування T10 було введено FeLV пташиного вірусу (canarypox) вакцину (Meriaл) внутрішньошкірно з застосуванням внутрішньошкірного пістолетного ін'єктора. 60 20 UA 104138 C2 Таблиця 2 План досліджень Група лікування № тварини Цільова відносна ефективність Шлях введення T01 10 N. A. ПШ PBS Ад'ювант Середа культури клітин No ад'юванту Вакцина Нормальний фізіологічний розчин Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® Quil A – Холестерин DDA – CARBOPOL® T02 10 5 ВІ ПШ / 0. 5 мл Інактивований FeLV 10 20 ВІ ПШ Інактивований FeLV T05 10 15 ВІ ПШ Інактивований FeLV T06 10 10 ВІ ПШ Інактивований FeLV T07 10 5 ВІ ПШ Інактивований FeLV T08 10 2 ВІ ПШ Інактивований FeLV T09 10 10 ВІ ПШ Інактивований FeLV CARBOPOL® T10 15 ПШ T04 10 5 ВІ T03 5 10 Інактивований FeLV 10 Живий rFeLV (Merial) ID Живий (Merial) Без ад'юванту rFeLV RPMI RPMI Cellgro Cellgro Cellgro Cellgro Cellgro Cellgro Приватний (Merial) Всіх тварин спостерігали після першої вакцинації (0 доба досліджень) та другої вакцинації (20 доба досліджень) для спостереження ознаків болю під час введення тестової вакцини, в тому числі застосування голосу, дряпання/кусання, проявів агресії та спроб втечі. Також був документально зафіксований пост-вакцинаційний стан тварин (нормальний або ненормальний). Всі тварини спостерігалися приблизно одну годину після введення вакцини у 0 добу досліджень та 20 добу досліджень для спостережень розвитку шкідливих систематичних реакцій. Спостереження були документально зафіксовані. Місця вакцинації були пальповані, та записані випадки болю у місці ін'єкції, почервоніння у місці ін'єкції, опухлості у місці ін'єкції та розмір опухлості у місці ін'єкції. Спостереження були проведені на 2, 5 та 9 добу досліджень після першої вакцинації, та на 25, 28 та 32 добу досліджень після другої вакцинації. Спостереження були документально зафіксовані. Пробу крові(1. 0 – 2. 0 мл) було зібрано з кожної тварини проколом з яремної вени на 32 добу досліджень (пре-інфікування). Тварини були інфіковані на 34, 36, 39, та 41 добу досліджень назальним введенням 1. 0 мл нерозбавленого препарату введення. 1 мл туберкуліновий шприц, без голки, був наповнений препаратом введення. Кожне кошеня 21 UA 104138 C2 6. 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 отримало приблизно 0. 5 мл у ніздрю. Препарат для інфікування FeLV мав середній титр 10 TCID50/мл. Пробу крові (1. 0 – 2. 0 мл) далі було зібрано з кожній тварини проколом з яремної вени на 61, 83, 106, 126, 133, 138, 146, та 152 добу досліджень. Протягом першої (0 доба досліджень) вакцинації, три тварини у групі лікування T09 показали негайну реакцію типу гострого болю. Протягом другої вакцинації (20 доба досліджень), одна тварина з групі лікування T05, чотири з групі лікуванняT08, та дві з групі лікуванняT09 продемонстрували негайні реакції типу гострого болю Протягом першої вакцинації, три тварини у групі лікуванняT09 продемонстрували слабке застосування голосу. У тварин, які відчували біль при першій вакцинації також у той час спостерігалося слабке застосування голосу. Протягом другої вакцинації, одна тварина у групі лікуванняT05, чотири у групі лікуванняT08, та дві у групі лікуванняT09 продемонстрували слабке застосування голосу. У тварин, які відчували біль при другій вакцинації також у той час спостерігалося слабке застосування голосу. Протягом першої вакцинації, три тварини у групі лікування T09 продемонстрували агресивну поведінку/спробу до втечі. Протягом другої вакцинації, одна тварина у групі лікуванняT05, чотири у групі лікуванняT08, та дві у групі лікуванняT09 продемонстрували агресивну поведінку/спробу до втечі. Жодна з груп лікування не проявила випадків дряпання/кусання у місці ін'єкції під час першої або другої вакцинації. Реакції у місці ін'єкції не спостерігалися у жодної з груп лікування після першої або другої вакцинації. Шкідливі реакції також не спостерігалися у жодної з груп лікування. Всі тварини були негативними на FeLV p27 антиген перед вакцинацією, як свідчать проби сироватки, що були зібрані у –1 добу. Всі тварини також виявилися негативними на FeLV p27 антиген перед інфікуванням, як свідчать проби сироватки, що були зібрані у добу 32. Загальні результати з 12 тижня по 16 тиждень після інфікування (Таблиця 3) показали, що 9 з 10 тварин (90 %) у групі лікуванняT01 (плацебо) були тривало віремічні до FeLV. Результати того ж самого періоду показали, що 6 з 10 тварин (60 %) у групі лікування T02 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту не був статистично значним (p=0. 0573), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 9 з 10 тварин (90 %) у групі лікування T03 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (p=0. 0011) порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 10 з 10 тварин (100 %) у групі лікування T04 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (p=0. 0001), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 10 з 10 тварин (100 %) у групі лікування T05 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (p=0. 0001), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 7 з 10 тварин (70 %) у групі лікування T06 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (p=0. 0198), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 10 з 10 тварин (100 %) у групі лікування T07 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (p=0. 0001), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 8 з 10 тварин (80 %) у групі лікування T08 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту був статистично значним (p=0. 0055), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 5 з 10 тварин (50 %) у групі лікуванняT09 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту не був статистично значним (p=0. 1409), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. Зрештою, 6 з 10 тварин (60 %) у групі лікуванняT10 були захищені від вірулентного інфікування FeLV; цей рівень захисту не був статистично значним (p=0. 0573), порівняно до кошенят, вакцинованих плацебо. 22 UA 104138 C2 Таблиця 3 Резюме рівню захисту Група лікування T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 5 10 15 20 25 30 35 40 45 відносна ефективність вакцини NA 4. 58 4. 58 26. 32 18. 58 11. 16 4. 77 1. 64 11. 12 Рівень захисту 10 % 60 % 90 % 100 % 100 % 70 % 100 % 80 % 50 % Профілактичне розділення 55. 6 % 88. 9 % 100 % 100 % 66. 7 % 100 % 77. 8 % 44. 4 % Вакцини, що було використано у групах лікування T02, T03, T04, T06 та T07 продемонстрували задовільний рівень безпечності протягом першої вакцинації, так як у цей час ніяких реакцій не було спостережено. Одна тварина у групі лікування T05 продемонструвала негайну реакцію (біль при введенні, слабке застосування голосу та агресивні прояви/спробу втечі) при другій вакцинації. Ця подія більш може бути пов'язана з ускладненою відповіддю на вакцинацію для конкретної тварини, ніж до проблем препарату вакцини. Всі вакцини продемонстрували задовільний рівень безпечності протягом пост-вакцинації, так як ніяких місцевих реакцій або шкідливої дії, пов'язаних з вакцинацією не спостерігалися. Вакцини FeLV, введені до груп лікування T03, T04, T05, T07 та T08 продемонстрували задовільну ефективність, оскільки після інфікування вірулентним FeLV був досягнутий > 80 % захист (> 75 % превентивної частки). Ця вакцина, яку отримала група T07 забезпечила 100 % захист, що було несподівано та неочікуване, так як тварини у цій групі отримали 25 % та 33 % від дози антигену тварин у групах T04 та T05, відповідно. Явною перевагою ад'ювантів, виявлених та перевірених тут є те, що вони дозволяють застосовувати менші дози антигену, в той же час повністю викликаючи захисну імунну відповідь. Вакцини, введені групам лікування T02, T06 та T09 продемонстрували дещо понижену ефективність (< 80 % захист; профілактичне розділення< 75 %) після інфікування вірулентним FeLV. Понижена ефективність вакцини, введеної до групі лікуванняT02 можливо спричинена наявністю тварин зі слабкою відповіддю у цій групі. Приклад 16. Вакцинація у яйце проти Eimeria у курчат. Пташиний кокцидіоз - кишкова хвороба, головним чином спричинена protozoa з роду Eimeria, яка являє серйозну всесвітню проблему для птахівництва. Паразити проковтуються під час годування та локалізуються у кишковому тракті, де вони викликають серйозне пошкодження кишкових та підлеглих тканин. Результатом є дуже істотні економічні втрати у птахівництві, оскільки порушується кормоотдача та збільшення ваги як у бройлерів, так і у несучок. Загальні підсумки стану у цій галузі, у тому числі спроби вакцинації проти Eimeria, наприклад, використання рекомбінантного білку Eimeria у якості антигену та безліч ад'ювантних систем, є описаними у наступних публікаціях, на які є посилання в цьому документі, (1) H. S. Lillehoj et al., J. Parє itol, 91(3), 2005, pp. 666-673; (2) H. S. Lillehoj et al., Avian Diseases, 49 2005, 112-117; and (3) R. A. Dalloul et al., Expert Rev. Vaccines, 5(1), 2006, pp. 143-163. Присутній приклад є спрямованим до використання нових композицій вакцин, що застосовують ад'ювантні компоненти, які забезпечують дуже високу ефективність у контексті кокцидіозу. Високоефективні ад'юванти цього винаходу можуть бути використані у комбінації з антигенним матеріалом всіх видів Eimeria, в тому числі з їх очищеними або частково очищеними екстрактами білків, або з їх одним чи багатьма рекомбінантно експресованими білками, або з фрагментами будь-якого та всіх цих білків, таким чином, щоб включати антигенні матеріали, надані з Eimeria acervulina, Eimeria ahsata, Eimeria bovis, Eimeria brunetti, Eimeria fraterculae, Eimeria maxima, Eimeria meleagridis, Eimeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria stiedae, Eimeria tenella, та Eimeria zurnii, серед інших. Посилена ад'ювантами вакцина винаходу може бути надана проти будь-якого білку або макромолекули, що виробляється на одному чи на декількох етапів життєвого циклу protozoan, що охоплює, без обмежень, ооцист (спорулентний або неспорулентний), спороцист, спорозоїт, шизонт, мерозоїт, чоловічі або жіночі клітини - гамети. У бажаному прикладі, білки, що виводяться з калом у значних кількостях на стадії ооцисту є бажаними речовинами, що 23 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виступають в якості джерела рекомбінантного білкового антигену, або частково або повністю очищені зразки такого білку очищають за допомогою звичайних засобів. Додаткові приклади білків Eimeria, які корисні у якості джерел антигену у препараті даних вакцин охоплюють такі, як описані Karkhanis et al. Infection and Immunity, 1991, pp. 983-989, в тому числі запобіжні антигени, як описано тут, що мають масу у діапазоні приблизно 20-30 кДа. Додаткові приклади охоплюють білок Eimeria 23 кДа 3-1E, та білок Etp100, наприклад, отриманий з E. tenella. Високоефективні ад'юванти цього винаходу можуть бути використані у комбінації з антигенним матеріалом з Neurospora caninum. На додаток, високоефективні ад'юванти цього винаходу можуть бути використані у комбінації з будь-якім з наступних патогенів protozoa, як-то: Cryptosporidium parvum (криптоспорідіоз), Cyclospora cayetanensis (циклоспоріаз), Isospora belli (ізоспоріаз), Toxoplasma gondii (токсоплазмоз), Plasmodium (малярія), Babesia spp. (бабесіоз), та від споріднених protozoa, головним чином групи Apicomplexa, що спричинює ці або споріднені хвороби. Ефективність постачання вакцини, що містить окремі ад'ювантні системи у яйце була оцінена таким чином: Рекомбінантний білок E. maxima (білок 3-1E) був експресований у E. coli та очищений шляхом адсорбційної хроматографії. Зроблене грубе приготування цілих клітинних макромолекул E. maxima (розчинених з детергентом зі зруйнованих клітин), що також були використані у якості антигену(далі іменується як "EM"). У бажаному прикладі, ад'ювант був таким, як описано у Прикладі 8 вище, та був приготований, як це передбачено згідно з протоколом прикладу (див. стор. 41). Отже, у типовому прикладі, кожний ембріон буде отримувати ін'єкцію у амніон (тобто, з включенням амніотичного простору та рідини) приблизно 50-100 мкл розчину вакцини, який містить на кожен свій 1 мл: приблизно 50 або 100 мкг рекомбінантного 3-1E білку, або інші види білку, або, замість того, приблизно 50 або 100 мкг сирого клітинного екстракту "EM"; приблизно 20 мкг Quil A; приблизно 20 мкг холестерину; приблизно 0. 075 об% CARBOPOL; приблизно 10 мкг DDA; та приблизно 250 мкг R1005, все постачається у, наприклад, 20 мМ PBS. У зв'язку з обранням сапоніну для використання тут, наступна додаткова інформація є корисною. Визначений термін "сапонін" стосується рослинних похідних глікозидів, деякі з яких були вивчені задля їх біологічних властивостей (Plant Glycosides, McIlroy, R. J., Edward Arnold та co., London, 1951). Сапоніни, які використовують найбільшою мірою в цій галузі для виробництва вакцини, отримані з рослин Quillaja saponaria molina, Aesculus hippocastanum або Gyophilla struthium. Екстракти кори Quillaja saponaria molina, як відомо, мають ад'ювантну активність, наприклад, Quil A. Також були описані чисті фракції Quil A, які зберігають ад'ювантну активність, але менш токсичні, ніж Quil A, наприклад QS21. QS21 також описаний у Kensil et al. (1991. J. Immunology, vol 146, 431-437). При змішуванні з іншими ад'ювантними інгрідієнтами даного винаходу, як подалі, так і надалі описаними, такі речовини, що містять сапонін стають високоефективними. Додаткові ефективні препарати охоплюють такі, що використовують Ескін, який є описаним у Merck index (12th ed: entry 3737) як суміш сапонінів з насіння кінського каштану. У бажаному втіленні даного винаходу, сапонін стосується "Quil-A", що продається у Сполучених Штатах від E. M Sergeant company. Більш того, треба розуміти, що екстракти сапоніну можуть бути використані як суміші, або очищені індивідуальні компоненти, як-то такі фракції/продукти, що містять QS-7, QS-17, QS-18, та QS-21 від Antigenics Company, Massachusetts, USA, або подібні очищені, фракціоновані, або у сирому вигляді продукти сапоніну, що пропонує Isconova Company of Sweden. У одному втіленні Quil A має чистоту щонайменше 85 %. У інших втіленнях, Quil A є щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або 99 % чистоти. Яйця були придбані у Moyers Hatchery, Quakertown, PA. Для імунізації у яйце, яйця бройлерів були інкубовані 18 діб, перевірені на світло для відбору (при 18-денній ембріонації) родючих яєць, та далі були ін'єцировані 20 мМ PBS та одним з двох ад'ювантів, або ад'ювантом, зробленим з рекомбінантного білку 3-1E або препаратом "EM". Ін'єкції були зроблені на "Intelliject" у ovo ін'єкторі (Avitech, Hebron, MD) відповідно до інструкцій виробника. Кожне яйце отримало 100 мкл у амніотичну порожнину з застосуванням голки 17. 5cм-довжини та 18калібру, отриманою від Avitech (Hebron, MD). 50- мкл дози є також серед тих, які можна застосувати у реалізації даного винаходу. Як тільки курчата – бройлери проклюнулися (приблизно 21-22 доби), вони були перевезені до лабораторії з застосуванням одноразових картонів для перевезення курчат (Frederick Packaging, Inc., Milwaukee, WI) та далі вони були розміщені у спеціальних поміщеннях (Petersime units) та забезпечені їжею та водою без обмежень. 24 UA 104138 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Птахи зберігалися у секціях брудера у середовищі, вільному від Eimeria та далі були переведені у великі висячі клітини у окремих місцях, де вони були інфіковані живими ooцитами Eimeria maxima та зберігалися там до кінця експериментального періоду. У дослідженнях було використано USDA BARC, штам Eimeria maxima #41, який зберігався у Animal Parasitic Diseases Laboratory-BARC та був розмножений відповідно встановленій процедурі у лабораторії Dr. Lillehoj's. Тільки-но вироблені ооцити з штаму E. maxima (Beltsville #41) були очищені флотацією у 5 % натрію гіпохлориті, тричі промиті PBS, та життєздатність була перерахована трипановим синім з застосуванням гемоцитометру. Птахам у віці сім діб були зроблені мітки на крилах та птахи всіх експериментальних груп за виключенням неінфікованої контрольної групи були щеплені у стравохід E. maxima з застосуванням голки для щеплення, та були далі розміщені у клітинах для збирання ооцитів. Масу тіла кожної птахи було визначено у 0 добу (неінфікованої), та у 6 та 10 добу після інфекції E. maxima. Доглядачі тварин були інструктовані не прибирати клітки, та фекалії були зібрані. Лотки для збирання були розміщені під кожною клітиною на 5 діб, починаючи з шостої доби після інфекції, та фекальні речовини були зібрані у великі пластикові банки (2 л). Фекалії були занурені у водопровідну воду у кожній банці та далі були подрібнені у блендері з більшою кількістю води (загальним обсягом 3 л), та дві 40 мл випадкові проби були відібрані з кожної проби та зберігалася у холодильнику, доки вони не були підраховані. Для підрахування ооцитів кокцидії, спочатку були зроблені різні розведення для визначення оптимального розведення для перерахування ооцистів для кожного зразка. Ооцисти були підраховані під мікроскопом з застосуванням лічильної камери McMaster з використанням способу флотації цукрози, що був розроблений у лабораторії Dr Lillehoj's. Загальна кількість випорожнених ооцистів на курча було обчислено з застосуванням формули: загальні ооцисти/птицю = (підраховані ооцисти x фактор розведення x обсяг фекальної проби/обсяг лічильної камери)/кількість птахів у клітці. Кров була зібрана на шосту добу після дати інфекції, та була визначена відповідь сироваткових антитіл. Проби крові були отримані з окремих птахів (N=4-5/групу), давали згорнутися 4 год. при 4 °C, та було зібрано сироватку. Проби сироватки були перевірені на антіEimeria антитіла з застосуванням ELISA. Стисло кажучи, на титраційні мікропланшети були нанесені протягом ночі 10мкг/лунку рекомбінантних кокцидійних антигенів Ea3-1E, EtMIF або EtMIC2, промитих PBS-0. 05 % Tween, та блокованих PBS-1 % BSA. Далі були додані розведення сироватки (1:20, 1:40, 1:80, 1:160; 100 мкл/лунку), все було інкубовано з безперервним м'яким струшуванням, промито, та зв'язані антитіла були виявлені сполученим з пероксидазою кролячим анти-курячим IgG (Siгa) та специфічним до пероксидази субстратом. Оптична густина(OD) була визначена при 450 нм читачем мікропланшетів (Bio-Rad, Richmond, CA). Тканини кишечнику були зібрані у виводку на 6 та 10 добу відповідно, та перевірені на продукування цитокіну (IFN-γ, IL-2) з застосуванням RT-PCR у реальному часі для вимірювання Th1 стимуляції. Загальна РНК була отримана з кишкової IELs з застосуванням TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). П'ять мкг РНК були оброблені 1. 0 U ДНКази I та 1. 0 мкл 10X реакційного буферу (Siгa), та інкубовані 15 хв. при кімнатній температурі, 1. 0 мкл стоп-розчину було додано до інактивованої ДНКази I, та суміш була нагріта при 70ºC 10 хвилин. РНК була зворотно-транскрибована з застосуванням системи для синтезу першого ланцюгу StrataScript (Stratagene, La Jolla, CA) відповідно до рекомендацій виробника. Кількісні RT-PCR праймери олігонуклеотидів для інтерферон-γ (IFN-γ) курчат та GAPDH контроль перелічені у Таблиці 4. Були проведені ампліфікація та визначення з застосуванням еквівалентної кількості загальної РНК з кишкової IELs з застосуванням системи Mx3000P та Brilliant SYBR Green QPCR master mix (Stratagene). Стандартні криві були зроблені з застосуванням log10 розведеної стандартної РНК та рівні індивідуальних транскриптів були нормалізовані GAPDH та проаналізовані за допомогою програми Q-gene. Кожен аналіз був зроблений тричі. Для нормалізації рівнів РНК між пробами у межах експерименту, були обчислені обсяги середнього порогу циклу (Ct) для продуктів ампліфікації шляхом об'єднання значень з усіх зразків у цьому експерименті.. 25 UA 104138 C2 Таблиця 4 Олігонуклеотидні праймери, що були використані для кількісної RT-PCR IFN-γ курчат та GAPDH РНК ціль GAPDH Передня Зворотна IFN-γ Передня Зворотна IL-1β Передня Зворотна IL-15 Передня Зворотна 5 10 15 20 25 30 35 40 Праймерні послідовності Зразок No. K01458 5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT-3′ 5′-ACCTCTGTCATCTCTCCACA-3′ Зразок No. Y07922 5′-GCTGACGGTGGACCTATTATT-3′ 5’-GGCTTTGCGCTGGATTC-3’ Зразок No. Y15006 5′-TGGGCATCAAGGGCTACA-3′ 5′-TCGGGTTGGTTGGTGATG-3′ Зразок No. AF139097 5′-TCTGTTCTTCTGTTCTGAGTGATG-3′ 5′-AGTGATTTGCTTCTGTCTTTGGTA-3′ Розмір PCR продукту (пар основ) 264 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 259 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 244 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 243 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 Селезінку було зібрано перед щепленням E. maxima та на десяту DPI (доба після інфекції) для аналізу проліферації спленоцитів. Селезінки були розміщені у чашках Петрі з 10 мл збалансованого фізіологічного розчину Ханка (HBSS), доповненого 100 U/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину (Siгa, St. Louє, MO). Суспензії одиничних клітин лімфоцитів селезінки були приготовані та була проведена проліферація лімфоцитів. Стисло кажучи, спленоцити були 6 7 відрегульовані до 5 × 10 або 1×10 клітин/мл у середі IMDM (Siгa), що була доповнена 10 % бичачої ембриональної сироватки (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 U/мл пеніциліну, та 100 мкг/мл стрептоміцину (Siгa), яка далі буде називатися 10 % доповненою IMDM середою. Спленоцити (100 мкл/лунку) були інкубовані у 96-луночні планшети з плоским дном при 41 °C у вологому інкубаторі (Forma, Marietta, OH)з 5 % CO2 та 95 % повітря на 48 годин. Клітинна проліферація була визначена 2-(2-метокси-4-нітрофеніл)-3-(4-нітрофеніл)-5-(2, 4® дісульфофеніл)-2H-тетразолій, мононатрієвою сіллю (WST-8, Cell-Counting Kit-8 , Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD). Оптична густина (OD) був поміряна при 450 нм з застосуванням мікропланшетного спектрофотометру(BioRad, Richmond, CA). Результати показали, що птахи-бройлери, вакциновані 100 мкл ад'ювантного препарату (тобто 100 мкл, що містить рекомбінантний 3-1E білок відповідно до раніше визначених доз) отримали приблизно 45-85 грам додаткової маси тіла порівняно до птахів, не вакцинованих, але інфікованих E. maxima. Вакцини винаходу також показали чіткі прояви клітинно-опосередкованого імунітету, який був виміряний мітогенними аналізами проліферації лімфоцитів: Результати проліферації 7 лімфоцитів селезінки при 1×10 клітин/мл, інкубованих із Con A 48 годин показали, що спленоцити з E. maxima-інфікованих курчат, імунізованих ад'ювантом Pfizer з антигеном або без антигену взагалі показують вищі рівні проліферації лімфоцитів, особливо коли була використана 50 мкг доза. Істотне збільшення виробництва IL-1B, IFN-γ, та IL-15, в особливості у селезінці було помічено після введення ад'ювантних вакцинних композицій винаходу. Таким чином, ці результати ясно показують вплив даного ад'юванту на цитокінову відповідь та підтримку його дії на підсилення клітинно-опосередкованої, а не гуморальної імунної відповіді. Вакцини винаходу також показали чіткий вплив на фекальний вихід ооцистів. У неінфікованих контрольних птахів не була відмічена наявність будь-яких ооцистів. Після інфекції E. maxima, були істотні скорочення виходу фекальних ооцистів у групах, які були оброблені тільки ад'ювантами Pfizer. Птахи, вакциновані у яйце необробленими Eimeria maxima та ад'ювантом продемонстрували набагато меншій вихід фекальних ооцистів порівняно до груп, щеплених тільки препаратом необробленій Eimeria maxima(EM груп). Слід зауважити, що, хоча очищений рекомбінантний білок 3-1E E. maxima використовується у практиці вищеозначених експериментів, використання рекомбінантних Ea3-1E, EaMIF, та EtMIC2 антигенів, або сингулярно, або у комбінації з 3-1E, або одного з іншім, або у будь-якій комбінації будь-якого з них, є також бажаним втіленням винаходу, та головним чином всі білкові антигени Eimeria є діючими у практичному використанні даного винаходу, до того часу, як вони будуть змішані з ад'ювантами даного винаходу. 26 UA 104138 C2 5 10 15 Приклад 17. Оцінка штаму J5 бактерину Escherichia coli у великої рогатої худоби. Метою досліджень є оцінка імунологічної відповіді у великої рогатої худоби до антигену Escherichia coli (J-5 штам) при введенні у різних нових препаратах. Комерційний J5 бактерин є у продажу як превентивна вакцина проти кишкового маститу у молочній великій рогатій худоби та є помірно ефективним у даному препараті. Перед вакцинацією, тварини, як було визначено, мали низький титр антитіл до E. coli J5, відповідно до аналізів зразків сироватки крові, відібраних перед вакцинацією. Експериментальні вакцини були зроблені з застосуванням інактивованого E. coli J5 бактерину у якості антигену, та були зроблені відповідно до Прикладу 13 вище. Кожна групі лікування спочатку містила сім тварин (Таблиця 5). Одній групі лікування давали фізіологічний розчин (T01) та іншій групі дали комерційну вакцину J5 (T02-Enviracor™ Pfizer J-5 Escherichia coli бактерин). Інші групи лікування отримали різні препарати, які містили ад'юванти, визначені у Таблиці 5. Всі вакцинації були введені шляхом підшкірної ін'єкції у 0 та 21 добу досліджень. Обсяг дозування був 5 мл. Таблиця 5 Групи вакцини – корови Tmt група T01 25 30 35 40 7 T02 T03 T04 T05 T06 20 # тварини 7 7 7 7 7 Доба Дозування (мл) Шлях введення Фізіологічний розчин 0, 21 5.0 ПШ Escherichia coli бактерин, J-5 штам QCDCR QCDO QCDX QCDXO 0, 21 0, 21 0, 21 0, 21 0, 21 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 ПШ ПШ ПШ ПШ ПШ Лікування У Таблиці 5, QC-QuilA/холестерин, D-DDA, C - Сarbopol, R-R1005, X-DEAE-декстран та O - олія. Базові розчини були приготовані, як у Прикладах 1-13 вище для наступного: E. coli було 9 додано у концентрації приблизно 4-5 × 10 организмів на дозу, що було визначено прямим рахуванням на світловому мікроскопі. Quil A у воді дорівнював 50 мг/мл, холестерин у етанолі 17 мг/мл, DDA у етанолі - 17 мг/мл, R1005 у 20 мМ фосфатному буфері - 5 мг/мл, DEAEдекстран у воді - 200 мг/мл, TLR-агоніст у TE буфері - 20 мг/мл та ISCOMatrix у воді - 5. 4 мг/мл. Індивідуальні компоненти були додані з співвідношенням за об'ємом у в порядку літерних символів зліва направо. Наприклад, QCDC означає, що до відповідного обсягу Quil A було спочатку додано холестерин, далі DDA та зрештою Сarbopol. Коли препарати містили олію, окремі компоненти були додані змішуванням та далі була зроблена емульсія у суміші мінеральної олії Drakeol® 5 LT з або Span 80 та Tween 80 (QCDO) або Span 85 та Tween 85 (QCDXO). Drakeol® є комерційно доступною легкою мінеральною олією. Проби крові були зібрані у 0, 21 та 49 добу досліджень для серологічного аналізу. Титри антитіл до E. coli J5 у пробах сироватки були визначені за допомогою J5-специфічного, непрямого ELISA аналізу. Ізотипи антитіл IgG були визначені баранячими-анти-бичачими кон'югатами антитіл (Bethyl Labs). Титри були визначені та показані у вигляді їх геометричних середніх значень. Серологічні результати досліджень наведені у Таблицях 6-8. Високі титри антитіл головним чином пов'язані з кращим захистом вакцин. Загальний J5-специфічний титр IgG наведений у Таблиці 6. Деякі з препаратів цього винаходу створюють титри значно вищі, ніж у комерційного продукту, навіть якщо ці препарати мали подібну кількість доданого J5 антигену. Препарати QCDO, QCDX, та QCDXO були особливо ефективними у створенні значної імунної відповіді у цієї великої рогатої худоби. 27 UA 104138 C2 Таблиця 6 Титри IgG антитіл Tmt група T01 T02 T03 T04 T05 T06 5 Лікування Фізіологічний розчин Escherichia coli бактерин QCDCR QCDO QCDX QCDXO Геометричний середній титр IgG до J5 у добу 0 21 48 1573 3135 2795 1402 7011 55524 1573 13975 49494 1764 62289 391951 993 22135 110672 2221 69877 620779 Ізотипи J5-специфічних IgG1 антитіл були визначені. Ці результати наведені у Таблиці 7. Знову, QCDO, QCDX, та QCDXO препарати були особливо ефективними у створенні значної імунної відповіді у цієї великої рогатої худоби. Ці препарати дали більш вищі титри з навіть одиничною вакцинацією, ніж комерційні вакцини, що вводилися двома ін'єкціями. Таблиця 7 Титри IgG1 антитіл Tmt група T01 T02 T03 T04 T05 T06 10 Лікування Фізіологічний розчин Escherichia coli бактерин QCDCR QCDO QCDX QCDXO Геометричний середній титр IgG до J5 у добу 0 21 48 1250 1250 627 1114 11105 22135 1250 12458 22135 1980 31250 139281 789 35057 62289 1573 247472 439702 Титри антитіл IgG2 наведені у Таблиці 8. Цей ізотип антитіл є часто пов'язаний з кращим фагоцитозом нейтрофілами у молоці та захистом для тварин. Препарати QCDO, QCDX, та QCDXO були особливо ефективними у створенні значної імунної відповіді у цієї великої рогатої худоби. Таблиця 8 Титри IgG2 атитіл Tmt група T01 T02 T03 T04 T05 T06 15 20 Лікування Фізіологічний розчин Escherichia coli бактерин QCDCR QCDO QCDX QCDXO Геометричний середній титр IgG2 до J5 у добу 0 21 48 199 396 396 280 855 3136 1114 1402 4966 558 1573 6250 176 3947 9899 559 8824 87940 Експериментальні вакцини були приготовані з застосуванням інактивованого бактерину E. coli J5 як антигену, та були зроблені відповідно до Прикладу 13 вище. Кожна група лікування спочатку містила сім тварин. (Таблиця 9). Одна група лікування отримала фізіологічний розчин (T01) та інші групи отримали комерційну вакцину J5 (T02-Enviracor™ Pfizer J-5 Escherichia coli бактерин). Інші груп лікування отримали різні препарати, які містили ад'юванти, що визначені у Таблиці 9. Всі вакцинації були введені шляхом підшкірної ін'єкції у 0 та 21 добу досліджень. Обсяг дозування був 5 мл. 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюNovel adjuvant compositions
Автори англійськоюBagi, Cedo Martin, Childers, Tedd Alan, Dominowski, Paul Joseph, Krebs, Richard, Lee, Mannan, Ramasamy Mannar, Olsen, Mary Kathryn, Thompson, James Richard, Weeratna, Risini Dhammika, Yancey, Robert John, Jr., Zhang, Shucheng
Автори російськоюДоминовски Пол Джозеф, Кребс Ричард Ли, Маннан Рамасами Маннар
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/39, A61K 39/12, A61P 31/12
Мітки: ад'ювантні, композиції, нові
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/55-104138-novi-adyuvantni-kompozici.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Нові ад’ювантні композиції</a>
Нові офтальмологічні композиції
Номер патенту: 100393
Опубліковано: 25.12.2012
Автори: Халдер Аріндам, Кхопаде Аджай Джайсінгх, Бховмік Субхас Баларам
МПК: A61K 31/5575, A61P 27/00, A61K 31/25
Мітки: композиції, нові, офтальмологічні
Формула / Реферат:
1. Фармацевтична композиція, призначена для офтальмологічного застосування, що включає одну або більше похідних простагландину або його солі, поліетиленглікольгідроксистеарат у кількості від приблизно 0,001 % до приблизно 3,0 % об'ємної ваги і фармацевтично прийнятний носій.2. Фармацевтична композиція за п. 1, де поліетиленглікольгідроксистеарат містить полігліколевий складний ефір 12-гідроксистеаринової кислоти як гідрофобний...
Нові композиції вакцин
Номер патенту: 94404
Опубліковано: 10.05.2011
Автори: Десгуйе-Блеше Стефані Марі-Катрін, Шарер Катрін, Парізо Алексіс Гі Андре, Руле Клод Жан Марі
МПК: A61K 39/12, A61K 9/113, A61K 39/02
Мітки: вакцин, композиції, нові
Формула / Реферат:
1. Імуногенна композиція, що є емульсією типу "масло-у-воді" (0/W), включає:(1) водний розчин, що містить антиген або імуноген, здатний індукувати імунну відповідь у хазяїні;(2) неіоногенний ліпофільний етоксилований С9-С22 спирт жирного ряду, етоксилований 1-4 ЕО;(3) мінеральне масло, що містить лінійний або розгалужений вуглецевий ланцюг, що містить від 15 до 32 атомів вуглецю;(4) неіоногенна...
Нові вакцинні композиції, що містять емульсію типу “масло у воді”
Номер патенту: 84024
Опубліковано: 10.09.2008
Автори: Нордгрен Роберт М., Парізо Алексіс Гі Андре, Де-Гуйє-Блеше Стефані Марі-Катрін, Шарер Катрін
МПК: A61P 31/00, A61K 9/107, A61P 11/00, A61K 39/39
Мітки: типу, вакцинні, нові, води, емульсію, масло, композиції, містять
Формула / Реферат:
1. Вакцинна композиція, що включає емульсію для ін'єкцій типу "масло у воді"(М/В), яка включає:(і) водний розчин, який містить щонайменше один імуноген;(іі) мінеральне масло;(ііі) неіонний ліпофільний детергент;(iv) неіонний гідрофільний детергент із високим значенням гідрофільно-ліпофільного балансу (HLB) більшим за 13 і меншим за 40; і(v) неіонний гідрофільний детергент із низьким значенням...
Нові фторалкілзаміщені циклотрисилоксани (варіанти), їх використання для одержання нових полімерів та нові полімери
Номер патенту: 73958
Опубліковано: 17.10.2005
Автори: Вебер Уілльям П., Пауласаарі Йорі Калеві
МПК: C07F 7/21, C08G 77/00
Мітки: нових, полімери, варіанти, полімерів, одержання, фторалкілзаміщені, використання, циклотрисилоксани, нові
Формула / Реферат:
1. Фторалкілзаміщений циклотрисилоксан, який описується формулою (Ia):, (Ia)де R являє собою нижчий алкіл, який містить від 1 до 4 атомів вуглецю, a Rf описується формулою (CH2)2-(CR'2)n-CR'3, де всі або деякі замісники R' являють собою F, причому замісники R', що залишилися, являють собою Н, а n являє собою ціле число, яке змінюється у діапазоні від 0 до...
Пінотвірні композиції з високим вмістом спирту з сурфактантами на основі силіконів, концентрат композиції, способи утворення та дозування піни із застосуванням композиції, негерметизований дозатор, спосіб утвор
Номер патенту: 89077
Опубліковано: 25.12.2009
Автори: Фернандес де Кастро Марія Тереза, Койвісто Брюс Майкл, Муньос Франсіско
МПК: A01N 31/02, A01N 25/16, C11D 17/00, A01N 55/10, C11D 3/48
Мітки: вмістом, способи, дозування, основі, дозатор, піни, концентрат, спосіб, пінотвірні, негерметизований, високим, утвор, композиції, сурфактантами, спирту, силіконів, утворення, застосуванням
Формула / Реферат:
1. Здатна до утворення піни спиртовмісна композиція, яка містить:a) С1-4 спирт або його суміші у кількості більше 40 об. % усієї композиції;b) засіб піноутворення, що містить ефективний фізіологічно прийнятний сурфактант, що містить ліпофільний ланцюг на основі силіконових сполук, для змочування та піноутворення, у кількості принаймні 0,01 мас. % усієї композиції, де вказаний засіб піноутворення вибраний так, щоб при дозуванні...
Попередній патент: Піридилвмісні інгібітори передачі сигналу через білок hedgehog
Наступний патент: Пристрій для прискорення росту і відновлення газону
Випадковий патент: Hегорюча hеhьютоhівська мастильhа рідиhа