Відновлення і регенерація ниркової тканини з використанням клітин, одержаних з людської тканини пупкового канатика

Реферат: Винахід стосується способу лікування пацієнта, що має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки, що включає введення клітин, одержаних з людської тканини пупкового канатика, або введення фармацевтичної композиції, яка містить такі клітини або одержана з таких клітин. UA 99152 C2 (12) UA 99152 C2 UA 99152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка вимагає пріоритет заявки на патент США № 60/977775, поданої 5 жовтня 2007 г, зміст якої повністю включений в даний опис шляхом посилання. Винахід загалом стосується галузі терапевтичних засобів на клітинній основі. Конкретніше, винахід стосується застосування клітин, одержаних з пупкового канатика, для відновлення і регенерації уражених захворюванням або пошкоджених нирок. По всьому опису наводяться посилання на різні публікації, включаючи патенти, опубліковані заявки, технічні статті і наукові статті. Кожна з цих наведених як посилання публікацій повністю і за всіма призначеннями включена в даний опис шляхом посилання. Захворювання нирок являють собою важкі, не завжди виліковні медичні стани, пов'язані в США з щорічними витратами, що перевищують 27 мільярдів доларів. На даний час, більше ніж у 40 мільйонів американців є ниркове захворювання або ризик його розвитку, і захворюваність зростає з швидкістю 6 % на рік, що непокоїть. Тому, за оцінками, до 2020 р. один з чотирьох людей буде страждати на ниркові захворювання в кінцевій стадії (ESRD). Для розв'язання цих економічних і медичних проблем, необхідні нові, трансформаційні технології в лікуванні і гострої ниркової недостатності (ARF), і хронічних ниркових захворювань (CKD). Гостра ниркова недостатність, що також має назву гострий канальцевий некроз, являє собою синдром, що часто зустрічається, який уражує до 7 % всіх госпіталізованих пацієнтів (Kelly et а (2000) Semin. Nephrol. 1: 4-19). ARF являє собою раптову втрату здатності нирок виділяти продукти метаболізму, концентрувати сечу і зберігати електроліти. ARF частіше за все виникає після того як індивідуум піддається впливу нефротоксичних агентів або після явища ішемії-реперфузії. Інші причини включають інфекцію, обструкцію сечовивідних шляхів і деякі патологічні стани крові і аутоімунні розлади. Ці патологічні впливи викликають пошкодження функціонального компонента нирок, нефрону. Конкретніше, розвивається некроз клітин проксимального відділу ниркових канальців. Потім клітини канальців відділяються від основної мембрани канальців, закупорюючи просвіт канальців. Ця обструкція веде до збільшення внутрішньоканальцевого тиску, викликаючи витік фільтрату з нефрону в оточуючу ниркову паренхіму. Зниження функції нефрону і накопичення фільтрату в нирковій тканині веде до зниження швидкості клубочкової фільтрації і, зрештою, викликає ниркову недостатність. Хоч ARF являє собою важкий розлад, що загрожує життю, вона оборотна. Було запропоновано декілька способів лікування, націлених на зниження або усунення ARF. Найбільш значним досягненням є часто використовувані досконалі методики гемодіалізу. Проте, смертність серед пацієнтів з ARF, що одержують лікування гемодіалізом, ще залишається на рівні 30-80 %, вказуючи на те, що гемодіаліз має невелику терапевтичну цінність в лікуванні ARF (Morigi et al. (2004) J. Am. Soc. Nephrol. 15: 1794-804). Крім того, способи лікування на основі введення фармакологічних засобів, таких як допамін, фуросемід, маніт або передсердний натрійуретичний пептид, виявилися неспроможними при клінічних дослідженнях (Haug et al. (1993) Transplantation 55:766-772; Lieberthal and Nigam (2000) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278: F1-F12). Ці дані свідчать про те, що традиційна стратегія розробки лікування з приводу ARF є неадекватною і що необхідне здійснення нового, обгрунтованого підходу до її лікування. Відновлення ниркової функції після ARF залежить від заміщення некротичних канальцевих клітин функціональним канальцевим епітелієм. Після пошкодження, канальці здатні до самостійного відновлення, утворюючи нові клітини проксимального відділу канальців, для заміщення клітин з функціональною недостатністю, що розвивається, або некротичних клітин. Походження клітин-попередників, з яких розвиваються канальцеві клітини, невідоме. Однак можливо, що регенерація канальців відбувається відповідно до описаного механізму прискорення регенерації систем органів стовбуровими клітинами/клітинами, ампліфікуючими проходження. Нещодавні дослідження продемонстрували, що одержані з кісткового мозку мезенхімальні стовбурові клітини (MSC) є ренотропними і допомагають відновленню нирок після ARF, викликаної лікарськими засобами і ішемією (Morigi et al. 2004). Нещодавно було також показано, 6 що інтракаротидне введення 1×10 MSC кожному щуру з пошкодженням нирок, викликаним ішемією/реперфузією, привело до значно поліпшеної ниркової функції (Togel et al. (2005) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 289(1): F31-42). Крім того, було показано, що захисні ефекти MSC були незалежні від диференціації стовбурових клітин, але швидше були результатом секреції трофічних факторів, що захищають нирки. На відміну від ARF, хронічне ниркове захворювання (CKD) являє собою поступову і прогресуючу втрату ниркової функції. Воно загалом необоротне і, зрештою, веде до ниркового захворювання в кінцевій стадії. В США CKD стає захворюванням, яке все більш часто зустрічається, і воно пов'язане з несприятливими медичними результатами і великими 1 UA 99152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 медичними витратами. За оцінками Національного Ниркового Фонду, 20 мільйонів американців страждають на CKD і щонайменше ще у 20 мільйонів людей є ризик розвитку CKD. За відсутності лікування, CKD може привести до значної частоти ускладнень і смертності від анемії, електролітного дисбалансу, кісткових захворювань, серцево-судинних захворювань і ниркової недостатності. Прогресуюче ниркове захворювання розвивається в результаті комбінації первинного патологічного пошкодження (наприклад, гіпертензії) з подальшою порушеною адаптивною нирковою реакцією на це пошкодження. Така реакція включає продукцію прозапальних і профібротичних цитокінів і ростових факторів. Тому, одна стратегія уповільнення прогресування CKD полягає в полегшенні запальної і фібротичної реакції, а також відновленні або усуненні існуючого пошкодження нирок. Було показано, що введення ростових факторів може уповільнити прогресування CKD. Наприклад, кістковий морфогенний білок-7 (BMP-7) запобігав атрофії канальців, інтерстиціальному запаленню і фіброзу у щурів з односторонньою обструкцією сечоводу. Аналогічним чином, введення BMP-7 знижувало канальцевоінтерстиціальний фіброз і гломерулосклероз на мишачій моделі MRL lpr/lpr вовчакового нефриту. Крім того, було показано, що ростовий фактор гепатоцитів має потужну протизапальну і антифібротичну ефективність на широкій різноманітності експериментальних моделей пошкодження нирок. Інші фактори, які виявилися терапевтично перспективними, включають трансформуючий фактор росту-β1, судинний ендотеліальний ростовий фактор (VEGF), ростовий фактор-2 сполучної тканини, ростовий фактор-2 фібробластів (FGF-2), інтерлейкіни, фактор пухлинного некрозу і моноцитарний хемотаксичний білок-1. Всі ці дослідження демонструють, що введення ростових факторів являє собою перспективний терапевтичний підхід для профілактичного лікування CKD. Незважаючи на існуючі варіанти медичного лікування, рівні смертності залишаються дуже високими і росте кількість ниркових захворювань. Тому, існує необхідність в даній галузі у вдосконаленому, потенційно радикальному лікуванні. На даний час, лікувальні втручання не проводяться зі спробою зупинити або навіть викликати зворотний розвиток прогресування ниркового захворювання. Даний винахід надає способи лікування, які мають велику перспективу в плані захисту нирок і сприяють ендогенній нирковій регенерації, заміщенню некротичних ниркових клітин і, зрештою, запобіганню ESRD. Відповідно до одного аспекту, винахід надає способи лікування пацієнта, який має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки. Наприклад, пошкодження нирки може бути викликане віком, травмою, впливом токсину, впливом лікарського засобу, впливом випромінювання, окисленням, осадженням імунних комплексів або відторгненням трансплантата. Спосіб включають введення пацієнту клітин, одержаних з тканини пупкового канатика, в кількості, ефективній для лікування захворювання або пошкодження. Тканина пупкового канатика, з якої одержані клітини, переважно по суті не містить крові. Клітини, одержані з тканини пупкового канатика, переважно здатні до самооновлення і розмноження в культурі і здатні диференціюватися, наприклад, в нирковий фенотип; вимагають L-валін для росту; можуть рости щонайменше в 5 % кисні; не продукують CD117 або HLA-DR; експресують альфа-гладком'язовий актин і експресують, відносно людських фібробластів, мезенхімальних стовбурових клітин або клітин кісткового мозку гребеня клубової кістки, підвищені рівні інтерлейкіну 8 або ретикулону 1. В деяких варіантах здійснення, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, експресують рецептор 1 окисленого ліпопротеїну низької густини, ретикулону, ліганд 3 рецептора хемокіну і/або гранулоцитарний хемотаксичний білок 2. В переважних аспектах, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, експресують CD10, CD13, CD44, CD73 і CD90. У деяких варіантах здійснення, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, індукуються in vitro для диференціації в клітини ниркової лінії диференціювання перед введенням пацієнту. Клітини, одержані з тканини пупкового канатика, можуть бути піддані маніпуляціям генної інженерії для експресії генного продукту, який сприяє відновленню і/або регенерації ниркової тканини. У деяких варіантах здійснення, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, вводяться щонайменше з одним іншим типом клітин, таким як, але без обмеження, епітеліальна клітина проксимального відділу канальця, епітеліальна клітина петлі Генле, клітина дистального відділу канальця, клітина збиральної протоки, клубочкова парієтальна клітина, клубочковий подоцит, мезангіальна клітина, судинна ендотеліальна клітина, інтерстиціальна клітина або інша мультипотентна або плюрипотентна стовбурова клітина. Цей щонайменше один тип клітин може вводитися одночасно або до, або після клітин, одержаних з тканини пупкового канатика. У деяких аспектах винаходу, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, вводяться щонайменше з одним засобом. Засіб може вводитися одночасно або до, або після клітин, одержаних з тканини пупкового канатика. У деяких 2 UA 99152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважних аспектах винаходу, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, надають трофічний ефект на нирки пацієнта. Відповідно до деяких аспектів винаходу, клітини можуть вводитися ін'єкцією або вливанням. У деяких варіантах здійснення, клітини вводяться інкапсульованими всередину імплантованого пристрою. У деяких варіантах здійснення, клітини вводяться імплантацією пристрою, що містить клітини. Відповідно до іншого аспекту, винахід надає способи лікування пацієнта, який має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки, введенням пацієнту композиції, яка містить розчинну клітинну фракцію, лізат, позаклітинну матрицю або кондиціоноване середовище, одержане з клітин, одержаних з тканини пупкового канатика, де тканина пупкового канатика по суті не містить крові і де клітини здатні до самооновлення і розмноження в культурі і мають потенціал диференціації; вимагають L-валін для росту; можуть рости щонайменше в 5 % кисні; не продукують CD117 або HLA-DR; експресують альфа-гладком'язовий актин і експресують, відносно людських фібробластів, мезенхімальних стовбурових клітин або клітин кісткового мозку гребеня клубової кістки, підвищені рівні інтерлейкіну 8 або ретикулону 1. Відповідно до іншого аспекту, даний винахід надає фармацевтичні композиції для лікування пацієнта, який має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки, причому композиції містять фармацевтично прийнятний носій і клітини, одержані з тканини пупкового канатика, в кількості, ефективній для лікування захворювання або пошкодження, де тканина пупкового канатика по суті не містить крові і де клітини здатні до самооновлення і розмноження в культурі і мають потенціал диференціації; вимагають L-валін для росту; можуть рости щонайменше в 5 % кисні; не продукують CD117 або HLA-DR; експресують альфагладком'язовий актин і експресують, відносно людських фібробластів, мезенхімальних стовбурових клітин або клітин кісткового мозку гребеня клубової кістки, підвищені рівні інтерлейкіну 8 або ретикулону 1. В деяких варіантах здійснення, пошкодження нирок може бути викликане віком, травмою, впливом токсину, впливом лікарського засобу, впливом випромінювання, окисленням, осадженням імунних комплексів або відторгненням трансплантата. У деяких варіантах здійснення, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, індукуються in vitro для диференціації в клітини ниркової лінії диференціювання перед включенням до складу композиції. У деяких варіантах здійснення, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, піддаються маніпуляціям генної інженерії для експресії генного продукту, який сприяє відновленню і/або регенерації ниркової тканини. У деяких варіантах здійснення, фармацевтична композиція включає щонайменше один інший тип клітин. Цей щонайменше один інший тип може являти собою, без обмеження, епітеліальну клітину проксимального відділу канальця, епітеліальну клітину петлі Генле, клітину дистального відділу канальця, клітину збиральної протоки, клубочкову парієтальну клітину, клубочковий подоцит, мезангіальну клітину, судинну ендотеліальну клітину, інтерстиціальну клітину або іншу мультипотентну або плюрипотентну стовбурову клітину. У деяких переважних варіантах здійснення, фармацевтична композиція, додатково, включає щонайменше дин засіб. У деяких переважних варіантах здійснення, фармацевтична композиція складається для введення ін'єкцією або вливанням. У деяких переважних варіантах здійснення фармацевтичної композиції за винаходом, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, інкапсульовані всередину імплантованого пристрою. У деяких варіантах здійснення фармацевтичної композиції за винаходом, клітини висіваються на матрицю. Відповідно до іншого аспекту, даний винахід надає фармацевтичні композиції для лікування пацієнта, що має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки, які містять фармацевтично прийнятний носій і лізат, позаклітинну матрицю або кондиціоноване середовище, одержане з клітин, одержаних з тканини пупкового канатика, де тканина пупкового канатика по суті не містить крові і де клітини здатні до самооновлення і розмноження в культурі і мають потенціал диференціації; вимагають L-валін для росту; можуть рости щонайменше в 5 % кисні; не продукують CD117 або HLA-DR; експресують альфа-гладком'язовий актин і експресують, відносно людських фібробластів, мезенхімальних стовбурових клітин або клітин кісткового мозку гребеня клубової кістки, підвищені рівні інтерлейкіну 8 або ретикулону 1. Відповідно до іншого аспекту, винахід надає набори для лікування пацієнта, що має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки, які містять фармацевтично прийнятний носій, клітини, одержані з тканини пупкового канатика, в кількості, ефективній для лікування захворювання або пошкодження, де тканина пупкового канатика по суті не містить крові і де клітини здатні до самооновлення і розмноження в культурі і мають потенціал диференціації; вимагають L-валін для росту; можуть рости щонайменше в 5 % кисні; не продукують CD117 або HLA-DR; експресують альфа-гладком'язовий актин і експресують, відносно людських фібробластів, мезенхімальних стовбурових клітин або клітин кісткового 3 UA 99152 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мозку гребеня клубової кістки, підвищені рівні інтерлейкіну 8 або ретикулону 1, і інструкції по використанню набору в способі лікування пацієнта, що має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки. У деяких варіантах здійснення, набір включає щонайменше один реагент і інструкції по культивуванню клітин. У деяких варіантах здійснення, набір включає популяцію щонайменше одного іншого типу клітин. У деяких варіантах здійснення, набір включає щонайменше один засіб. Даний винахід також надає набори для лікування пацієнта, що має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки, які містять фармацевтично прийнятний носій, лізат, позаклітинну матрицю або кондиціоноване середовище, одержане з клітин, одержаних з тканини пупкового канатика, де тканина пупкового канатика по суті не містить крові і де клітини здатні до самооновлення і розмноження в культурі і мають потенціал диференціації; вимагають L-валін для росту; можуть рости щонайменше в 5 % кисні; не продукують CD117 або HLA-DR; експресують альфа-гладком'язовий актин і експресують, відносно людських фібробластів, мезенхімальних стовбурових клітин або клітин кісткового мозку гребеня клубової кістки, підвищені рівні інтерлейкіну 8 або ретикулону 1, і інструкції по використанню компонентів набору в способі лікування пацієнта, що має захворювання або пошкодження щонайменше однієї нирки. Вказані вище і інші ознаки і переваги винаходу будуть очевидні з подальшого більш конкретного опису переважних варіантів здійснення, як ілюструється в супроводжуючих кресленнях. На фіг. 1 показана послідовність під часі операцій в експериментах по пошкодженню і відновленню нирок. Жирні стрілки означають час, в який робилися ін'єкції цисплатину, клітин або носія у вигляді HBSS (збалансованого сольового розчину Хенка), а також, коли робилися забори крові і розтин. На фіг. 2 показана виживаність тварин після індукції пошкодження нирок і трансплантації клітин, одержаних з тканини пупкового канатика. Номери груп лікування показані на осі Х. На фіг. 3 показані результати вимірювання BUN (азоту сечовини крові) у мишей. Зразки сироватки брали в 1-й, 3-й, 5-й і 7-й день після трансплантації клітин і вимірювали BUN. "Вуса" представляють SEM (стандартну помилку середньої величини). На фіг. 4 показані результати вимірювання сироваткового креатиніну. "Вуса" представляють стандартну помилку середньої величини. (*) Р