Спосіб одержання трансгенної рослини (варіанти) та її нащадків, здатних експресувати d-ендотоксини bacillus thuringiensis

1. Спосіб одержання трансгенної рослини, що передбачає введення в її геном послідовності нуклеїнової кислоти, що містить функціональну в рослині промоторну послідовність, функціонально зв'язану з першою полінуклеотидною послідовністю, яка кодує пластидний транзитний пептид, зв'язаною в рамці зчитування з другою полінуклеотидною послідовністю, що кодує білок Cry2Аb δендотоксину Bacillus thuringiensis, причому вказаний пластидний транзитний пептид діє таким чином, що локалізує експресію вказаного білка δендотоксину у субклітинній органелі або субклітинному компартменті. 2. Спосіб за п.1, де вказана послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить промотор, є промотором, функціональним у хлоропласті або пластиді рослини. 2 (19) 1 3 75570 4 13. Спосіб за п.1, де послідовність Cry2Аb коду25. Спосіб за п.23, де вказана інтронна послідовється послідовністю нуклеїнової кислоти, що місність є інтроном білка 70 теплового шоку кутить нуклеотиди 17-3155 SEQ ID NO: 15. курудзи. 14. Спосіб за п.1, де перша полінуклеотидна пос26. Спосіб за п.19, де вказана рослина є однодолідовність кодує пластидний транзитний пептид льною рослиною. послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID 27. Спосіб за п.26, де вказана рослина є однодоNO: 8 або SEQ ID NO: 10 (zmSSU РТР, РТР1, льною рослиною, вибраною з групи, що складаРТР1Δ або РТР2). ється з кукурудзи, рису, пшениці, ячменю, вівса, 15. Спосіб за п.14, де пластидний транзитний пепжита, проса, сорго, цукрової тростини і дереноуттид zmSSU РТР, що містить послідовність SEQ ID ворюючої трави. NO: 4, кодується послідовністю нуклеїнової кисло28. Спосіб за п.19, де вказана рослина є дводольти, яка містить SEQ ID NO: 3. ною рослиною. 16. Спосіб за п.14, де пластидний транзитний пеп29. Спосіб за п.28, де вказана рослина є дводольтид РТР1, що містить послідовність SEQ ID NO: 6, ною рослиною, вибраною з групи, що складається кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, яка з бавовнику, сої, томата, картоплі, цитрусових, містить SEQ ID NO: 5. тютюну, каноли і суниць. 17. Спосіб за п.14, де пластидний транзитний пеп30. Спосіб за п.19, де вказана рослина додатково тид РТР1Δ, що містить послідовність SEQ ID NO: містить додаткову послідовність нуклеїнової кис8, кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, лоти, що містить функціональний у рослині промояка містить SEQ ID NO: 7. тор, зв'язаний з полінуклеотидною послідовністю, 18. Спосіб за п.14, де пластидний транзитний пепщо кодує білок Cry1 δ-ендотоксину В. thuringiensis. тид РТР2, що містить послідовність SEQ ID NO: 31. Спосіб за п.19, де вказана субклітинна органе10, кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, ла або субклітинний компартмент являє собою що містить SEQ ID NO: 9. пластиду або хлоропласт рослини. 19. Спосіб одержання трансгенної рослини, що 32. Спосіб за п.19, де послідовність Cry2Аb кодупередбачає введення в її геном послідовності нукється послідовністю нуклеїнової кислоти, що міслеїнової кислоти, що містить функціональну в ростить нуклеотиди 17-3182 SEQ ID NO: 13. лині промоторну послідовність, функціонально 33. Спосіб за п.19, де послідовність Cry2Аb кодузв'язану з першою полінуклеотидною послідовнісється послідовністю нуклеїнової кислоти, що містю, що кодує пластидний транзитний пептид, яка тить нуклеотиди 17-3092 SEQ ID NO: 14. зв'язана у рамці зчитування з другою полінуклео34. Спосіб за п.19, де послідовність Cry2Аb кодутидною послідовністю, що кодує білок Cry2Аb δється послідовністю нуклеїнової кислоти, що місендотоксину Bacillus thuringiensis, причому вказатить нуклеотиди 17-3155 SEQ ID NO: 15. ний другий полінуклеотид функціонально зв'яза35. Спосіб за п.19, де перша полінуклеотидна посний з функціональною в рослині 3'-кінцевою послілідовність кодує пластидний транзитний пептид довністю термінації транскрипції і послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID поліаденілування, причому експресія вказаної поNO: 8 або SEQ ID NO: 10 (zmSSU РТР, РТР1, слідовності нуклеїнової кислоти у вказаній рослині РТР1Δ або РТР2). дозволяє одержати злитий білок, що складається з 36. Спосіб за п.35, де пластидний транзитний пепамінокінцевого пластидного транзитного пептиду, тид zmSSU РТР, що містить послідовність SEQ ID ковалентно зв'язаного із зазначеним білком δNO: 4, кодується послідовністю нуклеїнової кислоендотоксину, і вказаний злитий білок діє таким ти, яка містить SEQ ID NO: 3. чином, що локалізує експресію вказаного білка δ37. Спосіб за п.35, де пластидний транзитний пепендотоксину у субклітинній органелі або субклітид РТР1, що містить послідовність SEQ ID NO: 6, тинному компартменті. кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, яка 20. Спосіб за п.19, де вказана послідовність нуклемістить SEQ ID NO: 5. їнової кислоти, що містить функціональний у рос38. Спосіб за п.35, де пластидний транзитний пеплині промотор, є промоторною послідовністю, яка тид РТР1Δ, що містить послідовність SEQ ID NO: експресується в рослинах у природі. 8, кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, 21. Спосіб за п.19, де вказана полінуклеотидна яка містить SEQ ID NO: 7. послідовність, що кодує білок Cry2Аb δ39. Спосіб за п.35, де пластидний транзитний пепендотоксину Bacillus thuringiensis, вибрана з групи, тид РТР2, що містить послідовність SEQ ID NO: яка складається з SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 17. 10, кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, 22. Спосіб за п.19, де вказаний білок Cry2Аb δяка містить SEQ ID NO: 9. ендотоксину Bacillus thuringiensis вибраний із гру40. Спосіб одержання трансгенної рослини, що пи, що складається з SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: передбачає створення трансгенної рослини, яка 18. походить з тканини рослини, отриманої відповідно 23. Спосіб за п.19, де вказана послідовність нукледо способу за п.1 або 19, де вказана тканина росїнової кислоти додатково містить функціональну в лини включає рослину, насіння рослини або клітирослині інтронну послідовність. ни рослини, що містять вказану полінуклеотидну 24. Спосіб за п.23, де вказана інтронна послідовпослідовність, що кодує білок δ-ендотоксину. ність вибрана з групи, що складається з інтрону 1 41. Спосіб одержання трансгенної рослиниAdh, інтрону сахарозосинтази, елементу омега нащадка, що передбачає: TMV, інтрону білка 70 теплового шоку кукурудзи і (а) одержання першої рослини, яка містить посліінтрону Act1 рису. довність нуклеїнової кислоти, що містить функціональний у рослині промотор, функціонально зв'я 5 75570 6 заний з першою полінуклеотидною послідовністю, 44. Послідовність нуклеїнової кислоти, що містить яка кодує пластидний транзитний пептид, що зв'япромотор, функціонально зв'язаний з першою позана у рамці зчитування з другою полінуклеотидлінуклеотидною послідовністю, яка кодує пластидною послідовністю, що кодує білок Cry2Аb δний транзитний пептид, що зв'язаний у рамці зчиендотоксину Bacillus thuringiensis, причому вказатування з другою полінуклеотидною ний другий полінуклеотид функціонально зв'язапослідовністю, яка кодує білок Cry2А δний з функціональною в рослині 3'-кінцевою посліендотоксину Bacillus thuringiensis, причому експредовністю термінації транскрипції і сія зазначеної послідовності нуклеїнової кислоти поліаденілування, причому експресія вказаної порослинною клітиною дозволяє одержати злитий слідовності нуклеїнової кислоти в вказаній рослині білок, що містить амінокінцевий пластидний трандозволяє одержати злитий білок, що містить амізитний пептид, ковалентно зв'язаний із вказаним нокінцевий пластидний транзитний пептид, ковабілком δ-ендотоксину, і вказаний злитий білок діє лентно зв'язаний із вказаним білком δтаким чином, що локалізує експресію вказаного ендотоксину, і вказаний злитий білок діє таким білка δ-ендотоксину у субклітинній органелі або чином, що локалізує експресію вказаного білка δсубклітинному компартменті. ендотоксину в субклітинній органелі або субклі45. Послідовність нуклеїнової кислоти за п.44, де тинному компартменті; вказана перша полінуклеотидна послідовність ви(b) одержання другої рослини; і брана з групи послідовностей, що складається з (c) схрещування вказаних першої і другої рослин SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 і SEQ для одержання схрещеної трансгенної рослиниID NO: 9. нащадка, причому вказана рослина-нащадок ус46. Послідовність нуклеїнової кислоти за п.44, де падковує вказану послідовність нуклеїнової кисловказана друга полінуклеотидна послідовність коти від вказаної першої рослини. дує білок Cry2Аb δ-ендотоксину Bacillus 42. Спосіб за п.41, де вказана рослина-нащадок є thuringiensis. однодольною рослиною, причому вказана однодо47. Послідовність нуклеїнової кислоти за п.46, де льна рослина вибрана з групи, що складається з вказана друга полінуклеотидна послідовність кокукурудзи, рису, пшениці, ячменю, вівса, жита, дує білок Cry2Аb δ-ендотоксину Bacillus проса, сорго, цукрової тростини і дереноутворююthuringiensis, вибраний із групи послідовностей, що чої трави. складається з SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 18. 43. Спосіб за п.41, де вказана рослина-нащадок є 48. Послідовність нуклеїнової кислоти за п.47, де дводольною рослиною, причому вказана дводольвказана друга полінуклеотидна послідовність вибна рослина вибрана з групи, що складається з барана з групи послідовностей, що складається з вовнику, сої, томата, картоплі, цитрусових і тюSEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 17. тюну. 1.1 Область винаходу Даний винахід стосується загалом трансгенних рослин, що мають інсектицидні здібності, і конструкцій ДНК, що використовуються для перенесення генів, що додають стійкість до комах, в геноми рослин. Більш конкретно, даний винахід стосується способу експресії інсектицидних білків в рослинах, трансформованих геном, що кодує δендотоксин В. thuringiensis, що призводить до ефективного захисту від чутливих шкідниківмішеней. 1.2 Опис рівня техніки 1.2.1 Способи боротьби з інвазією комах в рослинах Грампозитивна ґрунтова бактерія В. thuringiensis добре відома внаслідок продукування нею білкових параспоральних кристалів, або δендотоксинів, які є токсичними для личинок численних лускатокрилих, жорсткокрилих і двокрилих комах. В. thuringiensis продукує у час споруляції кристалічні білки, які є специфічно токсичними відносно певних видів комах. Було показано, що різні штами В. thuringiensis продукують інсектицидні кристалічні білки. Композиції, що містять штами В. thuringiensis, які продукують білки, що мають інсектицидну активність, використали комерційно як прийнятні для навколишнього середовища топічні інсектициди внаслідок їх токсичності для конкретного комахи-мішені і відсутність токсичності для рослин і інших організмів, що не є мішенню. Кристали δ-ендотоксину є токсичними відносно личинок комахи при проковтуванні. Розчинення кристала в середній кишці комахи вивільняє протоксинову форму δ-ендотоксину, яка, у більшості випадках, процесується потім в активний токсин протеазою середньої кишки. Активовані токсини пізнають щіткову рамку епітелію середньої кишки комахи через рецепторні білки. Декілька уявних рецепторів кристалічних білків були виділені з личинок певних комах [Knight et al, 1995; Gill et al., 1995; Masson et al., 1995]. Скріплення активних токсинів супроводиться інтеркаляцією і агрегацією молекул токсину з утворенням пір в епітелії середньої кишки. Цей процес призводить до осмотичного дисбалансу, набухання, лізису клітин, що вистилають епітелій середньої кишки, і зрештою до загибелі личинок. 1.2.2 Трансгенні δ-ендотоксини В. thuringiensis як біопестициди Стійкість рослин і біологічний захист є центральними тактичними лініями захисту в більшості програм удосконалення інсектицидів, що застосовуються до більшості різноманітних культур. З пришестям молекулярно-генетичних способів були виділені гени різних δ-ендотоксинів і були визначені їх послідовності ДНК. Ці гени використовували для конструювання деяких генетично сконструйованих продуктів В. thuringiensis, які були схвалені 7 75570 8 для комерційного застосування. Недавні розвитки ну морфологію цих рослин. Подібні шкідливі ефекрозробили нові системи доставки δ-ендотоксинів, ти мають два небажаних результати: вони можуть в тому числі рослини, які містять і експресують перешкоджати отриманню і розмноженню трансгенетично сконструйовані гени δ-ендотоксинів. генних рослин; вони можуть також перешкоджати Експресія δ-ендотоксинів В. thuringiensis в рослирозвитку зрілих рослин або додавати неприйнятні нах містить в собі потенціал для ефективної бороагрономічні властивості. тьби з шкідниками рослин, доки можуть бути подоЗалишається потреба в композиціях і спосолані певні проблеми. Ці проблеми включають в бах, застосовних в отриманні трансгенних рослин, себе розвиток стійкості комах до конкретного білка які експресують δ-ендотоксини В. thuringiensis при Cry, експресованого в даній рослині, і розвиток рівнях, досить високих для ефективного захисту морфологічно рослин, що відхиляються від норми від комах-шкідників рослини-мішені, а також попевнаслідок присутності трансгену. редження розвитку інсектицид-резистентних штаБуло показано, що експресія δ-ендотоксинів В. мів шкідників. Спосіб, що призводить до високих thuringiensis в трансгенній бавовні, кукурудзі і каррівнів експресії δ-ендотоксинів В. thuringiensis затоплі є ефективним засобом боротьби із сільськобезпечить також переваги більш частого отримангосподарсько важливими комахами-шкідниками ня комерційно життєздатних трансформованих [Perlak et al., 1990; Koziel et al., 1993; Perlak et al., ліній рослин і більш ефективного захисту від зара1993]. Трансгенні культури, що експресують δження протягом усього вегетаційного періоду. ендотоксини В. thuringiensis, дозволяють рослинЗалишається також потреба в способі збільникам значно зменшити застосування дорогих, шення рівня експресії δ-ендотоксинів В. токсичних і іноді неефективних топічттих хімічних thuringiensis, який не призводить одночасно до інсектицидів. Застосування трансгенів, що кодують морфологічних змін рослини, що заважають оптиδ-ендотоксини В. thuringiensis, є особливо перевамальному зростанню і розвитку бажаних тканин жним, коли вбудовування трансгену не справляє рослини. Наприклад, спосіб посилення експресії δнегативного впливу на урожай бажаного продукту ендотоксинів В. thuringiensis в кукурудзі не повиз трансформованих рослин. Спостереження поканен призводити до рослини кукурудзи, яка не може зали, що урожаї з сільськогосподарських рослин, оптимально розвиватися для культивування. Дощо експресують певні δ-ендотоксини В. сягнення цих задач, таких як високі рівні експресії, thuringiensis, такі як Cry1А або Cry3А, є еквівалена також отримання морфологічно нормальних ротними або більш високими, ніж для інших однакослин, не вдавалося, і пошук їх рішення наполегливих нетрансгенних комерційних сортів рослин. Це во продовжувався був і важливим аспектом довговказує на те, що деякі δ-ендотоксини В. строкової цінності інсектицидних продуктів рослин. thuringiensis не мають значущого негативного 2.0 Суть винаходу впливу на зростання і розвиток рослин. Однак це Описані нові способи для експресії Cry2А δстосується не всіх δ-ендотоксинів В. thuringiensis, ендотоксинів В. thuringiensis, які позбавлені знаякі можуть бути використані для трансформації чущої інгібуючої двокрилих комах активності в рослин. трансформованих рослинах. Цей спосіб вигідно Застосування топічних зроблених з В. призводить до підвищених рівнів експресії δthuringiensis інсектицидів може також призвести до ендотоксинів В. thuringiensis, а також більш високої розвитку штамів комах, стійких до цих інсектицишвидкості відновлення морфологічно нормальних дів. Стійкість до δ-ендотоксинів Cry1A В. рослин. thuringiensis, що наносяться у вигляді листяних За допомогою досягнення високих рівнів ексспреїв, розвивалася в, щонайменше, одному добпресії, даний винахід впливає на іншу нестачу поре документованому випадку [Sheiton et аl., 1993]. переднього рівня: розвиток стійкості комах. КонкОчікується, що комахи можуть подібним чином ретно, даний винахід забезпечує перевершуючу розвивати стійкість до δ-ендотоксинів В. колишні способи стратегію затримки або елімінації thuringiensis, експресованим в трансгенних рослирозвитку стійкості до Cry1A δ-ендотоксинів, білків нах. Така стійкість, якщо вона стане поширеною, В. thuringiensis, найбільш звичайно експресованих могла б явно лімітувати комерційну цінність зародтрансгенними лініями. Описані способи включають кової плазми кукурудзи, бавовнику, картоплі і іншої в себе експресію класу Cry2А δ-ендотоксинів В. зародкової плазми, що містить гени, що кодують δthuringiensis і, зокрема, тих, які позбавлені інгібуюендотоксини В. thuringiensis. Один з можливих чої двокрилих комах активності, δ-ендотоксини В. способів як збільшення ефективності інсектициду thuringiensis групи Cry2А не мають значущої гомопроти шкідників-мішеней, так і зменшення розвитлогії з δ-ендотоксинів Cry1A типу і виявляють відку стійких до інсектицидів шкідників міг би полягати мінні характеристики скріплення і пороутворення в гарантії того, що трансгенні культури експресу(English et al., 1994), і очікується, що, як такі, вони ють високі рівні δ-ендотоксинів В. thuringiensis діють на комахах, які стають стійкими до δ(McGaughey and Whalon, 1993; Roush, 1994). ендотоксинів Cry1A або на які не діють δКрім отримання трансгенної рослини, яку ексендотоксини Cry1A (Hofte and Whiteley, 1989). пресує δ-ендотоксини В. thuringiensis при високих В переважних варіантах, даний винахід забезрівнях, комерційно життєздатні гени В. thuringiensis печує виділену і очищену конструкцію ДНК, що повинні задовольняти декільком додатковим кримістить кодуючий δ-ендотоксин Cry2А район, лотеріям. Наприклад, експресія цих генів в трансгенкалізований в пластиді або хлоропласті або локаних сільськогосподарських культурах не повинна лізований в ядерному геномі клітини рослини і зменшувати сили, життєздатності або фертильнофункціонально (оперативно) пов'язаний з райості цих рослин, і не повинна впливати на нормальном, що кодує пластидний транзитний пептид 9 75570 10 (РТР). Переважні конструкції ДНК даного винаходу отримані в додатковому переважному варіанті включають в себе конструкції, які кодують δспособом, що включає в себе отримання виділеної ендотоксини Cry2А, позбавлену інгібуючої двокриі очищеної конструкції ДНК і потім трансформацію лих комах активності, хоч повна інактивація віднорослини цією конструкцією таким чином, що дана сно двокрилих не є необхідною. В ілюстративному рослина експресує білки, які кодує дана конструкваріанті, конструкції ДНК даного винаходу кодують ція. Автори винаходу спостерігали, що трансфорδ-ендотоксин Cry2А функціонально пов'язаний з мація рослин описаними способами призводить до сегментом (або послідовністю) ДНК, що кодує плазбільшеної частоти трансформантів, яких експрестидний транзитний пептид, який є одним з засосують даний трансген, а також до генерування бів, що робить можливим локалізацію δбільше за морфологічно нормальні рослини з поендотоксину Cry2Аb в пластиді або хлоропласті. В чаткових трансформантів. деяких варіантах, δ-ендотоксин Cry2Аb містить Передбачається, що збільшені рівні експресії, послідовність SEQ ID NO: 2. Однак, автори винащо спостерігаються в описаному винаході, дозвоходу передбачають, що будь-який δ-ендотоксин лять отримати зменшений розвиток стійкості комах Cry2А, позбавлений інгібуючої двокрилих комах до δ-ендотоксинів В. thuringiensis. Це може бути активності, може бути використаний Згідно із дадосягнуто трансформацією рослини переважною ним винаходом, причому особливо переважними є конструкцією ДНК для отримання тільки високих δ-ендотоксини Cry2А, що мають значущі гомології рівнів експресії Cry2А або за допомогою одночасвідносно Cry2Аb. ного експонування комах-мішеней Cry1А і неактиВ іншому варіанті, конструкції ДНК даного вивним проти двокрилих комах δ-ендотоксинів находу використовують сегменти нуклеїнової кисCry2А, експресованих в чутливих рослинах. Такі лоти, що кодують РТР, для потенціювання експрекомахи включають в себе Ostrina spp., Diatraea сії δ-ендотоксину. Застосування одного типу РТР, spp., Helicoverpa spp. і Spodoptera spp., в Zea націлюючої на хлоропласти пептиду (СТР), в споmays; Heliothis virescens, Helicoverpa spp., лученні з трансгеном Cry1A В. thuringiensis для Pectinophora spp., в Gossypium hirsutum; активації експресії цього трансгену в трансформоAnticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp., ваній рослині, описано [в патенті США 5500365] в Glycine max; і Scirpophaga incertulas в Oryza (спеціально включеного тут як повне посилання). sativa. Однак, коли спостерігається підвищена експресія, Таким чином, передбачається, що спосіб, опиїї приписують частково використанню нової 5'саний даним винаходом забезпечить численні нетрансльованої лідерної послідовності в експрепереваги в порівнянні з колишнім рівнем, в тому суючому векторі. числі конкретно описані вище. Ці переваги вклюВ протилежність попередньому рівню даної чають в себе: досягнення поліпшеної боротьби області, даний винахід описує структурну послідовідносно чутливих комах; мінімізацію розвитку інвність ДНК, яка спричиняє утворення послідовноссектициду-резистентності штамів комах; отриманті РНК, що кодує цільовий злитий білок, що містить ня більшого числа комерційно життєздатних стійаміно-кінцевий пластидний транзитний пептид з δких до комах ліній рослин; досягнення захисту від ендотоксином Cry2Аb, і 3'-нетрансльовану послікомах-патогенів, що зберігається протягом усього довність ДНК, яка функціонує в клітинах рослин, вегетаційного періоду і збільшення частоти зустрівикликаючи термінацію транскрипції і приєднання чі морфологічно нормальних трансформованих поліаденільованих нуклеотидів до 3'-кінця вказаної рослин. Додатковою перевагою даного винаходу є послідовності РНК. Несподівано, ця конструкція те, що буде вимагатися отримання зменшених ДНК призводить до збільшених рівнів експресії δкількостей трансгенних ліній для ідентифікації ендотоксину Cry2А. Цей націлений злитий білок є трансгенної події з нормальними характеристиканеактивним для всіх видів, але продукується як ми зростання. засіб для локалізації зрілого, інсектицидно активТаким чином, передбачається, що спосіб, опиного білка δ-ендотоксину в хлоропласті, що дає саний даним винаходом, забезпечить багато педивні і несподівані вигідні агрономічні ефекти. реваг в порівнянні з колишнім рівнем, в тому числі Один варіант, представлений в даному винапереваги, конкретно окреслені вище. Ці переваги ході, являє собою введення гена, що кодує δвключають в себе: досягнення поліпшеної боротьендотоксин Cry2А, позбавлену активності проти би відносно чутливих комах; мінімізацію розвитку двокрилих комах, в хлоропластний або пластидінсектициду-резистентності штамів комах; отриний геном. Альтернативно, ген, що кодує δмання більшого числа комерційно життєздатних ендотоксин Cry2А, позбавлену активності проти стійких до комах ліній рослин; досягнення періоду двокрилих комах, міг би експресуватися з автонозахисту від комах-патогенів, що зберігається промно епісомного елемента, що реплікується, локатягом всього вегетаційного періоду захисту від лізованого в хлоропласті або пластиді. комах-патогенів і збільшення частоти зустрічі В іншому переважному варіанті, даний винахід морфологічно нормальних трансформованих росзабезпечує трансгенні рослини, які були трансфолин. Додатковою перевагою даного винаходу є те, рмовані виділеною і очищеною конструкцією ДНК, що буде необхідним отримання зменшених кількояка транслюється і експресується при високих рівстей трансгенних ліній для ідентифікації трансгеннях даною рослиною. Як однодольні, так і дводоної події з нормальними характеристиками зросльні рослини можуть бути трансформовані відпотання. відно до описаних тут способів і з використанням 2.1 Композиції нуклеїнових кислот описаних тут конструкцій ДНК. Рослини, трансфоВ одному важливому варіанті, даний винахід рмовані згідно з даним винаходом, можуть бути забезпечує виділену і очищену конструкцію нукле 11 75570 12 їнової кислоти, що містить кодуючий Cry2А район і SEQ ID NO: 9 або послідовність нуклеїнової кислокодуючий РТР район. Ці конструкції ДНК, при пети, яка по суті гомологічна цим послідовностям. ренесенні в рослину, зазнають клітинних процесів, Автори винаходу передбачають, що даний вищо призводять до збільшеної експресії δнахід міг би вирішити задачі збільшення патогенендотоксинів в трансгенній рослині, δ-ендотоксини ності для шкідників і отримати зменшений розвиCry2А даного винаходу є переважно неефективток стійких до пестицидів комах, якщо конструкції ними проти двокрилих комах, хоч деякі шкідливі дії ДНК, забезпечені тут, ко-експресувати разом з відносно двокрилих можуть бути прийнятними. В іншими пестицидними конструкціями, такими як деяких варіантах, конструкція ДНК кодує неактивінші білки. Таким чином, даний винахід забезпечує ний відносно двокрилих комах δ-ендотоксин застосування описаних конструкцій ДНК, які додаCry2Аb, а в більш переважних варіантах δтково містять експресовані в рослині кодуючі раендотоксин Cry2Аb має поліпептидну послідовйони, інших Cry-білків. В них могли б бути включеність SEQ ID NO: 2 або послідовність, по суті гоні кодуючі райони для Cry1-білків, таких як Cry1A, мологічну поліпептидній послідовності SEQ ID NO: Cry1Ab, Cry1Bb або Cry1-химери, див. що знахо2. Такі нуклеотидні гомологи можуть бути більш, дяться в процесі одночасного розгляду [заявки на ніж на приблизно 88%, гомологічними, більш, чим патент США з реєстраційними номерами на приблизно 90%, гомологічними, більш, ніж на 08/754490 і 08/922505 і], що знаходиться в процесі приблизно 95%, гомологічними і навіть більш, ніж одночасного розгляду РСТ [заявку на 99% гомологічними з δ-ендотоксином Cry2Аb, PCT/US97/17507 на основі заявки США з реєстрапредставленим в SEQ ID NO: 2. Приклади пептиційним номером 08/721259], кожна з яких включедів включають в себе пептиди, які на приблизно на тут в повному вигляді як посилання. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 і навіть 99 В деяких переважних варіантах конструкція або більше проценті гомологічні δ-ендотоксину ДНК є експресійною касетою, яка може бути виріCry2Аb, представленому в SEQ ID NO: 2. зана і виділена з вказаної плазміди. В навіть більш переважних варіантах, констру2.2 Додаткові елементи композиції нуклеїнової кція ДНК даного винаходу містить кодуючий δкислоти ендотоксин Cry2Аb район з послідовністю нуклеїПолінуклеотидні композиції даного винаходу нової кислоти SEQ ID NO: 1 або послідовністю зі застосовні в трансформації як однодольних, так і значною гомологією відносно послідовності SEQ дводольних рослин. Таким чином, конструкція ДНК ID NO: 1. Також розглядаються як такі, що знаходаного винаходу може додатково містити інші різні дяться в об'ємі даного винаходу конструкції ДНК, регуляторні елементи для сприяння в експресії що мають сегменти зі значними гомологіями відбілків і для додаткового полегшення введення даносно послідовності нуклеїнової кислоти, предстаної конструкції ДНК до рослини. Одним прикладом вленої в SEQ ID NO: 1, такі як сегменти, які можуть цього є включення в дану конструкцію ДНК інтробути приблизно на 90% гомологічними або прибну, розташованого в нетрансльованому лідерові, лизно на 95% гомологічними або навіть на прибвище по ходу транскрипції (зліва) від району, що лизно 99% гомологічними. Більш конкретно, гомокодує пластидний транзитний пептид. Однією із логічні послідовності нуклеїнових кислот, включені застосовних лідерних послідовностей є хітшоковий в даний винахід, включають в себе послідовності, білок (білок теплового шоку) петунії. В різних альякі є на приблизно 90. 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 і тернативних варіантах даний інтрон може бути 99 процентів є гомологічними послідовності нуклебудь-яким з наступних інтронів: інтроном 1 Adh, їнової кислоти SEQ ID NO: 1. інтроном сахарозосинтази, омегою-елементом Конструкції ДНК, забезпечені тут, включають в TMV, хітшоковим білком 70 кукурудзи (hsp 70) або себе також РТР-кодуючий район, розташований інтроном Acti рису. В переважних варіантах, даний вище по ходу транскрипції (зліва) від району, що інтрон є або хітшоковим білком 70 кукурудзи, або кодує δ-ендотоксин Cry2А, і нижче по ходу транскхітшоковим білком 70 петунії. рипції (праворуч) від промотору. Ці кодуючі пласВ іншому переважному варіанті даного винатидний транзитний пептид райони можуть кодуваходу забезпечена нуклеотидна послідовність, що ти будь-який функціональний в рослині РТР і містить додатково кодуючий район по суті неактиможуть функціонувати для націлювання білків, що вного відносно двокрилих комах δ-ендотоксину кодуються, в певні пластиди в клітині рослин або Cry2А і кодуючий РТР район, розташований під для збільшення експресії δ-ендотоксину, що кодуконтролем функціонального в рослині промотору. ється даною конструкцією ДНК. В переважних ваЗастосування промотору необхідне для запуску ріантах, даний винахід може включати в себе РТР, клітинних процесів таким чином, щоб максимізувавибраний з групи, що складається з zmSSU, PTP1, лась експресія даного гена. Переважні промотори ΡΤΡ1Δ і РТР2, або будь-які інші функціональні в включають в себе наступні промотори: CaMV 35S, рослині РТР. Більш конкретно, район, що кодує гістону, CaMV 19S, nos, OCS, Adh, сахарозосинтапластидний транзитний пептид, кодує пластидний зи, α-тубуліну, актину, cab, ΦΕΠ-карбоксилази, транзитний пептид, що має амінокислотну посліssRUBISCO (малої суб'одиниці РБФК), Acti, Famv, довність SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: посиленого FMV, або промотори, пов'язані з ком8 або SEQ ID NO: 10 або будь-яку поліпептидну плексом R-генів. В більш переважних варіантах, послідовність, по суті гомологічну цим послідовнопромотор являє собою посилений або подвоєний стям. Навіть більш переважно, даний винахід промотор CaMV 35S (Kay et al, 1987). В додатковключає в себе район, що кодує пластидний транвих переважних варіантах, промотор є промотозитний пептид, що має нуклеотидну послідовність ром FMV35S. Функціональні в хлоропластах або SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 або пластидах рослин промотори також входять в 13 75570 14 сферу дії даного винаходу. Вектори, що додатково розглядаються як такі, Далі, даний винахід розглядає включення терщо знаходяться в сфері дії даного винаходу, мінаторного району в конструкцію ДНК для спривключають в себе вектори, здатні містити як комяння клітинним процесам, що беруть участь в експозиції нуклеїнових кислот неактивного до двокрипресії білка. В різних варіантах, цей термінатор лих комах Cry2А, описані в розділі 2.1 вище, так і може бути будь-яким з наступних термінаторів: будь-які інші конструкції ДНК, які додатково містять термінатором гена нопалінсинтази Agrobacterium експресовані в рослинах кодуючі райони для інших tumefaciens, темінатором гена октопінсинтази білків Cry, таких як білок Cry1. Вектори, здатні місAgrobacterium tumefaciens і 3'-кінцем гена інгібітору тити обидві з цих конструкцій, можуть також містипротеази І або II з картоплі або томату. В особливо ти безліч різних цистронів, що роблять їх поліциспереважному варіанті, термінатором є термінатор тронними або мультицистронними. гена нопалінсинтази Agrobacterium tumefaciens. 2.4 Трансформовані клітини-господарі 2.3 Трансформуючі вектори Інший переважний варіант даного винаходу Оскільки конструкція ДНК даного винаходу включає в себе клітини, трансформовані конструкпризначена передусім, хоч і не виключно, для заціями ДНК, описаними тут в розділах 2.1 і 2.2, і з стосування в трансформації рослин, вона в деяких використанням трансформуючих векторів, описапереважних варіантах міститься в експресуючому них в розділі 2.3. Трансформовані клітини, що розвекторі. Такі експресуючі вектори можуть містити глядаються в даному винаході, включають в себе безліч регуляторних і інших елементів, призначеяк прокаріотичні, так і еукаріотичні клітини, експрених для можливості оптимальної експресії бажасуючі білки, що кодуються новими конструкціями них білків, які кодує даний експресуючий вектор. Ці ДНК даного винаходу. Спосіб отримання трансдодаткові елементи можуть включати в себе прогенних клітин добре відомий в даній області. В мотори, термінатори і інтрони, описані вище в роззагальних рисах, даний спосіб передбачає трансділі 2.2. Вектор, що містить конструкцію ДНК і формацію відповідної клітини-господаря сегменбудь-які регуляторні або інші елементи, може бути том ДНК, який містить промотор, функціонально вибраний з групи, що складається з штучної хро(оперативно) пов'язаний з кодуючим районом, мосоми дріжджів, штучної хромосоми бактерій, який кодує δ-ендотоксин В. thuringiensis. Такий плазміди або косміди. кодуючий район звичайно функціонально пов'язаДалі, самі експресуючі вектори можуть бути в ний з районом термінації транскрипції, внаслідок різних формах. Ці форми можуть відрізнятися вначого даний промотор здатний запускати транскрислідок різних причин і будуть, ймовірно, складатипцію даного кодуючого району в даній клітині і, ся з різних компонентів в залежності від того, чи отже, забезпечувати клітину здатністю продукувапризначені вони для трансформації однодольної ти δ-ендотоксин in vivo. Альтернативно, у випадабо дводольної рослини. Наприклад, Фіг.1 ілюстках, коли бажано контролювати, регулювати або рує один можливий варіант, де експресуючий векзнижувати кількість конкретного δ-ендотоксину або тор однодольних рослин містить ген Cry2М в плаендотоксинів, експресованих в конкретній трансзміді, названої (SEQ ID NO: 16). Крім того, генній клітині, даний винахід забезпечує також передбачається, що як застосовні трансформуючі експресію антисмислової мРНК δ-ендотоксину; конструкції будуть застосовні також інші експресуантисмислової мРНК інтрона; антисмислової мРНК ючі вектори, що містять експресійні касети, предРТР або антисмисловрї мРНК UTR. Застосування ставлені в цих плазмідних векторах, а також ексантисмислової мРНК як засобу регуляції або змепресійні касети, що містять по суті гомологічні ншення кількості конкретного білка, що викликає послідовності. Таким чином, будь-який трансфорінтерес, в клітині добре відоме в даній області. муючий вектор, що містить послідовність нуклеїВ переважному варіанті, даний винахід вклюнової кислоти від нуклеотиду 1781 до нуклеотиду чає в себе клітину рослини, яка була трансформо5869 SEQ ID NO: 16, може бути використаний. вана сегментом нуклеїнової кислоти або конструкФіг.2 ілюструє один можливий експресуючий цією ДНК даного винаходу і яка експресує ген або вектор дводольних рослин. Він містить ген Cry2Аb, сегмент гена, що кодує один або декілька неактивпредставлений в плазмідах, названих pMON33827 них відносно двокрилих комах δ-ендотоксинів (SEQ ID NO: 13), pMON33828 (SEQ ID NO: 14) і Cry2А В. thuringiensis, як описано тут. В застосуpMON33829 (SEQ ID NO: 15). Як і у разі трансфованні тут, термін «трансгенна клітина рослини» рмуючих векторів однодольних рослин, автори стосується клітини рослини, яка має включені посвинаходу вважають, що інші експресуючі вектори, лідовності ДНК, в тому числі, але не тільки, гени, що містять експресійні касети, представлені в цих які, можливо, в нормі не присутні, послідовності плазмідних векторах, або по суті гомологічні цим ДНК, які в нормі не транскрибуються в РНК або не експресійним касетам вектори, будуть застосовні транслюються («не експресуються») в білок, або як трансформуючі конструкції дводольних рослин. будь-які інші гени або послідовності ДНК, які бажаПереважні експресійні касети дводольних рослин но ввести в нетрансформовану рослину, такі як включають в себе касети, представлені нуклеїногени, які в нормі присутні в нетрансформованій вими кислотами 17-3182 SEQ ID NO: 13; нуклеїнорослині, але які бажано сконструювати генетично вими кислотами 17-3092 SEQ ID NO: 14 і нуклеїноабо які повинні мати змінену експресію. вими кислотами 17-3155 SEQ ID NO: 15. Передбачається, що в деяких випадках геном Ілюстративні варіанти векторів, що містять такі трансгенної рослини даного винаходу буде збільекспресійні касети, описані в послідовностях, позшений за допомогою стабільного введення консначених тут як SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 і трукцій ДНК, що кодують неактивний відносно двоSEQ ID NO: 15. крилих комах δ-ендотоксин Cry2А В. thuringiensis, 15 75570 16 як описано в розділах 2.1 і 2.2 вище. В деяких виплодоовочеві, декоративні і інші економічно або падках, більше за одну трансгену будуть включені комерційно цінні рослини можуть бути створені у в ядерний геном або в хлоропластний або пластивідповідності зі способами, описаними тут, для дний геном трансформованої клітини-господаря експресії δ-ендотоксинів В. thuringiensis при рівнях, рослини. Це має місце, коли більш, ніж один сегдосить високих для придання стійкості до комахмент ДНК, що кодує кристалічний білок, включений патогенів, причому ці рослини залишаються морв геном такої рослини. В деяких ситуаціях, може фологічно нормальними. бути бажано мати один, два, три, чотири або наТакі рослини можуть ко-експресувати поліпепвіть більше кодуючих кристалічний білок В. тид δ-ендотоксину разом з іншими протигрибковиthuringiensis полінуклеотидів (або нативних, або ми, антибактерійними або антивірусними пов'язарекомбінантно-сконструйованих), включених і станими з патогенезом пептидами, поліпептидами більно експресованих в трансформованій трансабо білками; інсектицидними білками; білками, що генній рослині. додають стійкість до гербіцидів; і білками, що беВ переважних варіантах, введення трансгену в руть участь в поліпшенні якості або кількості прогеном клітини рослини призводить до стабільної дуктів рослин або агрономічної продуктивності інтеграції, при якій потомство таких рослин також рослин. Одночасна ко-експресія множинних білків містить копію трансгену в їх геномі. Спадковість в рослинах є вигідною тому, що вона використовує цього генетичного елемента потомством рослини, більше за один спосіб дії для боротьби з патогенв яке початково був введений даний ген, є переним пошкодженням рослин. Це може мінімізувати важним аспектом даного винаходу. Переважний можливість розвитку стійких штамів патогенів, роген, який може вводитися, включає в себе напризширити сферу стійкості і потенційно призвести до клад, ген δ-ендотоксину В. thuringiensis і, зокрема, синергічної інсектицидній дії, посилюючи таким один або декілька з генів, описаних тут. чином здібності рослини протистояти інвазії комах Засоби для трансформації клітини рослини і [Intl. Patent Appl. Publ. No. WO 92/17591, 15 отримання трансгенної клітинної лінії добре відомі October 1992], включена тут як повне посилання. в даній області, приклади приведені [в патентах Трансформована рослина даного винаходу США 5550318; 5508468; 5482852; 5384253; може бути або однодольною рослиною, або дво5276269 і 5225341], всі спеціально включені тут в дольною рослиною. Якщо ця рослина є однодольповному вигляді як посилання, і коротко обговоною рослиною, вона може бути будь-якою з чисрюються тут. Вектори·, плазміди, косміди, YAC ленних видів. Переважні однодольні види, (штучні хромосоми дріжджів) і сегменти ДНК для включені в даний винахід, можуть включати в себе застосування в трансформації таких клітин будуть, кукурудзу, рис, пшеницю, ячмінь, овес, жито, прозвичайно, звичайно містити або оперони, гени, або со, сорго, цукрову тростину, спаржу, дереноутвовироблені з генів послідовності даного винаходу, рюючі трави або будь-яку з ряду інших зернових або нативні, або синтетично отримані, і, зокрема, або злакових рослин. В переважних варіантах одкодуючі описані кристалічні білки. Ці конструкції нодольною рослиною є кукурудза. ДНК можуть додатково включати в себе структури, Даний винахід розглядає також безліч дводотакі як промотори, енхансери, полілінкери або нальних рослин, таких як бавовнику, соя, томати, віть генні послідовності, які мають позитивно або цитрусова рослина, тютюн, цукровий буряк, люценегативно регулюючу активність відносно конкретрна, кормові (кінські) боби, горох, квасоля, яблуня, них генів, що викликають інтерес, якщо це бажане. вишня, груша, суниці, малина або будь-яка інша Сегмент ДНК або ген може кодувати або нативний, бобова, бульбова або плодова рослина. В переабо модифікований кристалічний білок, який буде важних варіантах, дводольною рослиною є рослиекспресуватися в отриманих рекомбінантних кліна сої, рослина тютюну або рослина бавовнику. тинах і/або який буде додавати поліпшений феноБагато з рослин, які призначені для трансфотип регенерованій рослині. рмації Згідно із даним винаходом, є комерційними Трансгенні клітини, що конкретно розглядасільськогосподарськими культурами. Комерційною ються в даному винаході, включають в себе трансформою цих рослин можуть бути початкові рослигенні клітини рослин. Особливо переважні клітини ни або їх потомство, яке успадковувало бажані рослин включають в себе клітини, отримані з кукутрансгени. Таким чином, рослини, ті, що додатково рудзи, пшениці, сої, дереноутворюючих трав, дерозглядаються в сфері даного винаходу, включакоративних рослин, плодового дерева, чагарників, ють в себе будь-яке потомство рослин, трансфоровочів, зернових, бобових і тл. або будь-якої росмованих будь-якою з пермутацій конструкції ДНК, лини, в яку бажано введення трансгену δвказаних в даній заявці. Конкретно, цей нащадок ендотоксину В. thuringiensis, неактивного відносно може бути визначений як трансгенна рослина R0. двокрилих комах. Інші потомства трансформованої рослини також 2.5 Трансформовані рослини включені в сферу дії даного винаходу, в тому числі В іншому аспекті, рослини, трансформовані будь-яка рослина-нащадок будь-якої генерації будь-якою конструкцією ДНК даного винаходу, яка трансформованої рослини, коли це рослинаекспресує білки, що кодуються даною конструкцінащадок успадкувало конструкцію ДНК з будь-якої єю, розглядаються як частина даного винаходу. рослини R0. Таким чином, даний винахід забезпечує, далі, траПри трансформації специфічною конструкцією нсгенні рослини, які були трансформовані конструДНК сегменти нуклеїнової кислоти або полінуклеокцією ДНК, описаною тут в розділах 2.1 і 2.2, і були тидні сегменти даної конструкції можуть бути трансформовані з використанням трансформуювключені в різних частинах в хромосому трансфочих векторів, описаних в розділі 2.3. Агрономічні, рманту. Таким чином, в іншому варіанті, даний 17 75570 18 винахід включає в себе будь-яку рослину або Cry2А при рівнях в 25 раз більш високих, ніж рівні, будь-яку клітину рослини, отриману з використанщо досягаються існуючими способами. ням описаної тут конструкції ДНК. Такі рослини Таким чином, описаний тут спосіб дозволяє або клітина, включена в даний винахід, включають рослинам експресувати Cry2А для використання в себе рослину або клітину, отриману способом, або як альтернативи, або як доповнення до росякий передбачає наступні стадії: (1) отримання лин, експресуючим δ-ендотоксини типу Cry1А В. конструкції ДНК, що включає в себе район, що thuringiensis як для знищення, так і для подолання кодує δ-ендотоксин Cry2А В. thuringiensis, неактистійкості ключових комах-шкідників, в тому числі вну відносно двокрилих комах, розташовану в раOstrina sp., Diatraea sp., Helicoverpa sp., мці прочитання і під контролем промотору, функSpodoptera sp. в Zea mays; Heliothis virescens, ціонального (операбельного) в рослині, і район, Helicoverpa sp., Pectinophora sp. в Gossypium що кодує пластидний транзитний пептид, розтаhirsutum; і Anticarsia sp., Pseudoplusia sp., Epinotia шований вище по ходу транскрипції (зліва) від коsp. в Glycine max. Передбачається також, що опидуючого району δ-ендотоксину Cry2А В. сані, способи можуть бути використані для драмаthuringiensis і нижче по ходу транскрипції (правотичного збільшення експресії δ-ендотоксинів В. руч) від промотору; і (2) трансформацію рослини thuringiensis, що включають в себе Cry2А і родинотриманою конструкцією ДНК, так що дана рослиних Cry2А, із збільшенням таким чином ефективна експресує δ-ендотоксин Cry2А В. thuringiensis. ності проти комах-мішеней і зменшенням ймовірРослина може бути також трансформована таким ності розвитку резистентності до цих білків. В чином, що вона додатково включає в свій геном і одному варіанті даного винаходу експресується δекспресує інші δ-ендотоксини Cry. ендотоксин Cry2Аb. Комахи-мішені цього білка і їх В родинному аспекті, даний винахід включає в звичайні господарі показані нижче в таблиці 1. себе також насіння, продуковане трансформоваТаблиця 1 ною рослиною, потомство такого насіння і насіння, продуковане потомством початкової трансгенної Комахи-мішені Сry2Ab і рослини, отриманої відповідно до описаного вище звичайні рослини-господарі цих шкідників способу. Таке потомство і таке насіння буде мати Шкідники Господарі Посилання в якості трансгену δ-ендотоксин В. thuringiensis, Ostrina nubialis Zea mays Donovan неактивний відносно двокрилих комах, і таке поU.S.Patent 5 338 Diatraea grandiosella Gossypium hirsutum томство буде успадковувати ознаки, привнесені 544 введенням стабільного трансгену, відповідно до Helicoverpa zea Glycine max Heliothis virescens мендельського розщеплення. Всі такі трансгенні Pectinophora gossypiella рослини, що мають включені в їх геном трансгенні Anticarsia gemmatalis сегменти ДНК, що кодують будь-яку включену в Pseudoplusia includens них конструкцію ДНК, зокрема, конструкції ДНК, Epinotia aporema описані в розділах 2.1 і 2.2, є аспектами даного винаходу. Спосіб експресії δ-ендотоксину Cry2A В. Могли б бути також отримані рекомбінантні thuringiensis в рослині, описаний тут, включає в рослини, клітини, насіння і інші тканини, в яких себе стадії: (1) отримання сегмента нуклеїнової були змінені тільки мітохондріальна або хлороплакислоти, що містить промотор, функціонально стна ДНК включенням молекул, що розглядаються (оперативно) пов'язаний з першою полінуклеотидв даній заявці. Промотори, які функціонують в ною послідовністю, що кодує пластидний транзитхлоропластах, відомі в даній області [Hanleyний пептид, і другою полінуклеотидною послідовBowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12:67ністю, що кодує δ-ендотоксин Cry2А В. 70. 1987]. Способи і композиції для отримання thuringiensis, позбавлений активності проти двокклітин, що містять хлоропласти, в які була введена рилих комах, з отриманням злитого білка, що гетерологічна ДНК, були описані [Daniell et al., U.S. складається з амінокінцевого пластидного транзиPat. No.5693507 (1997)]. тного пептиду і δ-ендотоксину Cry2А В. 2.6 Способи трансформації рослин thuringiensis, позбавленого активності проти двок2.6.1 Спосіб експресії δ-ендотоксину Cry2А в рилих комах, і (2) трансформації рослини конструрослині кцією ДНК стадії 1 таким чином, що дана рослина В іншому переважному варіанті, даний винахід експресує даний злитий білок. В переважному вазабезпечує спосіб експресії δ-ендотоксинів Cry2А ріанті, сегмент нуклеїнової кислоти, щовикористоВ. thuringiensis, неактивних відносно двокрилих вується в стадії (1) даного способу, побудований комах, при високих рівнях в трансгенних рослинах. таким чином, що 5'-кінець другої полінуклеотидної Описані способи можуть використати будь-яку з їх послідовності функціонально пов'язаний в одній і конструкцій ДНК, описаних в розділах 2.1 і 2.2 витій же трансляційний рамці прочитання з 3'-кінцем ще, а також будь-який з трансформуючих векторів, першої полінуклеотидної послідовності. описаних, наприклад, в розділі 2.3 вище. Способи, Рослина або клітина рослини, трансформовані що розглядаються, дозволяють δ-ендотоксинам за описаним тут способом, можуть бути або одноCry2А, альтернативі δ-ендотоксинів Cry1А В. дольною рослиною або дводольним рослиною. thuringiensis для боротьби з деякими комахамиЯкщо дана рослина є однодольною рослиною, шкідниками, експресуватися в рослинах без негавона може бути будь-якою з безлічі видів. Перетивного впливу на отримання агрономічних якосважні однодольні рослини, включені в даний винатей трансгенних рослин. Винахід, описаний тут, хід, можуть включати в себе кукурудзу, рис, пшеробить також можливим експресію δ-ендотоксинів ницю, ячмінь, овес, жито, просо, сорго, цукрову 19 75570 20 тростину, спаржу, дереноутворюючі трави або 3.0 Короткий опис малюнків будь-яку з ряду інших зернових або злакових росНаступні малюнки утворюють частину даного лин. В переважних варіантах однодольною рослиопису і включені для додаткової демонстрації деною є кукурудза. яких аспектів даного винаходу. Даний винахід моДаний винахід розглядає також спосіб, за доже бути краще зрозумілий з посиланням на один помогою якого трансформують дводольні рослини або декілька з цих малюнків в поєднанні з докладабо клітини рослин. Такі дводольні рослини моним описом характерних експериментів, предстажуть включати в себе такі рослини, як бавовнику, влених тут. соя, томати, картоплю, цитрусові рослини, тютюн, Фіг.1. Схематична ілюстрація елементів ексцукровий буряк, люцерну, кормові (кінські) боби, пресуючих векторів Cry2Аb однодольних рослин горох, квасолю, яблуню, вишню, груші, суниці, маpMON30464, pMON30463 і pMON26800. лину або будь-яку інша бобову, бульбову або плоФіг.2. Схематична ілюстрація елементів ексдову рослину. В переважних варіантах, дводольпресуючих векторів Cry2АЬ дводольних рослин ною рослиною є рослина сої, рослина або клітина pMON33830, pMON33827, pMON33828 і тютюну або рослина або клітина бавовнику. pMON33829. 2.6.2 Спосіб експресії δ-ендотоксину Cry2Аb в Фіг.3. Схематична ілюстрація елементів експотомстві рослини пресуючих векторів Cry2Aa дводольних рослин Як зазначалось відносно інших варіантів, опиpMON33803, pMON33812, pMON33811 і саних в даному винаході, багато які рослини, приpMON33806. значені для трансформації Згідно із даним винаФіг.4. Плазміда, названа pMON30464. ходом, є комерційними сільськогосподарськими Фіг.5. Плазміда, названа pMON33827. рослинами. Комерційною формою цих рослин моФіг.6. Плазміда, названа pMON33828. жуть бути початкові рослини або їх потомство, яке Фіг.7. Плазміда, названа pMON33829. успадковувало бажані трансгени. Таким чином, 4.0. ОПИС ІЛЮСТРАТИВНИХ ВАРІАНТІВ автори винаходу додатково передбачають, що Наступний докладний опис даного винаходу описаний тут спосіб включає в себе спосіб отризабезпечено для допомоги фахівцям, кваліфіковамання трансгенної рослини-нащадка або клітининим в даній області, в застосуванні на практиці рослини-нащадку. Спосіб отримання такого поданого винаходу. Навіть в цьому випадку, поданий томства включає в себе наступне. Спосіб експресії далі докладний опис не повинен розглядатися як δ-ендотоксину Cry2Аb В. thuringiensis в описаній надмірно обмежуючий даний винахід, оскільки тут рослині включає в себе стадії: (1) отримання модифікації і варіації у варіантах, що обговорюсегмента нуклеїнової кислоти, що містить промоються тут можуть бути вироблені фахівцями з кватор, функціонально (оперативно) пов'язаний з ліфікацією в даній області без відхилення від ідеї і першою полінуклеотидною послідовністю, що косфери дії даного винахідницького відкриття. дує пластидний транзитний пептид, і другої полі4.1. ІДЕНТИФІКАЦІЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ нуклеотидної послідовності, що кодує δSEQ ID NO: 1. Послідовність нуклеїнової кисендотоксин Cry2А В. thuringiensis, позбавлену аклоти гена Cry2Аb. тивності проти двокрилих комах; (2) отримання SEQ ID NO: 2. Амінокислотна послідовність δдругої рослини і (3) схрещування першої і другої ендотоксину Cry2АЬ В. thuringiensis. рослин з отриманням схрещеної трансгенного наSEQ ID NO: 3. Послідовність нуклеїнової кисщадка-рослини або нащадка-клітини-рослини, які лоти пластидного транзитного пептиду zmSSU. успадкували нуклеїнові сегменти з першої рослиSEQ ID NO: 4. Амінокислотна послідовність ни. Даний винахід конкретно включає в себе попластидного транзитного пептиду zmSSU. томство, рослину або насіння потомства з будьSbQ ID МО. 5. Послідовність нуклеїнової кисяких з однодольних або дводольних рослин, в толоти пластидного транзитного пептиду 1 (РТР1). му числі вказаних в розділах 2.5 і 2.6.1 вище. SEQ ID NO: 6. Амінокислотна послідовність 2.6.3 Спосіб ко-експресії Cry2Аb і інших δРТР1. ендотоксинів Cry В. thuringiensis в рослині і рослиSEQ ID NO: 7. Послідовність нуклеїнової кисні-нащадкові лоти пластидного транзитного пептиду 1Δ В іншому переважному варіанті, описаний тут (ΡΤΡ1Δ). спосіб експресії неактивного у відношенні Diptera SEQ ID NO: 8. Амінокислотна послідовність δ-ендотоксину Cry2А В. thuringiensis включає в ΡΤΡ1Δ себе ко-експресію описаної конструкції ДНК, в SEQ ID NO: 9. Послідовність нуклеїнової кисбудь-якому з її описаних варіантів, разом з δлоти пластидного транзитного пептиду 2 (РТР2). ендотоксином Cry1 В. thuringiensis. Очікується, що SEQ ID NO: 10. Амінокислотна послідовність даний спосіб експресії разом цих δ-ендотоксинів РТР2. Cry В. thuringiensis дозволить набути підвищених SEQ ID NO: 11. Послідовність нуклеїнової кисінсектицидних властивостей в трансформованій лоти гена Cry2Aa. рослині через збільшену експресію і знижений роSEQ ID NO: 12. Амінокислотна послідовність звиток резистентності комах, які є бажаними реполіпептиду Cry2Aa. зультатами, не присутніми в існуючих способах. SEQ ID NO: 13. pMON33827. Ця ко-експресія може мати місце в початковому SEQ ID NO: 14. pMON33828. трансформанті або в будь-якому числі поколінь SEQ ID NO: 15. pMON33829. потомства початкового трансформанта, яке успадSEQ ID NO: 16. pMON30464. кувало ці гени, для ко-експресії білків, що кодуютьSEQ ID NO: 17. Послідовність гена Cry2Ab ся будь-якою з конструкцій ДНК, описаних тут. Bacillus thuringiensis, UWGCG номер доступу 21 75570 22 М23724 (Widner and Whiteley). Функціонально (оперативно) пов'язані: Кодуючі SEQ ID NO: 18. Амінокислотна послідовність сегменти нуклеїнової кислоти, пов'язані в рамці Cry2Ab Bacillus thuringiensis, що транслюється з прочитання таким чином, що властивості однієї SEQ ID NO: 17. впливають на експресію іншого. 4.2 ВИЗНАЧЕННЯ Експресовані в рослині кодуючі райони: КодуНаступні слова і фрази мають тут приведені ючі райони, які є експресованими in planta, оскільнижче значення. ки вони містять типові для рослин регуляторні Біологічні функціональні еквіваленти. В застоелементи для полегшення експресії гена, що суванні тут такі еквіваленти, що стосуються інсекпредставляє інтерес. тицидних білків даного винаходу, є пептидами, Пластидний транзитний пептид: Будь-яка аміполіпептидами і білками, які містять схожість поснокислотна послідовність, застосовна в націлюлідовності або частини, що представляє послідовванні або локалізації пов'язаної амінокислоти, таність, з новими пептидами даного винаходу, такикої як злитий білок, в субклітинний компартмент ми як Cry2Аb, і які виявляють однакові або схожі або органелу, таку як пластида. функціональні властивості з властивостями опиПотомство: «Потомство» включає в себе будьсаних тут поліпептидів, в тому числі інсектицидну який паросток або нащадка трансгенної рослини активність. Біологічні еквіваленти включають в або будь-яку подальшу рослину, яка має трансфосебе також пептиди, поліпептиди і білки, які взаєрмант в її лінії диференціювання (родоводу). Помодіють, тобто специфічно зв'язуються з антитітомство не обмежується однією генерацією, а лами, індукованими проти Cry2Аb, і які виявляють охоплює нащадків трансформанта доти, поки вони однакову або схожу інсектицидну активність, в містять або експресують даний трансген. Насіння, тому числі як моноклональними, так і поліклональщо містить трансгенні ембріони, а також насіння з ними антитілами. трансгенних рослин і їх нащадки або паростки таТермін локалізовані в хлоропласті або пластикож є важливими частинами даного винаходу. ді, в застосуванні тут, стосуєтеся біологічної молеПромотор: Сайт пізнавання на послідовності кули, полінуклеотиду або поліпептиду, яка розтаДНК або групі послідовностей ДНК, який забезпешована в хлоропласті або пластиді, так що ця чує регуляторний елемент експресії для структурмолекула ізольована від клітинної цитоплазматичного гена і з яким специфічно зв'язується РНКного середовища, і функціонує в цитоплазмі хлополімераза і ініціює синтез РНК (транскрипцію) ропласту або пластиди із забезпеченням ефектів, даного гена. заявлених в даному винаході. Локалізація біологіR0 означає первинну регенеровану рослину, чної молекули в хлоропласті або пластиді може отриману з трансформації тканини або клітин росвідбуватися, у випадку полінуклеотидів, з викорислини в культурі. Подальше потомство або податанням штучних механічних засобів, такими як льші генерації, отримане з даного R0, називають електропорація, механічна мікроін'єкція, або бомR1 (перша генерація), R2 (друга генерація) і т.ін. бардуванням покритими полінуклеотидуми мікросРегенерація: Процес вирощування рослини з нарядами, або, у випадку поліпептидів, з викорисклітини рослини (наприклад, протопласту або екстанням секреторних або імпортних засобів, де плантату рослини). використовують природну, синтетичну або гетероРослини, що стабільно зберігаються в пластилогічну націлюючу на пластиду або хлоропласт ді або хлоропласті стосується введення за допопептидну послідовність, яка функціонує для націмогою електропорації, трансформації, трансдукції лювання, інсертування, сприяння перенесенню або міцело- або ліпосомо-подібного злиття полінуабо локалізації пов'язаного поліпептиду в хлороклеотиду або нуклеїнової кислоти в хлоропласт пласт або пластиду. або пластиду таким чином, що ця нуклеїнова кисБоротьба або контроль відносно пошкодження лота залишається в реципієнтних хлоропласті або комахами в сільськогосподарському контексті стопластиді і у всьому подальшому потомстві реципісується зниження пошкодження сільськогосподарєнтних хлоропласту або пластиди або за допомоської культури, що викликається зараженням когою включення рекомбінацією в геном- хлоропласмахою-шкідником. Більш звичайно, ця фраза ту або пластиди, або у вигляді ковалентно стосується зменшення шкідливих ефектів, що випов'язаного кільцевого реплікону, що знаходиться кликаються присутністю небажаної комахи в будьв хлоропласті або пластиді, за допомогою вироякому конкретному місцеположенні. щування будь-якої рослини, клітини рослини або Подія стосується трансгенної рослини, отритканин рослини, що містить такі трансформовані маної з введення чужорідної ДНК в один або декіхлоропласт або пластиду, і в присутності хімікалію лька унікальних сайтів в ядерній геномній ДНК. або сполуки, яка вимагає одного або декількох Експресія: Комбінація внутрішньоклітинних генів, присутніх на репліконі і експресованих репліпроцесів, в тому числі транскрипції, трансляції і коном, для гарантії виживання трансформованих інших функцій процесингу і стабілізації внутрішпластиди або хлоропласту і їх потомства пластид ньоклітинного білка і РНК, яких зазнає кодуюча або хлоропластів в рослині, клітини рослини або молекула ДНК, така як структурний ген, для продутканин рослини. кування поліпептиду. Структурна кодуюча послідовність означає поІнсектицидний поліпептид стосується поліпепслідовність ДНК, яка кодує пептид, поліпептид або тиду, що має інсектицидні властивості, наприклад, білок,, який продукується клітиною після транскриполіпептиду, який інгібує зростання, розвиток, житпції структурної кодуючої послідовності в месентєздатність або плодючість комах-шкідників, що є джер-РНК (мРНК), з подальшою трансляцією цієї мішенями. мРНК в бажаний пептидний, поліпептидний або 23 75570 24 білковий продукт. ніпуляції. Це включає в себе виділення гена з стаСтруктурний ген: Ген, який експресується з ну, що природно зустрічається, маніпулювання утворенням поліпептиду. цим геном, таке як модифікація кодонів (як описаІстотна гомологія: В застосуванні тут цей терно тут) або сайт-специфічний мутагенез (як описамін означає послідовності нуклеїнової кислоти або но тут), скорочення гена або будь-який інший спополіпептиду, які є на приблизно 86% гомологічнисіб маніпуляції або виділення. ми, до приблизно 90% гомологічними, до приблизТермінатор: 3'-кінцева послідовність термінації но 95% гомологічними, до приблизно 99% гомолотранскрипції і поліаденілювання. гічними. Більш конкретно, автори вважають, що Трансформація: Спосіб введення екзогенної істотні гомологи с до приблизно 86, 87, 88, 89, 90, послідовності ДНК (наприклад, вектора або реко91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 і 99 процентів гомоломбінантної молекули ДНК) в клітину або протогічними посилальній послідовності нуклеїнової пласт, в яких ця екзогенна ДНК включається в кислоти поліпептиду. хромосому або здатна до автономної реплікації. Істотна тимчасова або просторова регуляція Трансформована клітина: Клітина, яка була стосується експресії гена в рослині або тканині змінена введенням однієї або декількох молекул рослини від функціонального в рослині промотору. ДНК в цю клітину. В разі тимчасової регуляції, промотор може регуТрансген: Генна конструкція або сегмент ДНК, люватися для експресії тільки під час специфічних що містить ген, який бажано експресувати в рециперіодів часу під час зростання і розвитку клітини пієнтних клітині, тканині або організмі. Він може рослини або тканини рослини або навіть цілої ровключати в себе цілу плазміду або інший вектор слини. Промотор, який активно експресує один або може просто включати в себе функціональну або декілька генів під час проростання насіння, кодуючу дільницю, район, домен або сегмент пеможе бути одним з прикладів тимчасової регуляції. реносимої конструкції ДНК. Інший приклад міг би включати промотори, які акТрансгенна клітина: Будь-яка клітина, отримативно експресують один або декілька генів тільки в на або регенерована з трансформованої клітини періоди часу, коли рослина, клітина рослини або або що походить з трансгенної клітини. Приклади тканина рослини експоновані певній інтенсивності трансгенних клітин включають в себе калуси россвітла або під час повної темряви. Істотна тимчалин, що походять з трансформованої клітини россова регуляція має внаслідок промотор, який актилини, і конкретні клітини, такі як клітини листа, ковно експресується в певний час, але який може реня, стебла, наприклад, соматичні клітини або бути або може не бути пригніченим в інші періоди репродуктивні (зародкові) клітини, отримані з трачасу, так що експресія може все ще детектуватись нсгенної рослини. моніторингом на присутність будь-якого індикатоТрансгенна подія: Рослина або його потомстра, такого як фермент, продукований з кодуючої во, отримана з введення чужорідної ДНК в ядерпослідовності, пов'язаної з таким промотором, або ний геном клітини або протопласту рослини. шляхом вимірювання збільшення або зменшення Трансгенна рослина: Рослина або її потомстдеякого продукту гена, такого як мРНК, продуковаво, яке було генетично модифіковане таким чином, ного в різні періоди часу під час всього зростання, що воно містить і експресує гетерологічні послідодиференціювання і розвитку рослини і/або у відповності ДНК у вигляді білків. Як конкретне приведевідь на різні стимули навколишнього середовища. ного тут прикладу, трансгенну рослину сої генетиІстотна просторова регуляція означає експресію чно модифікують таким чином, що вона містить і гена, пов'язаного з промотором, від якого експреекспресує щонайменше одну гетерологічну послісія протікає тільки під час зростання і розвитку довність ДНК, функціонально пов'язану з регуляпевних клітин або тканин в даній рослині. Наприторними послідовностями транскрипції і що знахоклад, можна було б чекати, що тапетальний продиться під регуляторним контролем регуляторних мотор є експресованим тільки в клітинах кореня послідовностей транскрипції, які функціонують в або тканинах кореня. Істотно просторово регульоклітинах або тканинах рослини або в цілих росливаний означає також рівень експресії від специфінах. Трансгенна рослина може також називатися чного промотору конкретної тканини в цій конкреттрансформованою рослиною. Трансгенною рослиній тканині в порівнянні з рівнями експресії від ною також називають потомство початкової трансцього або подібного промотору в інших тканинах, генної рослини, коли це потомство містить і здатне причому експресія може також детектуватися в експресувати гетерологічну кодуючу послідовність тканинах інших, чому ця конкретна тканина, в якій під регуляторним контролем експресованих в росекспресія даного промотору є переважною, але лині описаних тут регуляторних послідовностей при значно більш низьких рівнях експресії, як витранскрипції. міряно за продукуванням ферменту, що продукуВектор: Молекула ДНК, здатна реплікуватися в ється з кодуючої послідовності, пов'язаної з цим клітині-господарі, і/або молекула ДНК, з якою може промотором, або по появі будь-якого детектованобути функціонально пов'язаний інший сегмент ДНК го генного продукту. Промотори можуть бути також таким чином, щоб сталася реплікація цього пов'яістотно часово або істотно просторово регульовазаного сегмента. Прикладом вектора є плазміда. ними разом і одночасно координовано регульова4.3 СИНТЕЗ І ВИДІЛЕННЯ СЕГМЕНТА НУКЛЕним чином. ЇНОВОЇ КИСЛОТИ. ЩО КОДУЄ δ-ЕНДОТОКСИН В. Синтетичний ген: Синтетичні гени, що кодують THURINGIENSIS І НАЦІЛЮЮЧІ НА ПЛАСТИДИ δ-ендотоксини В. thuringiensis даного винаходу, є ПОСЛІДОВНОСТІ генами, що отримуються способом, що включає в Даний винахід описує нові конструкції ДНК, що себе будь-який їм генетичного виділення або мамістять полінуклеотидні послідовності, що кодують 25 75570 26 δ-ендотоксини В. thuringiensis, а також що націлюID NO: 1, або послідовності, які комплементарні ють на пластиди послідовності. Способи конструщонайменше відрізку з 14-30 нуклеотидів або приювання і експресії синтетичних генів В. близно такої довжини послідовності, що кодує той, thuringiensis в рослинах добре відомі особам із націлюючий на пластиди пептид, такий як показані звичайною кваліфікацією в даній області і описані в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 і SEQ детально [в патенті США 5500365]. Даний винахід ID NO: 9. розглядає застосування генів Cry2А В. thuringiensis Розмір щонайменше 14 нуклеотидів в довжину в трансформації як однодольних, так і дводольних допомагає гарантувати, що цей фрагмент буде рослин. Для потенціювання експресії цих генів фрагментом достатньої довжини для утворення даний винахід забезпечує конструкції ДНК, що місдуплексної молекули, яка є як стабільною, так і тять полінуклеотидні сегменти, що кодують, націселективною. Молекули, що мають комплементалюючі на пластиди пептиди, розташовані вище по рні послідовності протягом сегментів, більших, ніж ходу транскрипції (зліва) від полінуклеотидних 14 основ в довжину, звичайно є переважними. Для послідовностей, що кодують цільові δ-ендотоксини збільшення стабільності і селективності гібрида і В. thuringiensis. Зокрема, розглядаються послідовтаким чином поліпшення якості і міри отриманих ності, кодуючі δ-ендотоксини В. thuringiensis, позгібридних молекул, звичайно вважають за краще бавлені по суті інгібіторної активності проти видів конструювати молекули, що мають комплементарDiptera. ні гена послідовності з 14-20 нуклеотидів або на4.4 Зонди і праймери віть більш довгі, якщо бажано. Такі фрагменти В одному аспекті, інформація про нуклеотидні можуть бути легко отримані, наприклад, прямим послідовності, забезпечена даним винаходом, синтезом фрагмента хімічними способами, з викодозволяє отримувати відносно короткі послідовнористанням технології репродукції нуклеїнових киссті ДНК, здатні специфічно гібридизуватися з послот, такий як ПЦР™ технологія [патентів США лідовностями генів описаних тут вибраних поліну4683195 і 4683202] (кожний з яких включений тут клеотидів. В цих аспектах, зонди нуклеїнових як посилання), або вирізуванням вибраних фрагкислот відповідної довжини готують з урахуванням ментів ДНК з рекомбінантних плазмід, що містять вибраних полінуклеотидних послідовностей, що відповідні інсерти і відповідні сайти рестрикції. кодують поліпептиди δ-ендотоксину CryА, напри4.5 Експресуючі вектори клад, такої послідовності, яка показана в SEQ ID Даний винахід розглядає також експресуючий NO: 1. Ці зонди нуклеїнових кислот можуть бути вектор, що містить полінуклеотид даного винахотакож приготовані з урахуванням вибраних полінуду. Таким чином, в одному варіанті експресуючий клеотидних послідовностей, що кодують, націлювектор є виділеною і очищеною молекулою ДНК, ючий на пластиди пептид, таких як послідовності, що містить промотор, функціонально пов'язаний з показані в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID кодуючою послідовністю, яка кодує поліпептид NO: 7 і SEQ ID NO: 9. Здатність таких зондів нукледаного винаходу, причому кодуючий район функїнових кислот специфічно гібридизуватися з посліціонально пов'язаний з районом термінації транскдовністю гена, що кодує поліпептид δ-ендотоксину рипції, за допомогою чого цей промотор запускає або послідовність націлюючого на пластиди пептранскрипцію даного кодуючого району. Кодуючий тиду, робить їх конкретно застосовними в різних район може включати в себе сегмент, що кодує δваріантах. Найбільш важливо те, що ці зонди моендотоксин В. thuringiensis, і сегмент, що кодує жуть бути використані в численних тестах для депластидний націлюючий пептид. Молекула ДНК, тектування присутності комплементарної послідощо містить експресуючий вектор, може також місвності в конкретній пробі. тити функціональний інтрон. В деяких варіантах, переважно використати В застосуванні тут, терміни "функціонально олігонуклеотидні праймери. Послідовності таких (оперативно) пов'язані" або "операбельно пов'язапраймерів сконструйовані з використанням полінуні" означають, що промотор пов'язаний з кодуюклеотиду даного винаходу для застосування в дечим районом таким чином, що транскрипція даного тектування, ампліфікації або мутації певного сегкодуючого району справляється і регулюється дамента гена кристалічного білка з В. thuringiensis з ним промотором. Способи функціонального скріпвикористанням ПЦР™ технології. Цей спосіб може лення промотору з кодуючим районом для регулябути використаний для детектування, ампліфікації ції як вище по ходу транскрипції, так і нижче по або мутації певного сегмента полінуклеотиду, що ходу транскрипції від того, кодуючого району добкодує, націлюючий на пластиди пептид. Сегменти ре відомі в даній області. генів, родинні полінуклеотидум, що кодує поліпепПереважні трансформуючі вектори рослин тиди δ-ендотоксину і націлюючі на пластиди пепвключають в себе вектори, вироблені з Ті-плазміди тиди, даного винаходу можуть бути також ампліфіAgrobacterium tumefaciens, а також описані, [наковані за допомогою ПЦР™ з використанням таких приклад, Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee праймерів. (1985) і Eur. Pat. Appi. No. EP 0120516] (всі вклюДля забезпечення деяких переваг у відповідчені спеціально як посилання). ності з даним винаходом, переважна послідовність Промотори, які функціонують в бактеріях, добнуклеїнової кислоти, що використовується для ре відомі в даній області. Приклади і переважні гібридизаційних досліджень або аналізів, включає промотори для кристалічних білків В. thuringiensis в себе послідовності, які комплементарні щонайвключають в себе промотори генів sigA, sigE і sigK. менше відрізку з 14-30 нуклеотидів або приблизно Альтернативно, можуть бути використані самі такої довжини полінуклеотидної послідовності, що промотори генів, що кодують нативні, мутагенізокодує кристалічний білок, такий як показано в SEQ вані, гетерологічні або рекомбінантні кристалічні 27 75570 28 білки. лювання призводить до невеликого збільшення При використанні експресуючого вектора даабо до відсутності збільшення експресії Cry1Ас ного винаходу для трансформації рослини, виби[патент США №5500365]. Інше повідомлення покарають промотор, який здатний запускати експрезало, що збільшення експресії націленої на плассію у даному конкретному вигляді рослини. тиди форми Cry1Ac вимагало включення нової 5'Промотори, які функціонують в різних видах роснетрансльованої лідерної послідовності (Wong et лин, також добре відомі в даній області. Промотоal., 1992) і що дія лідерної і націлюючої послідоври, застосовні в експресії поліпептидів в рослинах, ностей на експресію сильно залежало від кодуючої є промоторами, які є індуцибельними, вірусними, послідовності структурного гена. Wong et al., зросинтетичними або конститутивними, [як описано били висновок, що як лідерна послідовність, так і Odell et al., 1985], і/або регульованими у часі, пропластидний трансзитний пептид збільшували екссторово регульованими і просторово і у часі регупресію Cry1Ас в 18 разів, але ті ж самі послідовнольованими. Переважні промотори включають в сті збільшували експресію β-глюкуронідази тільки себе посилені промотори CaMV35S і промотор в 6 разів. Нарешті, жодне з попередніх повідомFMV35S. лень не передбачало, що націлювання на пласти4.5.1 Вектори з, кодуюючими, що націлюючий ди могло б призводити до збільшеного виходу на пластиди пептид сегментами морфологічно нормальних експресуючих В. Згідно із даним винаходом, експресуючі вектоthuringiensis рослин. ри, сконструйовані для специфічного потенціюДаний винахід описує, що трансгенні рослини вання експресії поліпептиду в трансформованій кукурудзи, експресуючі δ-ендотоксини Cry2А, неарослині, можуть включати в себе певні райони, що ктивні у відношенні Diptera, такі як Cry2Аb, при кодують, націлюючі на пластиди пептиди (РТР). Ці рівнях до в 10 раз більш високих, ніж що вимагарайони дозволяють повністю використати клітинні ються для боротьби з ЕСВ, отримували морфолопроцеси, що беруть участь в транскрипції, трансгічно при значно більш високих частотах при виколяції і експресіях білка, що кодується, при зв'язку з ристанні націленою на пластиди форми Cry2А. В певними δ-ендотоксинами В. thuringiensis. Такі випадку Cry2Аb, підвищена експресія є що вирішує націлюючі на пластиди пептиди функціонують різв отриманні трансгенної кукурудзи із захистом ним чином, таким як, наприклад, перенесенням проти ЕСВ, оскільки LC50 Cry2Ab проти ЕСВ є знаекспресованого білка в клітинну структуру, в якій чно більш високою, ніж LC50 ЕСВ Cry2Аb В. він може ефективно функціонувати, або перенеthuringiensis, що використовується в цей час для сенням експресованого білка до зон клітини, в боротьби з ЕСВ в трансгенній кукурудзі [патент яких сконцентровані клітинні процеси, необхідні США 5338544, 1994; Macintosh et al., 1990; для його експресії. Armstrong et al., 1995]. Використання РТР може також збільшувати Збільшена експресія є особливо цінною в зв'ячастоту відновлення морфологічно нормальних зку з тим, що вона забезпечує додатковий захист рослин і частоту, з якою можуть бути отримані проти розвитку резистентності через стратегію трансгенні рослини. При умові, що комерційно високих доз (McGaughey and Whalon, 1993; Roush, життєздатна експресія δ-ендотоксинів як типу 1994). Експресія високого рівня бажана, крім того, Cry1A, так і типу Cry3А В. thuringiensis досягалася тому, що вона забезпечує стійкий (тривалий) заекспресією форм цих білків, які залишаються лохист від комах у випадках, коли експресія інсектикалізованими в цитозолі (тобто в ненаціленій фоцидного гена знижується внаслідок умов навколирмі), експресію ненацілених форм як Cry2Aa, так і шнього середовища. Додатково і несподівано, Cry2Аb також спочатку намагалися використати в рослини кукурудзи, трансформовані націленими трансгенних бавовні, тютюні і кукурудзі. на пластиди експресуючими Cry2Аb векторами, В кукурудзі, ненацілені експресуючі Cry2Аb виявляли нормальні зростання і розвиток. трансформуючі вектори дали відносно мало транЗначущою відмінністю між націленою і ненацісгенних подій (тобто незалежних подій інсерції в леною (цитозольною) експресією Cry2Аb було геном кукурудзи) з рівнями експресії Cry2Аb, досдраматичне збільшення рівнів білка Cry2Аb в ростатніми для комерційно прийнятного контролю линах, трансформованих націленим на пластиди комах. Крім того, багато які з трансформантів куCry2Аb експресуючим вектором відносно рослин, курудзи, експресуючі ненацілений Cry2Аb, виявлятрансформованих цитозольним вектором Cry2Аb. ли явні дефекти зростання, такі як серйозне зменЦей результат був дуже несподіваним. Також в шення в зростанні (затримка зростання) або протилежність описам попередньої роботи, даний сильне пожовтіння листя (хлороз), яке робило ровинахід виявив, що збільшений вихід фенотипічно слини комерційно неприйнятними. Рівні експресії нормальних трансгенних рослин може бути досягненаціленого Cry2Аb в кукурудзі були не вище нутий з використанням описаних способів націлеприблизно 15м.д. від рівня, мінімально необхідноною на пластиди експресії. го для опосередкованого Cry2Аb захисту" від меПрикладом націлюючого на плазміди пептиду телика кукурудзяного (ЕСВ). (РТР) є пептид хлоропластного націлювання. Було Хоч були описані дослідження, що включають виявлено, що пептиди хлоропластного націлюванв себе експресію націлених на пластиди δня застосовні, зокрема, в системі гліфозатендотоксинів типу Cry1A В. thuringiensis в трансрезистентного селектованого маркера. В цій сисгенних рослинах (Wong et al, 1992), націлювання темі, рослини, трансформовані для експресії білка, негомологічних білків Cry2А або Cry2А не було що додає стійкість до гліфозату, трансформують раніше описане. Одне повідомлення про націлену РТР, який націлює цей пептид на хлоропласти на пластиди експресії Cry1Ac показало, що націклітини. Гліфозат інгібує шляхи шикимової кисло 29 75570 30 ти, які ведуть до біосинтезу ароматичних сполук, в транскрипції мРНК з використанням одного з лантому числі амінокислот і вітамінів. Конкретно, гліцюгів цієї ДНК як матриця для утворення відповідфозат інгібує перетворення фосфоенолпіровиногного ланцюга РНК. Конкретний вибраний промотор радної кислоти і 3-фосфопгикимовой кислоти в 5повинен бути здатний індукувати достатню ексенолпірувіл-3-фосфошикимову кислоту шляхом пресію кодуючої фермент послідовності для отриінгібування ферменту синтази 5-енолпирувіл-Змання продукування ефективної інсектицидної фосфошикимової кислоти (ЕРЗР-синтази або кількості білка В. thuringiensis. EPSPS). Додаткова EPSPS, що утворилась через 3'-нетрансльований район химерних генів росвведення трансгену, що кодує цей фермент, долин, за даним винаходом також містить сигнал зволяє клітині протистояти дії гліфозату. Таким поліаденілювання, який функціонує в рослинах, чином, коли гербіцид гліфозат діє, вбиваючи дану спричиняючи приєднання аденілатнуклеотидів до клітину шляхом переривання біосинтез ароматич3'-кінця цієї РНК. Прикладами переважних 3'них амінокислот, зокрема, в хлоропласті цієї клітирайонів є (1) 3'-транскрибовані, нетрансльовані ни, РТР дозволяє збільшити стійкість до цього герайони, що містять сигнал поліаденілювання індурбіциду шляхом зосередження експресії ферменту куючих пухлину (Ті) плазмідних генів стійкості до гліфозату в хлоропласті клітини, тобто Agrobacterium, таких як ген нопалінсинтази (NOS), в органелі-мішені даної клітини. Приклади фермеі (2) 3'-кінці генів рослин, таких як ген Е9 нтів стійкості до гербіциду включають в себе ssRUBISCO гороху (Fischhoff et al., 1987). ESPS, як зазначалось вище, гліфозатоксидоредукПромотор вибирають за його здатністю напратазу (GOX) і ген аrоА [див. патент США вляти транскрипційну активність трансформованої №4535060], спеціально включений тут в повному клітини рослини або трансгенної рослини на кодувигляді як посилання. ючий район для гарантії достатньої експресії коРТР можуть націлювати білки на хлоропласти і дуючої фермент послідовності для отримання інші пластиди. Наприклад, органелою-мішенню продукування інсектицидних кількостей білка В. може бути амілопласт. Переважні РТР даного виthuringiensis. Структурні гени можуть запускатися находу включають в себе РТР націлювання як на різними промоторами в тканинах рослин. Промохлоропласти, так і на інші пластиди. Характерні тори можуть бути майже конститутивними (тобто приклади переважних РТР включають в себе РТР вони управляють транскрипцією трансгену у всіх білка RUBISCO SSU кукурудзи і функціонально тканинах), такі як промотор CaMV35S, або тканесродинні пептиди, такі як РТР1, РТРА і РТР2. Прикпецифічними або специфічними для певної стадії ладами цих РТР є поліпептиди, показані в SEQ ID розвитку промоторами, діючими в дводольних або NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: однодольних рослинах. Якщо промотор є майже 10. Полінуклеотідні послідовності, що кодують ці конститутивним промотором, таким як CaMV35S поліпептиди, показані в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: або FMV35S, збільшення в експресії поліпептиду 5, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 9. виявляються в різноманітних трансформованих Могли б бути також отримані рекомбінантні тканинах рослини і в більшості органів рослини рослини, клітини, насіння і інші тканини рослин, в (наприклад, калусі, листі, насінні і корені). Посилеяких тільки мітохондріальна або хлоропластна ні або дуплікатні версії промоторів CaMV35S і ДНК змінена включенням молекул, що розглядаFMV35S є особливо застосовними у використанні ються в цій заявці. Промотори, які функціонують в на практиці даного винаходу [Kay et al., 1987; хлоропластах, були відомі в даній області [HanleyRogers, U.S. Patent 5378619]. Bowden et al.. Trends in Biochemical Sciences 12:67Фахівцям з кваліфікацією в даній області буде 70, 1987]. Способи і композиції для отримання зрозуміло, що є ряд промоторів, які активні в кліклітин, що містять хлоропласти, в які була вбудотинах рослин, і вони були описані в літературі. Такі вана гетерологічна ДНК, [були описані Daniell et промотори можуть бути отримані з рослин або al., U.S. Pat: No.5693507 (1997)]. McBride et al., вірусів рослин і включають в себе, але не обме[WO 95/24492] описують локалізацію і експресію жуються ними, промотори нопалінсинтази (NOS) і генів, що кодують білок δ-ендотоксин Cry1A, в октопінсинтази (OCS) (які знаходяться на тих, що хлоропластних геномах рослин тютюну. Як описаіндукують пухлину плазмідах A. tumefaciens), проно тут, локалізація Cry2Aa в хлоропласті або пласмотори 19S і 35S віруси мозаїчної хвороби цвітної тиді призводить до знижених рівнів експресії, як капусти (CaMV), що індукується світлом промотор виміряна по накопиченню δ-ендотоксину Cry2Aa, з малої суб'одиниці рібулозо-1,5що суперечить поліпшеній експресії локалізованобисфосфаткарбоксилази (ssRUBISCO, дуже рясго в хлоропласті або пластиді δ-ендотоксину ного поліпептиду рослин), промотор ActI рису і Cry2Аb. промотор 35S вірусу мозаїчної хвороби (FMV) но4.5.2 Застосування промоторів в експресуючих річнику шишковатого. Все ці промотори викорисвекторах тали для створення різних типів конструкцій ДНК, Експресія гена, який існує в формі двохланцюяких експресували в рослинах [див., наприклад, гових ДНК, включає в себе транскрипцію месенMcElroy et al., 1990, U.S. Patent 5463175]. джер-РНК (мРНК) з кодуючого ланцюга цієї ДНК Крім того, можна також переважно викликати РНК-полімеразним ферментом і подальший проекспресію δ-ендотоксину В thuringiensis в специфіцесинг первинного транскрипту мРНК в ядрі. Транчних тканинах рослини з використанням векторів, скрипція ДНК в мРНК регулюється районом ДНК, що інтегруються в рослину, що містять тканеспезвичайно званим "промотором". Район промотору цифічний промотор. Специфічні тканини-мішені містить послідовність основ, яка передає сигнал можуть включати в себе лист, стебло, корінь, буРНК-полімеразі для скріплення з ДНК і ініціація льбу, насіння, плід і т.ін., а вибраний промотор 31 75570 32 повинен мати бажану тканеспеціфичність або спеПромотори що використовується в конструкціцифічність відносно стадії розвитку. Таким чином, ях ДНК даного винаходу можуть бути модифіковафункція промотору повинна бути оптимізована ні, якщо бажано, для впливу на їх регуляторні хавибором промотору з бажаною здатністю експресії рактеристики. Наприклад, промотор CaMV35S в певній тканині і відповідною силою промотору і може бути ліговано з частиною гена ssRUBTSCO, відбором трансформанту, який продукує бажану який придушує експресію ssRUBISCO у відсутності інсектицидну активність в цих тканинах-мішенях. світла, для створення промотору, який є активним Цей підхід селекції з пулу трансформантів рутинно в листі, але не в корінні. Отриманий химерний використовується в експресії гетерологічних струкпромотор може бути використаний, як описано тут. турних генів в рослинах, оскільки існує варіація між Для цілей даного опису, фраза "промотор трансформантами, що містять один і той же гетеCaMV35S" включає в себе, отже, варіації проморологічний ген внаслідок сайта інсертування гена тору CaMV35S, наприклад, промотори, отримані в геномі рослини (звичайно звана "ефектом пололігуванням з операторними районами, випадковим ження"). Крім промоторів, про яких відомо, що воабо регульованим мутагенезом і т.ін. Крім того, ці ни індукують транскрипцію (конститутивну або ткапромотори можуть бути змінені для змісту "енханнеспецифічну) ДНК в клітинах рослини, інші серних послідовностей" для сприяння підвищенню промотори можуть бути ідентифіковані для викоекспресії гена. Приклади таких енхансерних посліристання в справжньому винаході за допомогою довностей повідомлялися Kay et al., (1987). Хлоскринінгу бібліотеки кДНК рослин для генів, які ропластні і пластидні промотори відомі в даній селективно або переважно експресуються в ткаобласті ([Daniell et al., US Pat. No. 5693507]; вклюнинах-мішенях, з подальшим визначенням районів чений тут як посилання), наприклад, промотори, промоторів. отримані з хлоропластних генів, таких як ген psbA Прикладом тканеспецифічного промотору є зі шпинату або гороху, rbcL і промоторний район промотор лектину, який є специфічним для тканиatpB з кукурудзи і промотори рРНК. Будь-який фуни насіння. Лектиновий білок в сім'ї сої кодується нкціональний в хлоропластах або пластидах проєдиним геном (Lei), яким експресується тільки під мотор знаходиться в рамках даного винаходу. час дозрівання насіння і відповідальний за прибРНК, продукована конструкцією ДНК даного лизно 2 - приблизно 5% загальної мРНК насіння. винаходу, також містить 5'-нетрансльовану лідерГен лектину і специфічний для насіння промотор ну послідовність. Ця послідовність може бути були повністю охарактеризовані і. використовувазроблена з промотору, вибраного для експресії лися для запуску специфічної для насіння експрегена, і може бути специфічно модифікована для сії в трансгенних рослинах тютюну (Vodkin et al., збільшення трансляції цієї мРНК. 5'1983; Lindstrom et al., 1990). Експресуючий вектор, нетрансльовані райони можуть бути також отрищо містить кодуючий район, який кодує пептид, що мані з вірусних РНК, з відповідних еукаріотичних представляє інтерес, може бути сконструйований генів або з синтетичної генної послідовності. Датаким чином, що він знаходиться під контролем ний винахід не обмежується конструкціями, в яких промотору лектину, і цей вектор може бути введенетрансльований район зроблений з 5'ний в рослини з використанням, наприклад, спонетрансльованой послідовності, яка супроводжує собу трансформації протопластів (Dhir et al., 1991). промоторну послідовність. Як показано нижче, Потім експресія цього поліпептиду буде прямувати лідерна послідовність гена рослини, яка застосовспецифічно в насіння даної трансгенної рослини. на в даному винаході, є лідером білка 70 тепловоТрансгенна рослина даного винаходу, отримаго шоку петунії (hsp70) (Winter et al., 1988). на з клітини рослини, трансформованої тканеспеПриклад варіанту даного винаходу включає в цифічним промотором, може бути схрещена з друсебе амінокислотну послідовність В. thuringiensis гою трансгенною рослиною, отриманою з клітини пластидного націлювання або пластидної локалірослини, трансформованої специфічним для іншої зації. Послідовності пластидного націлювання бутканини промотором, для отримання гібридної ли виділені з численних генів ядерно-кодованих трансгенної рослини, яка виявляє ефекти трансрослин, і було показано, що вони управляють імформації в більш, ніж однієї, специфічній тканини. портом цитоплазматично синтезованих білків в Іншими прикладами тканеспецифічних промопластиди (огляд в Keegstra and Olsen, 1989). Веторів є промотори сахарозосинтази 1 кукурудзи лика кількість послідовностей пластидного наці(Yang et al., 1990), алкогольдегідрогенази 1 кукулювання, добре відомі в даній області, в тому чисрудзи (Vogel et al., 1989), світлозбираючого комлі, але не тільки, ADPGPP, ЕРЗР-синтаза або плексу кукурудзи (Simpson, 1986), хітшокового білssRUBISCO, можуть бути використані в застосука кукурудзи (Odell et al., 1985), малої суб'одиниці ванні на практиці даного винаходу. В альтернатиРБФ-карбоксилази гороху (Poulsen et al., 1986; вних переважних варіантах послідовності пластиCashmore et al., 1983), манопінсинтази Ті-плазміди дного націлювання (пептид і нуклеїнова кислота) (McBride and Summerfelt, 1989), нопалінсинтази Тідля однодольних культур можуть складатися з плазміди (Langridge et al., 1989), халконізомерази геномного кодуючого фрагмента, що містить поспетунії (Van Tunen et al., 1988), багатого гліцином лідовність інтрону, а також подвоєний сайт протебілка 1 квасолі (Keller et al.,1989), CaMV35Sолітичного розщеплення в кодованих послідовностранскрипту (Odell et al., 1985) і пататину картоплі тях, пластидного націлювання. (Wenzler et al., 1989). Переважними промоторами Найбільш переважна послідовність нуклеїноє промотор вірусу мозаїки цвітної капусти вої кислоти, звана тут zmSSU PTP (SEQ ID NO: 3), (CaMV35S) і промотор малої суб'одиниці РБФяка складається з геномного кодуючого фрагменкарбоксилази S-E9. та, що містить послідовність інтрону, а також под 33 75570 34 воєний сайт протеолітичного розщеплення в посструктурами, схожими з rho-залежними послідовлідовностях, що кодуються, пластидного націлюностями. вання, була зроблена з послідовності пластидного Конструкції звичайно будуть включати в себе націлювання zmSl (Russel et al., 1993). Пряме траген, що представляє інтерес, разом із 3'-кінцевою нсляційне злиття пептидної послідовності zmSSU послідовністю ДНК, яка діє як сигнал термінації PTP (SEQ ID NO: 4) з аміно-кінцем цих послідовтранскрипції і, в конструкціях, призначених для ностей застосовні в отриманні підвищених рівнів експресії в ядерному геномі, робить можливим цього поліпептиду в трансгенній кукурудзі. Злиття поліаденілювання отриманої мРНК. Передбачав рамці прочитання послідовності нуклеїнової кисється, що найбільш переважними 3'-елементами є лоти zmSSU PTP (SEQ ID NO: 3) з геном Cry2Ab елементи з гена нопалінсинтази A. tumefaciens (3'(SEQ ID NO: 1) можуть виконуватися лігуванням кінець nos) (Bevan et al., 1983), термінатор для Т7сайта Ncol при 3'(С-кінцеве кодування) кінці послітранскріпта з гена октопінсинтази A. tumefaciens і довності zmSSU РТР з 5'-NсоІ-сайтом (N-кінцеве 3'-кінець генів інгібітору протеази і і іі з картоплі і кодування) послідовності Cry2Аb. томата. Регуляторні елементи, такі як елемент Ω Переважна послідовність для дводольних куTMV (Gallie et al., 1989) можуть бути додатково льтур, звана тут РТР2 (SEQ ID NO: 9), складається включені, якщо бажано. з геномного кодуючого фрагмента, що містить по4.5.5 Інші посилюючі експресію елементи слідовність пептиду хлоропластного націлювання з Іншим типом елемента, який може регулювати гена EPSP-синтази Arabidopsis thaliana, в якій сайт експресію генів, є послідовність ДНК між сайтом відщеплення транзитного пептиду ssRUBISCO ініціації транскрипції і початком кодуючої послідоРТР замінює нативний сайт відщеплення РТР вності, звана лідерною нетрансльованою послідоEPSP-синтази (Klee et al., 1987). вністю. Лідерна послідовність може впливати на Як зазначалось вище, 3'-нетрансльований раекспресію генів. Можуть бути зроблені компіляції йон химерних генів рослин даного винаходу міслідерних послідовностей для прогнозування оптитить сигнал поліаденілювання, який функціонує в мальних або субоптимальних послідовностей і рослинах, спричиняючи приєднання аденілатнукгенерування "консенсусних" і переважних лідерних леотидів до 3'-кінця РНК. Прикладами переважних послідовностей (Joshi, 1987). Передбачається, що 3'-районів є (1) 3'-транскрибовані, нетрансльовані переважні лідерні послідовності включають в себе райони, що містять сигнал поліаденілювання індуті послідовності, які містять послідовності, відноскуючих пухлину (Ті) плазмідних генів но яких передбачене, що вони управляють оптиAgrobacterium, таких як ген нопалінсинтази (NOS), мальною експресією пов'язаного структурного геі (2) гени рослин, такі як ген Е9 ssRUBISCO гороху на, тобто включають в себе переважну (Fischhoff et al., 1987). консенсусну лідерну послідовність, яка може збі4.5.3 Застосування інтронів в експресуючих льшувати або підтримувати стабільність мРНК і векторах запобігати невідповідній ініціації трансляції. Вибір Для оптимізованої експресії в однодольних таких послідовностей буде відомий для фахівців в рослинах в експресійну конструкцію ДНК може даній області в світлі даного опису. Послідовності, бути включений також інтрон. Такий інтрон звизроблені з генів, які експресуються на високому чайно розташований поблизу 5'-кінця мРНК в нерівні в рослинах, зокрема, в кукурудзі, будуть найтрансльованій послідовності. Інтрон міг би бути більш переважними. Одним з особливо цінних отриманий з, але не тільки, ряду інтронів, що лідерів може бути лідер HSP70 петунії. складаються з інтрона білка 70 теплового шоку Енхансери транскрипції або дуплікації енхан(HSP) [патент США 5424412; 1995], інтрона Acti серів могли б бути використані для збільшення рису (McElroy et al., 1990), інтрона 1 Adh (Callis et експресії. Ці енхансери часто виявляються 5' (зліal., 1987) або інтрона сахарозосинтази (Vasil et al., ва) від початку транскрипції в промоторі, що функ1989). Як показано тут, інтрон HSP70 кукурудзи є ціонує в еукаріотичних клітинах, але часто можуть застосовуваним в даному дослідженні. бути вбудовані в прямій або зворотній орієнтації 5' 4.5.4 ЗАСТОСУВАННЯ ТЕРМІНАТОРІВ В (зліва) або 3' (праворуч) від кодуючої послідовносЕКСПРЕСУЮЧИХ ВЕКТОРАХ ті. Приклади енхансерів включають в себе елемеРНК-полімераза транскрибує кодуючу послінти з промотору CaMV35S, генів октопінсинтази довність ДНК ядерного геному через сайт, в якому (Ellis et al., 1987), гена актину рису і промотору з має місце поліаденілювання. Звичайно, послідовеукаріот не-рослин (наприклад, дріжджів; Ma et al., ності ДНК, локалізовані на декілька пар основ ни1988). жче по ходу транскрипції (праворуч) від сайта по4.5.6 Мультигенні векторні конструкції і IRES ліаденілювання, служать для термінації В деяких варіантах даного винаходу, використранскрипції. Ці послідовності ДНК називають тут тання елементів внутрішніх сайтів скріплення рирайонами термінації транскрипції. Ці райони потрібосом (IRES) застосовують для створення мультибні для ефективного поліаденілювання транскригенних або поліцистронних матриць. IRESбованої месенджер РНК (мРНК). Для кодуючих елементи здатні обійти модель рибосомного скапослідовностей, введених в хлоропласт або пласнування залежною від 5'-метильованного кепу тиду, або в хлоропласт або пластидний геном, трансляції і починати трансляцію при внутрішніх термінація транскрипції мРНК однакова зі спососайтах (Pelletier and Sonenberg, 1988). Описані бами, добре відомими в області експресії бактеIRES-елементи з двох членів сімейства пікорнавірійних генів. Наприклад, в поліцистронній або морусів (поліомієліту і енцефаломіокардиту) (Pelletier ноцистронній послідовності транскрипція може and Sonenberg, 1988), а також IRES з матриці ссатермінуватися структурами тіпу "стебло-петля" або вця (Macejak and Sarnow, 1991). IRES-елементи 35 75570 36 можуть бути пов'язані з гетерологічними відкритивекторів [описані в патентах США 4971908, ми рамками прочитання. Множинні відкриті рамки 4940835, 4769061 і 4757011] (кожний з яких спеціпрочитання можуть транскрибуватися разом, кожально включений тут як посилання). Ці вектори на з яких відділена за допомогою IRES, створюючи можуть бути модифіковані для включення кодуюполіцистронні матриці. Завдяки IRES-елементу, чої послідовності Згідно із даним винаходом. кожна відкрита рамка прочитання доступна для Були розроблені різні способи для функціонарибосом для ефективної трансляції. Множинні льного скріплення ДНК з векторами через комплегени можуть ефективно експресуватися з викорисментарні липкі кінці або тупі кінці. Наприклад, комтанням єдиного промотору/енхансеру для транскплементарні гомополімерні дільниці можуть бути рибування єдиної матриці. приєднані до сегмента ДНК, який повинен бути Будь-яка гетерологічна відкрита рамка прочиінвертований, і до векторної ДНК. Потім ці вектор і тання може бути пов'язана з 1RES-елементами. сегмент ДНК сполучаються водневими зв'язками Це охоплює гени для секретованих білків, мультиміж комплементарними гомополімерними хвостасуб'одиничних білків, що кодуються незалежними ми з утворенням рекомбінантних молекул ДНК. генами, внутрішньоклітинних або мембранопов'яКодуючий район, який кодує поліпептид, здатзаних білків і селектованих маркерів. Таким шляний додавати інсектицидну активність клітині, пехом експресія декількох білків може бути одночасреважно є полінуклеотидом, що кодує δно сконструйована в клітині з використанням ендотоксин В. thuringiensis, або функціональним єдиної конструкції і єдиного селектованого мареквівалентом такого полінуклеотиду. Відповідно до кера. таких варіантів, кодуючий район, що містить посКонструкції, призначені для експресії із виколідовність ДНК SEQ ID NO: 1, є також переристання в хлоропласті або пластиді специфічного важним. апарату транскрипції і трансляції, можуть містити Специфічні кодуючі поліпептид δ-ендотоксину або моноцистронні, або поліцистронні посліВ. thuringiensis гени, які, як було показано, успішно довності. трансформують рослини в поєднанні з генами, що 4.5.7 Конструювання експресуючего вектора кодують пептид пластидного націлювання, для Вибір, який експресуючий вектор використати експресії δ-ендотоксинів В. thuringiensis при висоі, зрештою, з яким промотором потрібно зв'язати ких рівнях, є генами, що містяться в плазмідних функціонально кодуючий поліпептид район, залевекторах. Переважні плазміди, що місять послідожить безпосередньо від бажаних функціональних вність пластидного націлювання, включають в севластивостей, тобто локалізації і таймінгу експресії бе pMON30464, pMON33827, pMON33828, білка, і клітини-господаря, яка повинна бути транpMON33829. Ці плазміди кодуються послідовноссформована. Ці моменти є добре відомими обметями, показаними в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 13, женнями, властивими області конструювання реSEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15. Більш конкретно, комбінантних молекул ДНК. Однак, вектор, рослини можуть бути успішно трансформовані застосовний у використанні на практиці даного будь-яким вектором, що містить експресійні касевинаходу, здатний направляти експресію кодуючоти, що включають в себе нуклеотидні послідовносго поліпептид району, з яким він функціонально ті від нуклеотиду 1781 до нуклеотиду 5869 SEQ ID пов'язаний. NO: 16, від нуклеотиду 17 до нуклеотиду 3182 SEQ Типові вектори, застосовні для експресії генів ID NO: 13, від нуклеотиду 17 до нуклеотиду 3092 у вищих рослинах, добре відомі в даній області і SEQ ID NO: 14 або від нуклеотиду 17 до нуклеотивключають в себе вектори, зроблені з описаної ду 3155 SEQ ID NO: 15. індукуючої пухлину (Ті) плазміди A. tumefaciens Описане тут дослідження ідентифікувало спо(Rogers et al., 1987). Однак, відомо, що декілька соби потенціювання in planta експресії δінших векторних систем, що інтегруються в рослиендотоксинів В. tiruringiensis, які надають стійкість ни функціонують в рослинах, в тому числі описадо комах-патогенів при включенні в ядерний, пласний регулюючий транспорт вектор pCaMVCN тидний або хлоропластний геном чутливих рослин. (Fromm et al., 1986). PCaMVCN (доступний з [В патенті США 5500365], спеціально включеному Pharmacia, Piscataway, NJ) включає в себе промотут як посилання, описаний спосіб синтезу генів тор CaMV35S. рослин для оптимізації рівня експресії білка, що В переважних варіантах, вектор, що викорискодується синтезованим геном. Цей спосіб стосутовується для експресії поліпептиду, включає в ється модифікації послідовностей структурних себе селектований маркер, який є ефективним в генів екзогенного трансгену, щоб зробити їх більш клітині рослини, переважно селективний маркер "рослино-подібними" і, отже, що мають велику стійкості до лікарського засобу. ймовірність трансляції і експресії рослиною. ПодіОдним з переважних маркерів стійкості до лібний спосіб для посилення експресії трансгенів, карського засобу є ген, експресія якого призводить переважно в однодольних рослинах, [описаний в до стійкості до канаміцину, тобто описаний химерпатенті США 5689052], спеціально включеному тут ний ген, що містить промотор нопалінсинтази, неяк посилання. Агрономічні, плодоовочеві, декораоміцинфосфо-трансферазу II Tn5 (nptlІ) і 3'тивні і інші економічно або комерційно цінні рослинетрансльований район нопалінсинтази (Rogers et ни можуть бути створені відповідно до описаних al., 1988). тут способів для експресії δ-ендотоксинів В. Способи отримання експресуючих векторів thuringiensis при рівнях, досить високих для придобре відомі в даній області. Експресуючі (що традання стійкості до комах-патогенів. нсформують) вектори, що використовуються для Такі рослини можуть ко-експресувати поліпептрансформації рослин, і способи приготування цих тид δ-ендотоксину В. thuringiensis разом з іншими 37 75570 38 протигрибковими, антибактерійними або антивіруданій області в світлі даного опису. сними пов'язаними з патогенезом пептидами, поОчікується також, що тканеспецифічна ексліпептидами або білками; інсектицидними білками; пресія може функціонально виконуватися введенбілками, що додають стійкість до гербіцидів; і білням конститутивно експресованого гена (у всіх ками, що беруть участь в поліпшенні якості продутканинах) в комбінації з антисмисловим геном, ктів рослин або агрономічної продуктивності росякий експресується тільки в тих тканинах, де пролин. Одночасна ко-експресія множинних білків в дукт цього гена не є бажаним. Наприклад, ген, що рослинах є вигідною тому, що вона використовує кодує кристалічний токсиновий білок з В. більше за один спосіб дії для боротьби з патогенthuringiensis, може бути введений таким чином, що ним пошкодженням рослин. Це може мінімізувати він експресується у всіх тканинах з використанням можливість розвитку стійких штамів патогенів, ропромотору 35S з вірусу мозаїчної хвороби цвітної зширити сферу стійкості і потенційно призвести до капусти. Альтернативно, промотор актину рису або синергічної інсектицидній дії, посилюючи таким промотор гістона з дводольних або однодольних чином здатність рослини протистояти інвазії комах видів міг би бути також використаний для консти[WO 92/17591]. тутивної експресії гена. Крім того, очікується, що Спеціально для застосування згідно із даним можуть використовуватися промотори, що комбівинаходом розглядаються вектори, які включають нують елементи з більш ніж одного промотору. в себе енхансерний елемент ocs. Цей елемент був [Наприклад, в патенті США 5491288] описано комспочатку ідентифікований у вигляді паліндромного бінування промотору вірусу мозаїчної хвороби енхансеру 16п.н. з гена октопінсинтази (ocs) цвітної капусти з промотором гістона. Таким чиAgro.bacterium (Ellis et al., 1987) і присутній в щоном, експресія антисмислового транскрипту гена найменше 10 інших промоторах (Bouchez et al., B.t. в зерні кукурудзи з використанням, наприклад, 1989). Передбачається, що використання енханпромотору зеїну могла б запобігати накопиченню серного елемента, такого як елемент ocs, і, зокреδ-ендотоксину в сім'ї. Таким чином, білок, що кома, множинних копій цього елемента, може бути дується введеним геном, був присутнім би у всіх використано для збільшення рівня транскрипції з тканинах, крім зерна. Автори винаходу спеціально суміжних промоторів при застосуванні в контексті обговорюють питання про те, що подібна стратегія трансформації однодольних рослин. могла б використовуватися із застосуванням даноПередбачається, що введення великих посліго винаходу для управління експресією скриновадовностей ДНК, що містять більше за один ген, ного або селектованого маркера в тканині насіння. може бути бажаним. Введення таких послідовносАльтернативно, може бути бажаним отримантей може бути полегшене використанням бактеня нових тканеспецефічних промоторних послідорійних або дріжджових штучних хромосом (ВАС вностей для застосування згідно із даним винахоабо YAC, відповідно) або навіть штучних хромосом дом. Для досягнення цього, можна спочатку рослин. Наприклад, застосування ВАС для опосевиділити клони кДНК з тканини, що розглядається, редкованої Agrobacterium трансформації описане і ідентифікувати клони, які експресуються специHamilton et al. (1996). фічно в цій тканині, наприклад, за допомогою НоЗрештою, найбільш бажаними сегментами зерн-блоттингу. Ідеально, було б бажано ідентифіДНК для введення в геном однодольних рослин кувати ген, який не присутній з високим числом можуть бути гомологічні гени або сімейства генів, копій, але продукт якого є відносно рясним в спещо кодують бажану ознаку (наприклад, збільшецифічних тканинах. Промоторні і регуляторні елений урожай) і, що вводяться під контролем нових менти відповідних геномних клонів можуть бути промоторів або енхансерів, і т.ін., або, можливо, також локалізовані з використанням способів монавіть гомологічних або тканеспецифічних (наприлекулярної біології, відомих фахівцям в даній обклад, специфічних для кореневої шийки/кореневої ласті. піхви, мутовки, стебла, качана кукурудзи, зерна Передбачається, що експресія деяких генів в або листа) промоторів або регуляторних елементрансгенних рослинах буде бажаною при вказаних тів. Дійсно, передбачається, що конкретне викориумовах. Наприклад, передбачається, що експресія стання даного винаходу може перебувати в отрипевних генів, що додають стійкість до стресових манні трансформантів, що містять трансген, який чинників навколишнього середовища, таких як націлений тканеспецифічним чином. Наприклад, засуха, буде бажаною при фактичних стресових гени стійкості до комах можуть експресуватися умовах. Далі, передбачається, що експресія таких специфічно в тканинах мутовки і тканинах коренегенів протягом всього розвитку рослин може мати вої шийки/кореневої піхви, які є мішенями першого шкідливі дії. Відомо, що є велике число генів, які і другого потомства, відповідно, ЕСВ. Подібно відповідають на умови навколишнього середовицьому, гени, що кодують білки з конкретною активща. Наприклад, експресія деяких генів, таких як ністю проти блішки довговусої, можуть бути націrbcS, що кодує малу суб'одиницю рібулозобісфослені в кореневі тканини. фаткарбоксилази, регулюється світлом через фіВектори для застосування в тканеспецифічтохром. Інші гени індукуються повторними стимуному націленні генної експресії в трансгенних рослами. Наприклад, синтез абсцизової кислоти линах звичайно будуть містити тканеспецифічні (ABA) індукується певними чинниками навколишпромотори і також будуть містити інші тканеспенього середовища, в тому числі, але не тільки, цифічні регуляторні елементи, такі як енхансерні водним стресом. Було показано, що ряд генів індупослідовності. Промотори, які направляють спекуються ABA (Skriver and Mundy, 1990). Очікується цифічну або посилену експресію в певних тканитакож, що експресія генів, що надають стійкість до нах рослин, будуть відомі особам з кваліфікацією в поїдання комахами, була б бажаною тільки в умо 39 75570 40 вах дійсного зараження комахами. Таким чином, пробуванні проти Aedes egyptii. He існувало жоддля деяких бажаних ознак індуцибельна експресія ного прийнятного способу для розрізнення між генів в трансгенних рослинах буде бажаною. близькородинними δ-ендотоксинами, однак, як Передбачається, що, в деяких варіантах данопоказано тут, відбір на відповідні Cry2А міг би виго винаходу, експресія гена в трансгенній рослині конуватися з використанням одного способу або буде бажаною тільки в певний період часу під час комбінації способів, що включає в себе, але не розвитку даної рослини. Пов'язаний з розвитком тільки, порівняння гомології загальної амінокислотаймінг часто корелює з тканеспецифічною екстної послідовності, порівнянь близько сфокусовапресією генів. Наприклад, експресія запасних зеїного схожості між окремими Cry2А в районі амінонових білків ініціюється в ендоспермі опісля прибкислотної послідовності 307-382, або на основі лизно 15 днів після запилення. даних ІС50. Widner et al. продемонстрували, що в Передбачається також, що може бути корис50-100 раз більше Cry2Аb, ніж Cry2Aa, був потріним націлювання самою ДНК клітиною. Наприбен для отримання однакових IC50-ефектів на коклад, може бути корисним націлити ДНК, що ввомахах Diptera. Таким чином, діапазон чутливості диться в ядро, оскільки це може збільшити частоту видів Diptera до білка Cry2А міг би бути використатрансформації. В самому ядрі вона була б корисна ний як однин із засобів вимірювання і встановлендля націлювання гена для досягнення сайтня відмінностей чутливості комах-мішеней між специфічної інтеграції. Наприклад, було б корисно різними класами білків Сry2А. Наприклад, величимати ген, введений за допомогою трансформації, на IС50 в м.д., приблизно в 3 рази більш висока, для заміни існуючого в цій клітині гена. ніж Cry2Aa, що виявляється проти Aedes egyptii, 4.6 Ідентифікація і виділення інсектицидних δмогла б використовуватися як ознака для виклюендотоксинів і генів В. thuringiensis чення певних білків Cry2А як позбавлених істотній Передбачається, що описаний в даному винаінгібіторної активності проти видів Diptera. Однак, ході спосіб міг би бути використаний для отриманзастосування підходу на основі діапазонів ІС50ня істотно поліпшеної експресії ряду нових δінгібіторної активності потрібно використати обеендотоксинів B. thuringiensis, виділених, як описарежно, оскільки ці величини залежать від ряду но нижче. Ідентифікація нових штамів Bacillus високо варіабельних умов, в тому числі, але не thuringiensis, що кодують кристалічні ендотоксини тільки, від способів і матеріалів, що використовуз інсектицидною активністю, була описана раніше ються для тестування білків, і від фізичного конди(Donovan et al., 1992). Виділення ендотоксину В. ціонування комах, що тестуються. Альтернативний thuringiensis з подальшими секвенуванням аміноспосіб відрізнення δ-ендотоксинів Cry2А, позбавкінцевих амінокислот, зворотною трансляцією амілених істотної активності проти видів Diptera, від δнокислотної послідовності для конструювання оліендотоксинів, які не знаходяться в сфері дії даного гонуклеотидного зонда або використанням родинвинаходу, міг би охоплювати виключення білків ного гена В. thuringiensis як зонд, з подальшим Cry2А, які мають схожість амінокислотної послідоклонуванням гена, що кодує цей ендотоксин, гібвності більш приблизно 87% відносно амінокислоридизацією, відомі особам з кваліфікацією в даній тної послідовності Cry2Aa, або більш переважно області і були описані [див., наприклад, Donovan et виключення білків Cry2А, які мають схожість аміal., 1992; патент США 5264364], включених тут як нокислотної послідовності більш приблизна 90% посилання. відносно амінокислотної послідовності Cry2Aa. Поліпшена експресія неактивних проти Diptera Зокрема, вважається, що район Cry2Aa, відповідδ-ендотоксинів Cry2А В. thuringiensis в трансгенних ний амінокислотним залишкам від приблизно 307 рослинах може бути досягнута за допомогою сподо приблизно 382, є критичним для інгібіториої собів, описаних в даному винаході. Одним білком, активності проти Diptera даного білка, і при заміні для якого отримана поліпшена експресія, є цього комплементарного району відмінності в Cry2Аb. Cry2Аb додає інгібіторну активність проти Diptera Попередня робота показала, що деякі δбілку Cry2Аb. Таким чином, додатковий спосіб для ендотоксини Cry2А мають більшшироку специфівідрізнення δ-ендотоксинів Cry2А, які знаходяться чність відносно кола господарів, чому інші близьв сфері дії даного винаходу, міг би включати в секородинні δ-ендотоксини Cry2А, причому не тільки бе порівняння схожості цього району білка, без види лускатокрилих комах, але і види двокрилих необхідності врахування рівня гомології, при порікомах, зокрема. також чутливі до дуже низьких доз внянні будь-яких конкретних δ-ендотоксинів Cry2А токсинів. В протилежність цьому, було показано, з цим районом в Cry2Aa. При варіабельних амінощо близькородинні ендотоксини Cry2А, що не викислотах в цьому домені з 76 амінокислот, δявляють істотної інгібіторної активності проти двоендотоксиніви Cry2А, які знаходяться в рамках крилих комах, мали більш вузьку специфічність даного винаходу, були б переважно ті, які мають відносно кола господарів (Widner et al., 1989, J. більш приблизно 80 - приблизно 99 процентів схоBacteriol, 171:965-974; Widner et al. (a), 1990, J. жості з Cry2Aa в даній послідовності, або, більш Bacteriol. 172:2826-2832). Ці роботи показали, що переважно, ті, які мають більш приблизно 60-79 Cry2Аb, що використовується тут, не повністю попроцентів схожості з Cry2Aa в даній послідовності, збавлений інгібіторної активності проти двокрилих або ті, які мають більш приблизно 40 - приблизно комах, але просто є менш сильнодіючим, ніж бли59 процентів схожості з Cry2Aa в даній послідовзькородинні δ-ендотоксини Cry2А В. thuringiensis. ності, або, навіть більш переважно, ті, які мають Ці роботи показали, що Cry2А, зокрема, був набабільш приблизно 24 - приблизно 39 процентів схогато менш ефективним, ніж Cry2Aa, і, отже, позбажості з Cry2Aa в даній послідовності, або, найвлений активності проти двокрилих комах при вибільш переважно, ті δ-ендотоксини Cry2А, які ма 41 75570 42 ють більш приблизно 0 - приблизно 23 процента нів, так і для створення клітинних ліній, які несуть схожості з Cry2Aa в даній послідовності. інтегровані копії генів, що представляють інтерес. 4.7 Трансформовані клітини рослини і трансЕлектропорація, на відміну від кальцій-фосфатгенні рослини опосередкованої трансфекції і злиття протопласРозглядається також клітина рослини, транстів, часто призводить до появи клітинних ліній, що формована експресуючим вектором даного винанесуть одну, або щонайбільше - декілька, інтегроходу. Трансгенна рослина, отримана з такої транваних копій чужорідної ДНК. сформованої або трансгенної клітини, також Введення ДНК за допомогою електропорації обговорюється. Особам з кваліфікацією в даній добре відоме фахівцям в даній області. Для викообласті буде зрозуміло, що химерний ген рослини, нання електропорації можна використати або рихщо містить структурну кодуючу послідовність далі тканини, такі як суспензійна культура клітин, або ного винаходу, може бути вбудований в геном роембріогенний калус, або альтернативно, можна слини способами, добре відомими в даній області. трансформувати незрілі зародки або інші організоТакі способи для трансформації ДНК рослинних вані тканини безпосередньо. Можна було б частклітин, включають в себе опосередковану ково деградувати клітинні стінки вибраних клітин Agrobacterium трансформацію рослин, застосувитримуванням їх з пектин-деградуючими фермевання ліпосом, трансформацію з використанням нтами (пектоліазами) або механічним раневим вірусів або пилка, електропорацію, трансформацію контрольованим пошкодженням, що робить ці кліпротопластів, перенесення генів в пилок, ін'єкцію тини більш сприйнятливими до трансформації. до репродуктивних органів, ін'єкцію в незрілі ембПотім такі клітини були б реципієнтами для переріони і бомбардування частками. Кожний з цих несення ДНК електропорацією, яка може провесспособів має відмінні переваги і недоліки. Таким тися на цій стадії, і потім трансформовані клітини чином, конкретний спосіб введення генів в конкреідентифікують за допомогою відповідного прототний різновид рослини може не бути обов'язково колу відбору або скринінга, в залежності від харакнайбільш ефективним для іншого різновиду ростеру нової включеної ДНК. лини, але добре відомий, які способи застосовні 4.7.2 Бомбардування мікроснарядами для конкретного різновиду рослини. Іншим переважним способом доставки трансІснує багато способів для введення трансфоформуючих сегментів ДНК в рослинні клітини є рмуючих сегментів ДНК в клітини, але не всі вони бомбардування мікроснарядами. В цьому способі, придатні для доставки ДНК в рослинні клітини. частки можуть бути покриті нуклеїновими кислотаВважається, що відповідні способи включають в ми і доставлені в клітини рушійним зусиллям. Присебе фактично будь-який спосіб, за допомогою клади часток включають в себе частки, що склаякого ДНК може бути введена в клітину, такі як даються з вольфраму, золота/ платини і т.п.З інфікування A. tumefaciens і родинними штамами використанням цих часток ДНК проноситься через Agrobacterium, пряма доставка ДНК, така як, наклітинну стінку і в цитоплазму на поверхні невелиприклад, ПЕГ-опосередкована трансформація ких металевих часток, як описано [Klein et al., протопластів (Omirulleh et al., 1993), опосередко1987; Klein et al., 1988; Kawata et al., 1988]. Метаване висушуванням/інгібуванням поглинання ДНК, леві частки проникають через декілька шарів клітрансформація електропорацією, перемішуванням тин і таким чином роблять можливою трансфорз волокнами карбіду кремнію, прискоренням покмацію в тканинних експлантатах. Спосіб ритих ДНК часток і т.ін. В деяких варіантах перебомбардування мікроснарядами є переважним важними є способи прискорення і вони включають для ідентифікації керованих хлоропластами або в себе, наприклад, бомбардування мікропластидами подій трансформації. снарядами і т.п. Перевага бомбардування мікроснарядами, Технологія введення ДНК в клітини добре вікрім того, що вона є ефективним засобом відновдома в даній області. Описані чотири основних лювально стабільної трансформації рослинних способи доставки гена в клітини: (1) хімічні спосоклітин, полягає в тому, що вона не вимагає ні виби (Graham and van der Eb, 1973); (2) фізичні споділення протопластів (Cristou et al., 1988), ні соби, такі як мікроін'єкція (Capecchi, 1980), електсприйнятливості до інфекції Agrobacterium. Ілюстропорація (Wong and Neumann, 1982; Fromm et al., ративним варіантом способу доставки ДНК в рос1985) і генна рушниця (Johnston and Tang, 1994; линні клітини шляхом прискорення є Biolistics Fynan et al., 1993); (3) вірусні вектори (Clapp, 1993; Particle Delivery System, яка може бути використаLu et al., 1993; Eglitis and Anderson, 1988a; 1988b); і на для проштовхування часток, покритих ДНК, або (4) опосередковані рецептором механізми (Curiel клітин через сито, наприклад, сито з нержавіючої et al., 1991; Wagner et al., 1992). сталі або Nytex, на поверхню фільтра, покриту 4.7.1 Електропорація клітинами рослини, що культивуються в суспензії. Застосування коротких електричних імпульсів Сито диспергує ці частки таким чином, що вони не високого струму до різних тваринних і рослинних доставляються до реципієнтних клітин у вигляді клітин призводить до утворення пір розміром повеликих агрегатів. Вважається, що сито, включене рядку нанометрів в плазматичній мембрані. ДНК між апаратом для бомбардування мікроснарядами поглинається безпосередньо в цитоплазму клітин і клітинами, що підлягає бомбардуванню, зменшує або через ці пори, або як слідство перерозподілу розмір агрегатів мікроснарядів і може сприяти мембранних компонентів, яке супроводжує закритбільш високій частоті трансформації шляхом зметя цих пір. Електропорація може бути надзвичайно ншення пошкоджень, що наносяться реципієнтним ефективною і може бути використана як для тимклітинам мікроснарядами, які є дуже великими. часової (швидкоплинної) експресії клонованих геДля бомбардування клітини в суспензії є пе 43 75570 44 реважно сконцентрованими на фільтрах або твервідоме в даній області. Див, наприклад, описані дому культуральному середовищі. Альтернативно, способи [Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987]. незрілі ембріони або інші клітини-мішені можуть Генетична інженерія рослин бавовнику з викорисбути розміщені на твердому культуральному серетанням опосередкованого Agrobacterium перенедовищі. Клітини, що підлягають бомбардуванню, сення описана [в патенті США 5004863], спеціальрозміщують на відповідній відстані нижче за пласно включеному тут як посилання; як тинку зупинки мікроснарядів. Якщо бажано, одне трансформація рослин латуку [описана в патенті або декілька сит можуть бути розташовані між США 5349124], спеціально включеному тут як поприскорюючим пристроєм і підлягаючими бомбарсилання, і опосередкована Agrobacterium трансдуванню клітинами. За допомогою використання формація сої описана [в патенті США 5416011], описаного тут способу можна отримувати до 1000 спеціально включеному тут як посилання. Далі, або більше осередків клітин, тимчасово експресуінтеграція Ті-ДНК є відносно точним процесом, що ючих маркерний ген. Число клітин у осередку, які призводить до малого числа реаранжувань. Район експресують екзогенний продукт через 48 годин ДНК, що її переносять, визначається граничними після бомбардування, часто знаходиться в діапапослідовностями і проміжною ДНК звичайно вбузоні від 1 до 10, в середньому 1-3. довують в геном рослин, як описано [Spielmann et В трансформації за допомогою бомбардуванal., 1986; Jorgensen et al., 1987]. ня можна оптимізувати умови культивування пеСучасні вектори трансформації на основі ред бомбардуванням і параметри бомбардування Agrobacterium здатні реплікуватися в Е. соlі, а тадля отримання максимальних чисел стабільних кож в Agrobacterium, роблячи можливими відповітрансформантів. Як фізичні, так і біологічні парадні описані маніпуляції (Klee et al., 1985). Крім того, метри для бомбардування є важливими в цій технедавні технологічні успіхи в створенні векторів нології. Фізичними чинниками є чинники, які вклюдля опосередкованого Agrobacterium перенесення чають в себе маніпулювання осадком генів поліпшили аранжування генів і caйтів рестриДНК/мікроснаряди, або чинники, які впливають на кції в цих векторах для полегшення конструювання політ і швидкість макро- або мікрочасток. Біологічні векторів, здатних експресувати різні кодуючі полічинники включають в себе всі стадії, що беруть пептиди гени. Описані вектори (Rogers et al., 1987) участь в · маніпуляції клітинами до, і безпосередмають зручні мультилінкерні райони, фланковані ньо після бомбардування, а також природа транспромотором і сайтом поліаденілювання, для пряформуючої ДНК, такої як лінеаризована ДНК або мої експресії вбудованих кодуючих поліпептиди інтактні суперспіральні плазміди. Вважається, що генів і придатні для цілей даного винаходу. Крім маніпуляції перед бомбардуванням особливо важтого, Agrobacterium, що містить як «озброєні», так і ливі для успішної трансформації незрілих зародків «роззброєні» Ті-гени, може бути використана для рослин. трансформації. В різновидах рослин, в яких опоТаким чином, передбачається, що може бути середкована Agrobacterium трансформація є ефебажаним пристосування різних параметрів бомбактивною, цей спосіб є кращим способом внаслідок рдування до досліджень малого масштабу для легкої і певної природи перенесення генів. повної оптимізації умов. Можуть бути бажаними Опосередкована Agrobacterium трансформація пристосування фізичних параметрів, таких як відслистових дисків і інших тканин, таких як сім'ядолі і тань проміжку, відстань польоту, відстань до ткагіпокотили, мабуть, обмежується рослинами, які нини і тиск гелію. Можна також мінімізувати чинниAgrobacterium природно інфікує. Опосередкована ки зниження травми (TRF) модифікацією умов, які Agrobacterium трансформація є найбільш ефективпливають на фізіологічний стан реципієнтних клівною в дводольних рослинах. Невелика кількість тин і які можуть, отже, впливати на ефективність однодольних рослин, мабуть, є природними гострансформації і інтеграції. Наприклад, осмотичний подарями для Agrobacterium, хоч трансгенні росстан, гідратація тканини і стадія субкультури або лини були отримані у випадку спаржі з викорисклітинного циклу реципієнтних клітин можуть бути танням векторів Agrobacterium, як описано пристосовані для оптимальної трансформації. Ви(Bytebier et al., 1987). Недавно інші однодольні конання іншого рутинного пристосування буде рослини були трансформовані Agrobacterium. В цю відоме фахівцям в даній області в світлі даного групу включені кукурудза (Ishida et al.) і рис (Cheng винаходу. et al.). Способи опосередкованої частками трансфоТрансгенні рослини, утворені з використанням рмації добре відомі фахівцям в даній області. [В способів трансформації із застосуванням патенті США 5015580], спеціально включеному тут Agrobacteriurr, звичайно містять єдиний ген на одяк посилання, описана трансформація сої з виконій хромосомі. Такі трансгенні рослини можуть ристанням такого способу. бути названі гетерозиготними відносно доданого 4.7.3 Опосередковане Agrobacterium перенегена. Однак, оскільки застосування слова «гетеросення генів зиготні» звичайно має на увазі присутність комОпосередковане Agrobacterium перенесення є плементарного гена в тому ж самому локусі другої системою, що широко застосовується для введенхромосоми пари хромосом і немає такого гена в ня генів в рослинні клітини, оскільки ДНК може рослині, що містить один доданий ген, як в цьому бути введена в тканині цілої рослини, обходячи випадку, вважається, що більш точна назва для таким чином необхідність регенерації інтактної такої рослини буде незалежний сегрегант, оскільки рослини з протопласта. Застосування опосередкоцей доданий екзогенний ген розщеплюється незаваних Agrobacterium векторів, що інтегруються в лежно у час мітозу і мейозу. рослину для введення ДНК в клітини рослин добре Незалежний сегрегант може бути переважним, 45 75570 46 коли рослина ставиться на комерційну основу у лині, поліпшень в неоднозначності основи третьовигляді гібрида, такого як кукурудза. В цьому виго положення кодона, з використанням рекомбінападку, незалежний сегрегант, що містить цей ген, нтних послідовностей, які уникають поліаденілюсхрещують з іншою рослиною з отриманням гібривання, що підозрюється, або А/Т-багатих доменів дної рослини, яке є гетерозиготним відносно гена, або консенсусних послідовностей сплайсінга інщо представляє інтерес. тронів. Хоч ці способи для конструювання синтеІншим переважним варіантом є трансгенна ротичних генів є відомими, синтетичні гени даного слина, яка є гомозиготною відносно доданого винаходу отримували згідно з способом Brown et структурного гена; тобто трансгенна рослина, яка al., [патент США №5689052; 1997], який включений містить два доданих гени, один ген в одному і тому тут як повне посилання. Таким чином, даний винаж локусі на кожній хромосомі пари хромосом. Гохід забезпечує спосіб отримання синтетичних генів мозиготна трансгенна рослина може бути отримарослин, яких експресують in planta бажаний прона статевим спаровуванням (самообпиленням) дукт при рівнях, значуще більш високих, ніж гени незалежної трансгенної рослини-сегреганта, яка дикого типу. Коротко, згідно Brown et al., частоту містить єдиний доданий ген, пророщуванням часрідкісних і напіврідких кодонів однодольних рослин тини отриманого насіння і аналізом отриманих в полінуклеотидній послідовності, що кодує бажарослин на активність гена, представляє інтерес і ний білок, зменшують і замінюють більш переважменделючу спадковість, що вказує на гомозиготними кодонами однодольних рослин. Підвищене ність, відносно контролю (нативних, нетрансгенних накопичення бажаного поліпептиду, що кодується рослин), або трансгенна рослина, що с незалежмодифікованою полінуклеотидною послідовністю, ним сегрегантом. в однодольній рослині є результатом збільшення Дві різних трансгенних рослини можуть бути частоти зустрічі переважних кодонів аналізом косхрещені з утворенням потомства, яке містить два дуючої послідовності в послідовних шести нуклеододаних екзогенних гени, що незалежно розщептидних фрагментах і зміною цієї послідовності на люються. Самозапилення відповідного нащадка основі частоти зустрічі цих шестимерів відносно може виробляти рослини, які є гомозиготними для частоти зустрічі найрідших 284, 484 і 664 шестиобох доданих екзогенних генів, що кодують полімерів в однодольних рослинах. Крім того, Brown et пептид, що представляє інтерес. Зворотне схреal. описують збільшену експресію рекомбінантного щування з батьківською рослиною і ауткросинг з гена за допомогою способу зменшення частоти нетрансгенною рослиною також розглядаються. рідких кодонів способами для зменшення зустрічі Трансформація протопластів рослин може бусигналів поліаденілювання і сайтів сплайсінга інти досягнута з використанням способів на основі тронів в нуклеотидній послідовності, видалення кальцій-фосфатного осадження, обробки поліетисамокомплементарних послідовностей в цій нукленгликолем, електропорації і комбінації цих облеотидній послідовності і заміни неробок (див., наприклад, Potrykus et al., 1985; Lorz самокомплементарними нуклеотидами із збереet al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., женням структурного гена, що кодує даний поліпе1986; Callis et al., 1987; Marcolte et al., 1988). птид, і зменшення частоти зустрічі динуклеотидних Застосування цих систем для різних зародкопар 5'-CG-3' в цієї нуклеотидній послідовності. Ці вих плазм рослин залежить від здатності регенестадії викочуються послідовно і мають кумулятиврувати даний конкретний різновид рослини з проний ефект, що призводить до нуклеотидної послітопластів. Ілюстративні способи для регенерації довності, що містить переважне (преферентивне) зернових з протопластів описані (див., наприклад, використання більш переважних кодонів однодоFujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada льних рослин, для однодольних рослин відносно et al., 1986; Abdullah et al., 1986). більшості амінокислот, присутніх в бажаному поліДля трансформації рослинної зародкової плапептиді. зми, яка не може успішно регенерувати з протоРобота, описана тут, ідентифікувала способи пластів, можуть бути використані інші шляхи ввепотенціювання in planta експресії δ-ендотоксинів В. дення ДНК в інтактні клітини або тканини. thuringiensis, які додають стійкість до комахНаприклад, регенерація зернових з незрілих заропатогенів, при включенні в ядерний, пластидний дків або експлантатів може виконуватися, як опиабо хлоропластний геном чутливих рослин. [В пасано (Vasil, 1988). тенті США 5500365], спеціально включеному тут як 4.8 Експресія генів в рослинах посилання, описаний спосіб синтезу генів рослин Немодифіковані бактерійні гени часто слабо для оптимізації рівня експресії білка, що кодується експресуються в трансгенних рослинних клітинах. синтезованим геном. Цей спосіб стосується модиВикористання кодонів в рослинах більш близько фікації послідовностей структурного гена екзогенсхоже з використанням кодонів людини і інших ного трансгену, щоб зробити їх більш "рослиновищих організмів, ніж одноклітинних організмів, подібними" і, отже, що мають велику ймовірність таких як бактерії. В декількох повідомленнях були бути трансльованими і експресованими рослиною, описані способи поліпшення експресії рекомбінаноднодольною або дводольною. Однак, спосіб, тних генів в рослинах (Murray et al., 1989; Diehn et описаний [в патенті США 5689052], забезпечує al., 1996; Iannacone et al., 1997; Rouwendal et al., посилену експресію трансгенів. переважно в одно1997; Futterer et al., 1997 і Futterer and Hohn, 1996). дольних рослинах. Ці повідомлення описують різні способи конструю4.9 Отримання стійких до комах трансгенних вання кодуючих послідовностей для уявлення порослин слідовностей, які більш ефективно транслюються, Таким чином, кількість гена, що кодує поліпепна основі таблиць частоти зустрічі кодонів в ростид, що представляє інтерес (тобто бактерійний 47 75570 48 кристалічний білок або поліпептид δ-ендотоксину і генної конструкції, що надає стійкість до паромопептид націлювання на пластиди) може бути збіміцину. Застосування цього типу системи селектольшено в рослинах трансформацією цих рослин з ваного маркера описано [в патенті США 5424412], використанням способів трансформації, таких як спеціально включеному тут як посилання. описані в розділі 4.7. Зокрема, трансформація Всі аналізи, що розглядаються є недеструктихлоропластів або пластид може призводити до вними, і трансформовані клітини можуть культивубажаних кодуючих послідовностей, які присутні в ватися далі після ідентифікації. Інший скринований кількості до приблизно 10000 копій на клітину в маркер, який може бути використаний, являє сотканині, що містить ці субклітинні структурибою ген, що кодує зелений флуоресцентний білок. органели (McBride et al., Bio/Technology 13:362Транспластономічний відбір (відбір трансфор365, 1995). маційних подій пластид або хлоропластів) є спроДНК може бути також введена в рослини прященим завдяки використанню переважної чутлимим перенесенням ДНК в пилок, як описано (Zhou вості хлоропластів або пластид до et al., 1983; Hess, 1987). Експресія кодуючих поліспектиноміцину, інгібітору білкового синтезу пласпептид генів може бути отримана ін'єкцією ДНК до тид і хлоропластів, але не білкового синтезу ядеррепродуктивних органів, як описано (Рenа et al., ним геномом, що кодуються цитоплазматичними 1987). ДНК може бути також введена ін'єкцією рибосомами. Спектиноміцин запобігає накопиченбезпосередньо в клітини незрілих зародків і регідню хлоропластних білків, що потрібні для фотосиратацією висушених зародків, як описано нтезу, і в результаті стійкі до спектиноміцину тран(Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986). сформовані клітини рослини можуть бути 4.9.1 Відбір трансформованих клітин відрізнені на основі їх відмінності в кольорі: стійкі, Після виконання доставки екзогенної ДНК в трансформовані клітини є зеленими, тоді як чутреципієнтні клітини, наступна стадія отримання ливі клітини є білими внаслідок інгібування пластрансгенної рослини звичайно складається в ідентидного білкового синтезу. Трансформація хлоротифікації трансформованих клітин для подальшого пластів або пластид відповідним бактерійним культивування і регенерації рослин. Як згадувалогеном aad, або геном, що кодує стійку до спектися тут, для поліпшення здатності ідентифікувати номіцину функціональну в пластиді або хлороплатрансформанти може бути бажаним застосування сті рибосомальну РНК, забезпечує засіб для відселектованого або скринованого гена як експресобору і підтримки транспластопомічпих подій ваного гена або в доповнення до експресованого (Maliga, Trends in Biotechnology 11:101-106,1993). гена, що представляє інтерес. В цьому випадку Далі, передбачається, що комбінації скринозвичайно можна було б потім аналізувати популяваних і селектованих маркерів будуть застосовні цію потенційно трансформованих клітин експонудля ідентифікації трансформованих клітин. В деванням клітин селективному агенту або агентам яких типах клітин або тканин селективний агент, або скринувати ці клітини на балону ознаку маркетакий як гліфозат або канаміцин, може або не зарного гена. безпечувати достатню вбиваючу активність для Приклад варіанту способів, для ідентифікації ясного пізнавання трансформованих клітин, або трансформованих клітин включає в себе експонуможе індукувати істотне неселективне інгібування вання трансформованих клітин селективному агеяк трансформантів, так і рівним чином нетрансфонту, такому як метаболічний інгібітор, антибіотик, рмантів, роблячи цей спосіб відбору неефективгербіцид або т.п.Клітини, які були трансформовані ним. Передбачається, що відбір з використанням і мають стабільно інтегрований маркерний ген, що інгібуючого зростання сполуки, такої як гліфозат, надає стійкість до даного селективного агента, при концентраціях нижче за концентрації, що вибудуть рости і ділитися в культурі. Чутливі клітини кликають 100%-ное інгібування, з подальшим не будуть піддаватися подальшому культивуванскринінгом зростаючої тканини на експресію скриню. Один приклад переважного маркерного гена нованого маркерного гена, такого як ген стійкості додає стійкість до гліфозату. При використанні до канамиціну, дозволило б витягувати трансфорцього гена як селектованого маркера, уявно транманти з типів клітин і тканин, які не піддаються сформовані клітини обробляють гліфозатом. При тільки відбору. Передбачається, що комбінації обробці трансгенні клітини будуть доступні для відбору і скринінга можуть зробити можливими подальшого культивування, тоді як чутливі, або ідентифікацію трансформантів в широкій різноманетрансформовані клітини не будуть придатні для нітності типів клітин і тканин. культивування. Цей спосіб описаний детально [в 4.9.2 Регенерація трансформантів патенті США. 5569834], спеціально включеному Розвиток або регенерація рослин або з окретут як посилання. Іншим прикладом переважної мих протопластів рослин, або з різних експлантаселектованої маркерної системи є система стійкотів добре відомі в даній області (Weissbach and сті до неоміцинфосфотрансферази (nptll), за доWeissbach, 1988). Цей процес регенерації і зроспомогою якої надається стійкість до антибіотика тання звичайно включає в себе стадії відбору траканаміцину, як описано [в патенті США 5569834], нсформованих клітин, культивування індивідуаліспеціально включеному тут як посилання. Знову, зованих клітин за допомогою звичайних стадій після трансформації з цією системою трансфоррозвитку ембріонів через стадію вкоріненого промовані клітини будуть доступні для подальшого ростка. Трансгенні зародки і насіння регенерують культивування при обробці канаміцином, тоді як подібним чином. Отримані трансгенні вкорінені нетрансформовані клітини не будуть придатні для паростки висаджують після цього у відповідну секультивування. Ще одна переважна система селередовище для вирощування рослин, таке як ґрунт. ктованого маркера включає в себе використання Розвиток або регенерація рослин, що містять 49 75570 50 чужорідний екзогенний ген, що кодує пептид, що цієї тканини на активність проти чутливих комах представляє інтерес, введений з використанням паралельно з тканиною, що походить з неекспреAgrobacterium, з листових експлантатів може бути суючих рослин негативного контролю. Наприклад, досягнуто способами, добре відомими в даній обтрансгенні рослини R0 кукурудзи, експресуючі енласті, такими як описані (Horsch et al., 1985). В цій дотоксини В. thuringiensis, такі як Cry2Аb, можуть процедурі трансформанти культивують в присутбути ідентифіковані аналізом тканини листа, отриності агента селекції і в середовищі, яке індукує маної з таких рослин, на активність проти ЕСВ, 2) регенерацію паростків в різновиді рослини, що аналізом білкових екстрактів за допомогою твертрансформується, як описано (Fraley et al., 1983). дофазного імуноферментного аналізу (ELISA), Зокрема, [патент США 5349124], спеціально вклюспецифічного для гена, що представляє інтерес чений тут як посилання, описує детально створен(Cry2Аb); або 3) ПЦР™ із зворотною транскриптаня генетично трансформованих клітин латуку і зою (ВІД-ПЦР) для ідентифікації подій експресії виникаючих з них рослин, які експресують гібридні гена, що представляє інтерес. кристалічні білки, що надає інсектицидну актив4.11 Виділення гомологічного гена і фрагменність проти личинок лускатокрилих комах таким тів гена рослинам. Гени і δ-ендотоксини згідно із даним винахоЦя процедура звичайно виробляє паростки в дом включають в себе не тільки повнорозмірні межах двох-чотирьох місяців, і потім ці паростки послідовності, описані тут, але також фрагменти переносять на відповідну індукуюче корінняутвоцих послідовностей або злиті білки, які зберігають рення середовище, що містить селективний агент і характерну інсектицидну активність послідовносантибіотикдля запобігання бактерійному зростантей, приведених тут конкретно як приклади. ню. Паростки, які вкоріняються в присутності селеДля осіб з кваліфікацією в даній області поктивного агента з утворенням проростків, потім винно бути очевидним, що інсектицидні δпереносять в ґрунт або інші середовища, щоб зроендотоксини можуть бути ідентифіковані і отримабити можливим утворення коріння. Ці процедури ні декількома способами. Специфічні гени, або їх варіюють в залежності від конкретного виду росчастини, можуть бути отримані з депозитаріїв кулини, що використовується, причому такі варіації льтур або сконструйовані синтетично, наприклад, добре відомі в даній області. з використанням автоматичного синтезатора генів. Переважно, регенеровані рослини самообпиВаріації цих генів можуть бути легко сконструйоляються, даючи гомозиготні трансгенні рослини, вані з використанням стандартних способів отриабо пилок, отриманий з регенерованих рослин, мання точкових мутацій. Фрагменти цих генів мосхрещують з вирощеними з насіння рослинами жуть бути також отримані з використанням агрономічно важливих, переважно інбредних ліній. комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеНавпаки, пилок з рослин цих важливих ліній викоаз у відповідності зі стандартними процедурами. ристовують для обпилення регенерованих рослин. Наприклад, ферменти, такі як Ваl31, або сайтТрансгенна рослина даного винаходу, що містить спрямований мутагенез можуть бути використані бажаний поліпептид, культивують з використанням для систематичного відрізання нуклеотидів від способів, добре відомих фахівцям в даній області. кінців цих генів. Гени, що кодують активні фрагмеТаким чином, трансгенна рослина даного винти, можуть бути також отримані з використанням находу має збільшену кількість кодуючого району, численних інших рестрикційних ферментів. Протещо кодує поліпептид δ-ендотоксину В. thuringiensis ази можуть бути використані для прямого отриі пептид пластидного націлювання. Переважна мання активних фрагментів цих δ-ендотоксинів. трансгенна рослина є незалежним сегрегантом і Еквівалентні δ-ендотоксини і/або гени, що коможе передавати цей ген і його активність своєму дують цю δ-ендотоксини, можуть бути також видіпотомству. Більш переважна трансгенна рослина є лені з штамів Bacillus і/або бібліотек ДНК з викоригомозиготною відносно вказаного гена і передає станням наданого тут керівництва. Наприклад, цей ген всім з її нащадків при статевому розмноантитіла до описаних і заявлених тут δженні. Насіння з трансгенної рослини може вироендотоксинів можуть бути використані для ідентищуватися в полі або вегетаційному будиночку, і фікації і виділення інших δ-ендотоксинів з суміші отримані статевозрілі трансгенні рослини самооббілків. Конкретно, антитіла можуть бути індуковані пиляються з утворенням істинних селекційних родо частин δ-ендотоксинів, які є найбільш константслин. Потомство з цих рослин стає істинними сеними і найбільш відмінними від інших δлекційними лініями, які оцінюють на збільшену ендотоксинів В. thuringiensis. Потім ці антитіла експресію трансгену В. thuringiensis. можуть бути використані для специфічної іденти4.10 Ідентифікація подій трансгенних рослин з фікації еквівалентних δ-ендотоксинів з характерстійкістю до комах ною інсектицидною активністю за допомогою імуДля ідентифікації трансгенної рослини, екснопреципітації, ферментного імуносорбентного пресуючої високі рівні δ-ендотоксину, що предстааналізу (ELISA) або Вестерн-блоттинга. вляє інтерес, необхідно піддати скринінгу стійкі до Додатковим способом для ідентифікації δгербіциду або антибіотика трансгенні регенеровані ендотоксинів і генів даного винаходу є спосіб з рослини (генерацію R0) на інсектицидну активність використанням олігонуклеотидних зондів. Ці зонди і/або експресію гена, що представляє інтерес. Це є нуклеотидними послідовностями, що мають деможе бути виконане різними способами, добре тектовану мітку. Як добре відомо в даній області, відомими фахівцям в даній області, в тому числі, якщо молекула зонда і проба нуклеїнової кислоти але не тільки: 1) отриманням невеликих проб ткагібридизуються з утворенням сильного зв'язку між нини з трансгенної рослини Ro і прямим аналізом цими двома молекулами, то можна резонно пе 51 75570 52 редбачити, що даний зонд і проба є по суті ідентикодують одну і ту ж амінокислотну послідовність чними. Детектована мітка зонда забезпечує засіб білка або пептиду. Таким чином, даний винахід для визначення відомим чином, чи сталася гібривключає в себе такі еквівалентні нуклеотидні посдизація. Такий аналіз з використанням зондів залідовності. Також інвертовані або комплементарні безпечує швидкий спосіб ідентифікації генів інсекпослідовності є аспектом даного винаходу і мотицидних δ-ендотоксинів даного винаходу жуть бути легко використані особою, кваліфіковаНуклеотидні сегменти, які використовують як ною в даній області. Крім того, було показано, що зонди згідно з даним винаходом, можуть бути синбілки ідентифікованої структури і функції можуть тезовані за допомогою синтезаторів ДНК з викорибути сконструйовані за допомогою зміни амінокисстанням стандартних процедур. В застосуванні лотної послідовності, якщо такі зміни не змінюють нуклеотидних сегментів як зонди, конкретний зонд повторну структуру білка (Kaiser and Kezdy, 1-984). мітять будь-якою відповідною міткою, відомою Таким чином, даний винахід включає в себе мутафахівцям в даній області, в тому числі радіоактивнти амінокислотної послідовності, зображеної тут, ною або нерадіоактивною мітками. Типові радіоакякі не змінюють вторинну структуру білка, або, тивні мітки включають в себе 32Р, 125І, 35S або якщо ця структура змінена, біологічна активність т.п.Зонд, мічений радіоактивним ізотопом, може по суті зберігається. Крім того, даний винахід бути сконструйований з нуклеотидної послідовносвключає в себе також мутанти організмів, що є ті, комплементарної пробі ДНК, звичайною реакцігосподарями всього гена або частини гена, що єю нік-трансляції з використанням ДНКази і полікодує δ-ендотоксин, і гена, що кодує пептид пласмерази ДНК. Потім зонд і проба можуть бути тидного націлювання, що обговорюється в даному об'єднані в розчині буфера для гібридизації і вивинаході. Такі мутанти можуть бути отримані спотримані при відповідній температурі під час прохособами, добре відомими особам з кваліфікацією в дження відпалу. Після цього, мембрану промиваданій області. Наприклад, УХ-випромінювання ють від сторонніх матеріалів, залишаючи пробу, і може бути використане для отримання мутантів пов'язані молекули зонда звичайно детектують і організмів-господарів. Подібним чином, такі мутанвизначають кількісно за допомогою радіоавтограти можуть включати в себе аспорогенні клітинифії і/або рідинного сцинтиляційного підрахунку. господарі, які також можуть бути отримані процеНерадіоактивні мітки включають в себе, надурами, добре відомими в даній області. приклад, ліганди, такі як біотин або тироксин, а 4.12 Сайт-специфічний мутагенез також ферменти, такі як гідролази або пероксидаСайт-специфічний мутагенез є способом, зази, або різні хемілюмінесцентні молекули, такі як стосовним в отриманні індивідуальних пептидів люциферин, або флуоресцентні сполуки, такі як або біологічно функціональних еквівалентних білфлуоресцеїн і його похідні. Зонд може бути поміків або пептидів, за допомогою специфічного мутачений на обох кінцях різними типами міток для генезу основної ДНК. Описаний далі спосіб забезлегкості відділення, наприклад, з використанням печує легку можливість приготування варіантів ізотопної мітки на кінці, як згадано вище, і біотинотесту-послідовності, наприклад, з урахуванням вої міткі на іншому кінці. одного або декількох попередніх розглядів, ввеУтворення дуплекса і стабільність залежать денням одного або декількох змін нуклеотидної від істотної комплементарності між двома ланцюпослідовності в ДНК. Сайт-специфічний мутагенез гами гібрида, і, як зазначалось вище, може бути дозволяє отримати мутанти за допомогою викоридопустима деяка міра помилкового спаровування. стання специфічних олігонуклеотидних послідовТаким чином, зонди даного винаходу включають в ностей, що кодують послідовність ДНК бажаної себе мутації (як одиночні, так і множинні), делеції, мутації, а також достатнє число сусідніх нуклеотиінсерції описаних послідовностей і їх комбінації, дів, для забезпечення праймерної послідовності причому вказані мутації, інсерції і делеції дозводостатнього розміру і достатньої складності посліляють утворення стабільних гібридів з полінуклеодовності для утворення стабільного дуплекса на тидом-мішенню, що представляє інтерес. Мутації, обох сторонах делеційного зчленування, що переінсерції і делеції можуть бути отримані в конкреттинається. Звичайно переважним є праймер довної полінуклеотидній послідовності численними жиною приблизно 17-25 нуклеотидів, з приблизно шляхами, способами, відомими в цей час фахів5-10 залишками на обох сторонах зчленування цеві із звичайною кваліфікацією в даній області, і, змінної послідовності. можливо, іншими способами, які можуть стати віЗагалом, спосіб сайт-специфічного мутагенезу домими в майбутньому. добре відомий в даній області, як видно з приклаПотенційні варіації в перерахованих зондах відів численних публікацій. Як повинно бути зрозудповідальні, частково, за надмірність генетичного міло, цей спосіб звичайно використовує фаговий коду. Внаслідок надмірності генетичного коду вектор, який існує як в одноланцюговій, так і в двобільш, ніж один, кодуючий триплет нуклеотидів хланцюговій формі. Типові вектори, застосовні в (кодон) може бути використаний для більшості сайт-спрямованому мутагенезі, включають в себе амінокислот, що використовуються в утворенні такі вектори, як фаг М13. Ці фаги комерційно легко білків. Таким чином, різні нуклеотидні послідовнодоступні і їх застосування звичайно добре відомо сті можуть кодувати конкретну амінокислоту. Тафахівцям в даній області. Двохланцюгові плазміди ким чином, амінокислотні послідовності 5також рутинно використовуються в сайтендотоксинів і пептидів В. thuringiensis і пептидів спрямованому мутагенезі, що виключає стадію пластидного націлювання і полінуклеотиди, що перенесення що представляє інтерес гена з плазкодують їх, можуть бути отримані з використанням міди в фаг. еквівалентних нуклеотидних послідовностей, що Загалом, сайт-спрямований мутагенез згідно із 53 75570 54 даним винаходом виконують отриманням спочатку повідності з кодонами, приведеними в таблиці 3. одноланцюгового вектора або розплавленням Таблиця 3 двох ланцюгів двохланцюгового вектора, який містить в його послідовності послідовність ДНК, що Амінокислота Кодони кодує бажаний пептид. Олігонуклеотидний прайАланін A1a A GCA GCC GCG GCU мер, несучий бажану мутовану послідовність, гоЦистеїн Cys З UGC UGU Аспарагінова тують звичайно синтетично. Потім цей праймер кислота Asp D GAC GAU випалюють з одноланцюговим вектором і піддають Глутамінова дії полімеризуючих ДНК ферментів, таких як фракислота Glu Ε GAA GAG гмент Кленова полімерази І Е. соlі, для завершенФенілаланін Phe F UUC UUU Гліцин Gly G GGA GGC GGG GGU ня синтезу несучого мутацію ланцюга. Таким чиГістидин His Η CAC CAU ном, утвориться гетеродуплекс, в якому один Ізолейцин Ile I AUA AUC AUU ланцюг кодує початкову немутовану послідовність, Лізин Lys К AAA AAG а другий ланцюг несе бажану мутацію. Потім цей Лейцин Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU гетеродуплексний вектор використовують для траМетіонін Met Μ AUG Аспарагін Asn N AAC AAU нсформації відповідних клітин, таких як клітини Е. Пролін Pro Ρ CCA CCC CCG CCU соlі, і відбирають клони, які включають в себе реГлутамін Gin Q CAA CAG комбінантні вектори, несучі розташовану в них Аргінін Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU мутовану послідовність. Серин Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Отримання варіантів послідовностей кодуючих Треонін Thr Τ АСА ACC ACG ACU Валін Val V GUA GUC GUG GUU вибраний пептид сегментів ДНК, з використанням Тріптофан Trp W UGG сайт-спрямованого мутагенезу забезпечено як Тирозин Tyr Υ UAC UAU засіб отримання потенційно цінних різновидів і не призначено для обмеження, оскільки існують інші Наприклад, певні амінокислоти можуть бути шляхи, в яких можуть бути отримані варіанти посзамінені іншими амінокислотами в структурі білка лідовностей пептидів і кодуючих їх послідовностей без помітної втрати інтерактивної здатності скріпДНК. Наприклад, рекомбінантні вектори, що кодулення з такими структурами, як, наприклад, антиють бажану пептидну послідовність, можуть бути гензв'язуючі райони антитіл або сайти скріплення оброблені мутагенними агентами, такими як гідрона молекулах субстрат. Оскільки саме ця інтеракксиламін, з отриманням варіантів послідовностей. тивна здатність і природа білка визначає біологічТакі процедури можуть вигідно змінювати біохімічну функціональну активність білка, визначені аміні і біофізичні характеристики білка або спосіб його нокислотні заміни можна виготувати в білковій дії. Вони включають в себе, але не обмежуються послідовності і, звичайно, його основної кодуючої ними: 1) поліпшене утворення δ-ендотоксину, 2) послідовності ДНК, і проте отримати білок з такиполіпшену стабільність білка або зменшену деграми ж властивостями. Таким чином, автори винадацію протеазами, 3) поліпшене пізнавання мемходу вважають, що різні заміни можуть бути зроббранного рецептора комахи і скріплення в ним, 4) лені в пептидних послідовностях описаних поліпшену олігомеризацію або утворення каналів в композицій або відповідних послідовностях ДНК, ендотелії середньої кишки комахи і 5) поліпшену які кодують вказані пептиди, без відчутної втрати інсектицидну активність або інсектицидну специїх біологічної застосовності або активності. фічність, зумовлену будь-якою або всіма вказаниПри виконанні таких замін може враховуватими вище причинами. ся гідропатичний індекс амінокислот. Важливість 4.13 Біологічні функціональні еквіваленти гідропатичного індексу амінокислот в приданні Модифікація і зміни можуть бути зроблені в інтерактивної біологічної функції білку звичайно структурі пептидів даного винаходу і сегментів визнається в даній області (Kyte and Doolittle, ДНК, що кодують їх, при отриманні все ще функці1982, включене тут як посилання). Признається, ональної молекули, яка кодує білок або пептид з що відносний гідропатичний характер амінокислобажаними характеристиками. Біологічно функціоти робить внесок у повторну структуру отриманого нальні еквівалентні пептиди, поліпептиди і білки, білка, що, в свою чергу, визначає взаємодію цього що обговорюються тут, повинні володіти приблизбілка з іншими молекулами, наприклад, ферменно 80% або більшою схожістю послідовності, петами, субстрат, рецепторами, ДНК, антитілами, реважно приблизно 85% або більшою схожістю антигенами і т.п. послідовності і найбільш переважно приблизно Кожній амінокислоті був приписаний гідропа90% або більшою схожістю послідовності з послітичний індекс на основі її гідрофобності і характедовністю, або відповідною частиною в ній, основристик заряду (Kyte and Doolittle, 1982), ці гідропаній амінокислотній послідовності Cry2Аb. тичні індекси такі: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); Далі слідує обговорення, засноване на зміні лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин амінокислот білка, для створення еквівалента або (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (- 0,4); навіть поліпшеної молекули другого покоління. В треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тироконкретних варіантах даного винаходу передбачазин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (ється, що мутовані кристалічні білки застосовні 3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3/5); аспарагін (для збільшення інсектицидної активності даного 3,5); лізин (-3,9) і аргінін (-4,5). білка і, отже, для збільшення інсектицидної активВідомо в даній області, що певні амінокислоти ності і/або експресії рекомбінантного трансгену в можна замінити іншими амінокислотами, що марослинній клітині. Заміни амінокислот можуть бути ють такий же гідропатичний індекс або бал, і все ж отримані зміною кодонів послідовності ДНК у від 55 75570 56 отримати білок з такою ж біологічною активністю, ністю нативної амінокислоти, тобто зроблена контобто все ж отримати біологічний функціонально сервативна заміна амінокислот, що призводить до еквівалентний білок. При проведенні таких замін, зміни, що мовчить. переважна заміна амінокислот, гідропатичні індекЗаміни для амінокислоти в основній поліпепси яких знаходяться в межах ±2, особливо перетидній послідовності можуть бути вибрані з інших важна заміна амінокислот, індекси яких знаходятьчленів класу, до якого належить амінокислота, що ся в межах ±1, і навіть більш переважна заміна природно зустрічається. Амінокислоти можуть буамінокислот, індекси яких знаходяться в межах ти розділені на наступні чотири групи: (1) кислі ±0,5. амінокислоти, (2) основні амінокислоти, (3) нейтВ даній області признається також, що заміна ральні полярні амінокислоти і (4) нейтральні непосхожих амінокислот може виконуватися ефективно лярні амінокислоти. Характерні амінокислоти в цих на основі гідрофільності. [В патенті США 4554101], різних групах включають в себе, але не обмежувключеному тут як посилання, стверджується, що ються ними: (1) кислі (негативно заряджені) амінонайвища локальна середня гідрофільність білка, кислоти, такі як аспарагінова кислота і глутамінова що визначається гідрофільністю його суміжних кислота; (2) основні (позитивно заряджені) аміноамінокислот, корелює з біологічною властивістю кислоти, такі як аргінін, гістидин і лізин; (3) нейтрацього білка. льні полярні амінокислоти, такі як гліцин, серин, Як описано [в патенті 4554101], наступні велитреонін, цистеїн, цистин, тирозин, аспарагін і глучини гідрофільності були приписані амінокислоттамін; (4) нейтральні неполярні (гідрофобні) аміноним залишкам: аргінін (+3,0); лізин (+3,0); аспартат кислоти, такі як аланін, лейцин, ізолейцин, валін, (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серії (+0,3); аспарагін пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін. (+0,2); глутамін (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); Консервативні амінокислотні заміни в основній пролін (-0,5±1); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеполіпептидній послідовності можуть бути виконані їн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); заміною однієї амінокислоти в однією з цих груп ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); іншою амінокислотою в тій же самій групі. Біологітриптофан (-3,4). чно функціональні еквіваленти Cry2Аb можуть Зрозуміло, що амінокислоту можна замінити мати 10 або менш консервативних амінокислотних іншою, що має таку ж величину гідрофільності, і замін, більш переважно сім або менш консервативсе ж отримати біологічно еквівалентний і, зокревних амінокислотних замін і найбільш переважно ма, імунологічний еквівалентний білок. В разі таких п'ять або менш консервативних амінокислотних замін переважна заміна амінокислот, величини замін. Таким чином, кодуюча нуклеотидна послігідрофільності яких знаходяться в межах ±2, особдовність (ген, плазмідна ДНК, кДНК або синтетичливо переважна заміна амінокислот, величини на ДНК) буде мати відповідні заміни основ, що гідрофільності яких знаходяться в межах ±1, і надозволяють їй кодувати біологічно функціональні віть більш переважна заміна амінокислот, величиеквівалентні форми Cry2Аb. ни гідрофільності яких знаходяться в межах ±0,5. 5.0 Приклади Таким чином, як указано вище, амінокислотні Приведені далі приклади включені для демонзаміни звичайно засновані на відносній схожості страції переважних варіантів даного винаходу. замінників бічних ланцюгів амінокислот, наприФахівцям в даній області повинно бути зрозуміклад, їх гідрофобності, гідрофільності, заряді, розлим, що способи, описані в нижченаведених прикмірі і т.п.Приклади замін, які враховують різні з ладах, представляють способи, які описані автопопередніх характеристик, добре відомі фахівцям ром винаходу як такі, що функціонують добре в в даній області і включають в себе: аргінін і лізин; застосуванні на практиці даного винаходу, і, отже, глутамат і аспартат; серин і треонін; глутамін і асможуть розглядатися як переважні способи його парагін; валін, лейцин і ізолейцин. застосування. Однак, фахівці в даній області поФахівцям в даній області відомо, що полінуквинні розуміти, в світлі даного опису, що численні леотиди, що кодують δ-ендотоксини, зроблені з В. зміни можуть бути зроблені в конкретних описаних thuringiensis, слабе експресуються при включенні в тут варіантах, і при цьому можна отримувати такий ядерну ДНК трансгенних рослин (огляд Diehn et al, же або схожий результат без відхилення від ідеї і 1996). Переважно, нуклеотидну послідовність, що сфери дії даного винаходу. кодує δ-ендотоксин, що представляє інтерес, 5.1 Приклад 1 - Збільшена експресія Cry2Аb конструюють по суті, як описано [в патенті США націленими векторами 5500365 і патенті США 5689052], кожний з яких Експресію білка Cry2Аb в рослинах кукурудзи, включений тут спеціально як посилання. Приклади трансформованих націленими і ненаціленими екснуклеотидних послідовностей, застосовних для пресуючими Cry2Аb векторами порівнювали, і воекспресії, включають в себе, але не обмежуються на була значуще більш високою в рослинах з нанею, cry2Ab (SEQ ID NO: 1). ціленим вектором. Ненацілені рослинні Пептиди, поліпептиди і білки, біологічно функекспресуючі вектори Cry2Ab pMON26800 і ціонально еквівалентні Cry2Аb, включають в себе pMON30463 містять експресійну касету, складену амінокислотні послідовності, що містять консерваз посиленого промотору CaMV35S, інтрона hsp70 тивні заміни амінокислот в основній послідовності, кукурудзи, синтетичного гена Cry2Аb з колонами показаній в SEQ ID NO: 2. В таких амінокислотних ініціації і термінації трансляції (SEQ ID NO: 1), і послідовностях одна або декілька амінокислот в сайт поліаденілювання нопалінсинтази. основній послідовності замінена (замінені) іншою Націлений рослинний експресуючий вектор амінокислотою (іншими амінокислотами), заряд і pMON30464 (SEQ ID NO: 16) містить експресійну полярність яких є однаковими із зарядом і поляркасету, що включає в себе посилений промотор 57 75570 58 CaMV35S, інтрон hsp70 кукурудзи, хлоропластний моноклональне уловлююче антитіло, індуковане транзитний пептид ssRUBISCO кукурудзи (SEQ ID проти Cry2Аb, інше моноклональне антитіло проти NO: 3), злитий в рамці прочитання з синтетичним Cry2Aa, кон'юговане із лужною фосфатазою, як геном Cry2Аb, і сайт поліаденілювання нопалінсивторинне антитіло і очищений білок Cry2Aa як стантази. ндарт. Всі вектори (pMON26800, pMON30463 і Порівняння рівнів експресії Cry2Аb в що місpMON30464) містять також касету, що надає стійтять pMON30463 (ненацілений) і pMON30464 (накість до паромоміцину трансформованої тканини цілений) рослинах кукурудзи показують, що ексрослини. В випадку pMON26800, ця касета склапресія ненаціленого Cry2Аb не перевищує 15м.д., дається з посиленого промотору CaMV35S, інтротоді як націлена експресія часто перевищує 100. на hsp70 кукурудзи, гена неоміцинфосфотрансфеБлот-аналізи білка підтверджують, що збільшений рази з кодонами ініціації і термінації трансляції, і рівень перехресно-реактивного матеріалу, продусайта поліаденілювання нопалінсинтази. В випадкованого pMON30464 (націленим) зумовлений ку pMON30463 і pMON30464, ця касета складаєтьзбільшеним накопиченням білка приблизно Mr ся з промотору CaMV35S, гена неоміцинфосфот71000, який ко-мігрує з Cry2Аb, продукованим рансферази з кодонами ініціації і термінації pMON30463 (ненаціленим) і стандартом Cry2Aa з трансляції, і сайта поліаденілювання нопалінсинВ. thuringiensis. Ці дані показують, що націлюючий тази. Трансгенні рослини кукурудзи, стійкі до папептид, злитий з N-кінцем білка Cry2Аb, ефективно ромоміцину, отримували по суті, як описано [в папроцесувався або віддалявся. тенті США 5424412], спеціально включеному тут як Збільшену експресію Cry2Аb у векторах посилання. pMON30464 (націлених) відносно векторів Тканину листа з незалежно трансформованих pMON26800 (ненацілених) спостерігали також в трансгенних подій в стадії R0 піддавали кількіснорослинах потомства R1, отриманих з початкових му аналізу на рівні білка Cry2Аb за допомогою кітрансгенних подій R0, що вказує на те, що висока лькісного тесту ELISA. В цьому ELISA застосовуекспресія є успадкованою (таблиця 5). вали прямий сендвич-тест, в якому використали Таблиця 4 Експресія Cry2Ab в R0-кукурудзі, трансформованій націленим (pMON30464) і ненаціленим (pMON30463) експресуючими векторами: розподіл рівнів експресії в різних подіях Загальне число подій 16 40 Вектор ненаціленний (30463) націленний (30464) Загальне число ЕСВ+ 3 (19%) 14 (35%) 0 м.д. 0 0 0-5 м.д. 0 2 5-15 м.д. 3 2 15-50 м.д. 0 0 50-100 м.д. 0 0 100-200 м.д. 0 4 >200 м.д. 0 5 Таблиця 5 Експресія Cry2Аb в R1-кукурудзі, трансформованій націленим (pMON30464) і ненаціленим (pMON26800) експресуючими векторами: розподіл рівнів експресії в різних подіях Вектор Загальне число анал. подій ненацілений (26800) націлений (30464) 28 33 0 м.д. 0 5 0-5 м.д. 18 3 Для ефективної боротьби з комахами, які харчуються на різних тканинах кукурудзи, вирішальним є те, що інсектицидний білок повинен експресуватися при високих рівнях на всіх потенційних дільницях живлення. Для визначення, чи мають місце збільшення націленої експресії Cry2Аb в інших тканинах, незалежні націлені і ненацілені трансгенні події, що представляють лінії з високою експресією, отримані з відповідними типами век 5-15 м.д. 10 2 15-50 м.д. 0 0 50-100 м.д. 0 2 100-200 м.д. 0 4 >200 м.д. 0 17 торів, аналізували паралельно на рівні експресії Cry2Аb. Експресія Cry2Аb є збільшеною практично у всіх тканинах кукурудзи, що атакуються шкідниками, такими як Ostrina nubialis і Helicoverpa zea, за допомогою націленої експресії (таблиця 6). Однорідно високий рівень експреси цього типу є особливо цінним тому, що малоймовірно, що він допустить розвиток стійкості шкідників-мішеней через поведінкову (годування) адаптацію. Таблиця 6 Націлена і ненацілена експресія Cry2Ab в трансгенній кукурудзі Вектор N30pMON 30464 N30pMON 26800 Подія #1 #2 #1 N 1 4 2 Коріння 13.1 11,3±4.5 1,2±0.4 Листя 117.6 105±12 10±5.3 Паросток 140.8 121±25 20±12 Показана експресія в мкг Cry2Аb/г сирої ваги (корінь і лист) або сухої ваги тканини (паростки, стебла, качана, обгортки качана, шовку (сукупності стовпчиків в качані кукурудзи), стрижня качана і зерна кукурудзи) ± стандартне відхилення Стебло 514.9 96±18 28±5.6 Качан 397.5 134±38 29±7.5 Обгортка 121.8 52±9.1 7,6±7.6 Шовк 130.5 101±11 46±9,9 Стрижень Зерно 165.2 106.9 113±45 170±36 9,6±9.6 10,9±4.6 (L30464#2) або діапазон (L26800#1. Додаткові аналізи показують, що збільшені рівні білка Cry2Аb, продуковані pMON30464, призводять до відповідного збільшення рівня біоактивності, як виміряно безпосередньо в тестах з годуванням. 59 75570 60 Для оцінки рівня продукованої інсектицидної актиним ELISA-визначенням рівнів Cry2Аb. Збільшення вності тканину листя кукурудзи з контрольних (нев 7,5 раз рівнів Cry2Аb в націлених (pMON30464) трансгенних), «націлених» (pMON30464) і «ненаціпробах відносно ненацілених (pMON30463) проб лених» (pMON30463) рослин аналізували на явно корелює з відповідною відмінністю в 6 разів в активність проти Heliothis virescens в дослідженнях середній вазі личинок, що спостерігається при з накладенням згодованої тканини (таблиця 7). дві обох рівнях концентрацій. Таким чином, ці дані концентрації тканини (0,0016 і 0,0031%) піддавали показують, що збільшені рівні Cry2Аb, продуковані біоаналізу і одну і ту ж пробу тканини, що викорисpMON30464, призводять до відповідних збільшень товується в накладенні корму, піддавали кількісрівнів біоактивності. Таблиця 7 Кореляція збільшених рівнів експресії Cry2Аb із збільшеною біоактивністю в тесті з накладенням тканини, що згодовується Heliothis virescens Проба тканини Контроль Націлені Ненацілені Конц. Cry2Аb (м.д.) 0,0 444 60 Концентрація тканини 1 (0,0031% ткани- Концентрація тканини 2 (0,0016% тканина) на) Середня вага личинок (мг) Середня вага личинок (мг) 22.00 24,6 1,2 2,1 7,3 12,7 5.2 Пластидне націлювання Cry2Аb збільшує частоту агрономічно нормальних рослин, отриманих з трансформації Для отримання комерційно життєздатної ознаки боротьби з комахами на основі трансгену вирішальним є отримання події з нормальними характеристиками зростання рослин. В більшості випадків цілком велике число незалежних трансгенних подій успішно отримували в польових тестах для гарантії того, що подія, яка задовольняє всім ключовим критеріям (таким як ефективна боротьба з комахами, нормальне менделєвське розщеплення трансгену і нормальні характеристики зростання або агрономічні характеристики), буде ідентифіковано. Способи, які збільшують частоту, з якою отримують нормальні події, явно є цінними, оскільки вони збільшують шанси ідентифікації події, яка може бути переведене на комерційну основу. Корисне також збільшення розміру пулу перспективних подій для скринінга шляхом збільшення процента R0-подій (первинно регенерованих рослин) зі здатністю до запліднення. Оскільки трансформація рослин в лабораторії є напруженою (трудомісткою), будь-який спосіб, який зменшує число R0-подій, які повинні бути вироблені для отримання трансгенної події з відповідною продуктивністю і відповідними характеристиками зростання, також є цінним. Великі популяції незалежних інсерційних R0подій трансгену ненацілених векторів pMON26800 і pMON30463 і націленого вектора pMON30464 були отримані і оцінені в балах на фертильність. Спостерігали, що більш високий процент R0-подій, що генеруються з націленим вектором, був фертильним (таблиця 8). Потомство фертильних R0подій вводили потім в польові випробування, де вони оцінювалися на стійкість відносно метелика кукурудзяного (ЕСВ1) і нормального розщеплення. Способи для визначення оцінок ЕСВ1 і величин розщеплення були по суті такими, як описані способи (Armstrong et al., 1995). Події, які задовольняли критеріям ЕСВ1 і розщеплення, оцінювали потім на затримку зростання і зменшення висоти рослин. В той час як 60% ненацілених подій виявляли зменшення висоти рослин, тільки 3% націлених подій виявили затримку зростання (таблиця 8). Поліпшена здібність до запліднення і зменшена затримка зростання призводили до значно поліпшеного (37% проти 8%) виходу ЕСВ1-позитивних подій з відсутністю затримки зростання з націленим вектором Cry2Аb. Загалом, в 4 рази більше ненацілених R0-подій повинно продукуватись і зазнавати скринінгу для отримання того ж самого числа нормальних, ЕСВ+ R0-подій, яке отримане з націленим вектором Cry2Аb в дослідженні по трансформації. Таблиця 8 Порівняння процента фертильних, затриманих в зростанні і нормальних рослин кукурудзи, отриманих з ненаціленим і націленим експресуючими векторами Cry2Аb Вектор Ненацілені Націлені Число ЕСВ LD + R0-подійа 192 78 % фертильних подійb 66 85 % затриманих в зростанніc 63 4 % нормальних ECBl+d 7 31 а Число ЕСВ LD+ R0-подій дорівнює числу R0-подій, які були позитивними згідно з тестом годування ЕСВ листовим диском. % ЕСВ LD+ R0-подій, що дають життєздатне потомство R1 (насіння). % затриманих в зростанні є % ЕСВІ-позитивних і подій, що правильно розщеплюються, із зменшеним зростанням, (загальна кількість ЕСВІ-позитивних і подій, що правильно розщеплюються, для ненаціленого вектора була 38; для націленого 25). d % нормальних, ЕСВ1+ означає % нормальних, ЕСВ+ подій, отриманих відносно загального числа ЕСВ LD+ R0-подій, підданих скринінгу. b с 5.3 Приклад 3 - Пластидне націлювання Сrу2Аb збільшує частоту знищення високого рівня метелика кукурудзяного в трансгенній кукурудзі Раніше описані популяції незалежно трансформо ваних подій, що відбуваються як з націленого (pMON30464), так і ненаціленого (pMON30463 або pMON26800) експресуючих векторів Сrу2Аb, піддавали також скринінгу на стійкість до зараження