Штам bacillus thuringiensis (варіанти), пестицидна композиція, спосіб боротьби із шкідливими комахами, спосіб підвищення пестицидної активності та спосіб одержання речовини з пестицидною активністю

1 Штамм бактерий Bacillus thurmgiensis NRRL B-21090 или его мутант с теми же свойствами, что иуказанный штамм, используемый для получения вещества, имеющего структурную формулу R3 0 OR OR где R, R-i, R2, R3 = H соединение (la) или R, R-i, R2 = H, R3 = ОН соединение (Ib), или их смеси и обладающего пестициднои аісгивностью 2 Штамм баїсгерий Bacillus thurmgiensis NRRL B21091 или его мутант с теми же свойствами, что и указанный штамм, используемый для получения вещества, имеющего структурную формулу OR О NR«R, OR где R, Ri, R2, R3 = H (la) или R, R1, R2 = H, R3 = OH (Ib), или их смеси и обладающего пестициднои активностью 3 Штамм бактерий Bacillus thurmgiensis NRRL B21093 или его мутант с теми же свойствами, что и указанный штамм, используемый для получения вещества, имеющего структурную формулу R 3 OR NR.R 2 11Л OR г д е R, R 1 , R 2 , R 3 = H (la) и л и R, R 1 , R2 = H , R3 = O H ( I b ) , и л и и х с м е с и и о б л а дающего пестициднои активностью 4 Штамм бактерий по любому из пп 1,2 или 3, отличающийся тем, что указанное вещество обладает пестициднои активностью в отношении вредных насекомых отряда Жесткокрылых и получено из супернатанта ферментации штамма 5 Пестицидная композиция, отличающаяся тем, что она содержит вещество общей формулы R O O R О о о 00 49800 где R, Ri, R2, R3 = H (la) или R, Ri, R2 = H, R3 = OH (Ib), или их смесь, обладающее пестицидной активностью в отношении вредных насекомых отряда Жесткокрылых, в количестве не менее 1 r/LTU, и пестицид на основе Bacillus, причем вещество la или Ib, или их смесь получено из супернатанта ферментации штамма Bacillus, у которого вся пестицидная активность находится в супернатанте ферментации штамма 6 Пестицидная композиция по п 5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пестицидно эффективный носитель 7 Способ борьбы с вредными насекомыми отряда Жесткокрылых, выбранными из группы, состоящей из Leptmotarsa decemlmeata, Ips calhgraphus, Dendroctonus frontahs, Epilachna vanvastis, Popilha japomcus, отличающийся тем, что вредителей обрабатывают эффективным количеством пестицидной композиции по любому из пп 5, 6 8 Способ усиления пестицидной активности пестицида на основе Bacillus путем обработки вредителя пестицидной композицией, содержащей вещество, обладающее пестицидной активностью и пестицид но эффективный носитель, отличающийся тем, что в качестве вещества, обладающего пестицидной активностью, используют вещество, полученное из супернатанта ферментации Изобретение касается нового штамма(ов) Bacillus thunngiensis, у которого практически вся пестицидная активность находится в супернатанте, полученном при ферментации указанного штамма Штамм продуцирует вещество, действующее против вредного н асе ко мо го (ых) отряда Жесткокрылых и повышающую пестицидную активность пестицидов на основе Bacillus Изобретение также касается пестицидных композиций, которые содержат вещество и пестицидный носитель или вещество и пестицид на основе Bacillus, химический пестицид и/или вирус с пестицидными свойствами, а также способов применения пестицидных композиций для борьбы с вредителями Каждый год значительная часть мировых коммерчески важных сельскохозяйственных посевов, в том числе пищевых, текстильных и других культурных растений, теряется вследствие поражения вредителями, что приводит к убыткам в миллионы долларов В попытках борьбы с этими вредителями применяют различные подходы Первым подходом является применение пестицидов широкого спектра действия, например химических пестицидов с широким спектром активности Однако, при использовании химических пестицидов существует ряд отрицательных моментов В частности, обладая широким спектром активности, эти пестициды могут поражать нецелевые организмы, например полезных насекомых и паразитов целевых вредителей Кроме того химические пестициды часто токсичны для живот штамма бактерий Bacillus thunngiensis, выбранного из группы, состоящей из штамма NRRL В21090, штамма NRRL B-21091, штамма NRRL B21093 или его мутантов с теми же свойствами, причем указанное вещество используют в количестве, достаточном для усиления пестицидной активности указанного пестицида на основе Bacillus 9 Способ получения вещества структурной формулы О RO OR где R, Ri, R2, R 3 = H (la) или R, Ri, R2 = H, R 3 = OH (Ib), или их смеси, обладающего пестицидной активностью, заключающийся в том, что культивируют штамм бактерий Bacillus thunngiensis, выбранный из группы, состоящей из штамма NRRL B-21090, штамма NRRL B-21091, штамма NRRL B-21093, на подходящей для роста среде, отделяют супернатант и выделяют целевой продукт из полученного супернатанта ных и человека, а у целевых вредителей часто развивается устойчивость при повторных обработках этими веществами Другой подход предусматривает применение биопестицидов, в которых использованы природные патогены, для борьбы с заражениями посевов насекомыми, грибками и сорняками Биопестициды содержат бактерию, образующую токсин - вещество, токсичное для вредителя Биопестициды в целом менее вредны для нецелевых организмов и окружающей среды по сравнению с химическими пестицидами Наиболее широко применяемым биопестицидом является Bacillus thunngiensis ( B t ) B t - широко распространенный палочковидный аэробный спорообразующий микроорганизм Во время цикла споруляции B t образует белок(и), известный как кристаллический дельта-токсин(ы), который убивает личинок насекомых B t вследствие этого широко применяют как сельскохозяйственный пестцид Было обнаружено, что некоторые штаммы, например Bacillus thunngiensis subsp kurstaki и Bacillus thunngiensis subsp aizawai, специфичны в отношении Чешуекрылых Bacillus thunngiensis subsp israelensis, как было обнаружено, специфична в отношении Двукрылых (Патент США № 4166112) Другие штаммы, например Bacillus thurmgiensis subsp tenebnoms (Патент США № 4766203), как было показано, специфичны в отношении Жесткокрылых 49800 Выделение других токсичных для жесткокрылых штаммов было описано в 1986 г (Hernnstadt et alf Bio/Technology, 4, 305-308,1986, Патент США 4764372) Этот штамм, названный Bacillus thunngiensis subsp san diego, M-7, депонирован в Северной региональной Исследовательской Лаборатории США под регистрационным номером NRRL В-15939 Однако, правопреемник патента № 4764372 Mycogen, Corp публично признал, что Bacillus thunngiensis subsp san diego является Bacillus thunngiensis subsp tenebnonis Более того, этот патент был передан Novo Nordisk A/S Дополнительно был описан штамм В t, токсичный для Чешуекрылых и Жесткокрылых (заявка РСТ № WO 90/13651) Токсин, описанный в WO 90/13651, имеет мол массу 81 кД Во время цикла споруляции B t образует белок(и) в кристаллической форме, известный как дельта-эндотоксин(ы), с мол массой 27-140кД, который при поедании убивает личинки насекомых Токсическая активность может находиться в одном или нескольких таких дельта-эндотоксинах данного штамма В t Большинство дельтаэндотоксинов предсталяют собой протоксины, которые протеолитически конвертируются в более мелкие токсичные (процессированные) полипептиды в среднем кишечнике целевого насекомого (Hofte and Whiteley, 1989, Microbiol Rev 53 242255) Дельта-эндотоксины кодируются генами cry (кристаллических белков) Гены cry разделены на шесть классов и несколько подклассов по структурной близости и пестицидной специфичности Основные классы представлены специфичными к Чешуекрылым (cryl), специфичными к Чешуекрылым и Двукрылым (cryll), специфичными к Жесткокрылым (crylll), специфичными к Двукрылым (crylV) (Hofte and Whiteley, 1989, Microbiol Rev 53 242255), специфичными к Жесткокрылым и Чешуекрылым (гены cryV по Tailor et al , 1992, Molecular Microbiology 6 1211-1217) и специфичными к нематодам (cryV и cryVI по Feitelson et al , 1992, Bio/Technology, 10 271-275) генами Дельта-эндотоксины были получены с использованием рекомбинантной ДНК Полученные с использованием рекомбинантной ДНК способами дельта-эндотоксины могут быть или не быть в кристаллической форме Дельта-токсин В t не растворим в воде за исключением щелочных значений рН и почти всегда кодируется плазмидои Было показано, что некоторые штаммы Bacillus thunngiensis образуют термостабильный пестицидный аналог нуклеотида аденина, известный как р-экзотоксин или тюрингиензин, который является пестицидным в индивидуальном виде (Sebesta et al , в Н D Burges (ed) Microdial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, New York, 249-281, 1981) pэкзотоксин был обнаружен в супенатанте некоторых культур Bacillus thunngiensis Он имеет мол массу 789 и содержит аденозин, глюкозу и алларовую кислоту (Luthy et al , в Kurstak (ed ) Microbial and Viral Pesticides, Marcel Deccer, New York, 1982, 35-72) Круг его хозяев включает, но не ограничен Muska domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus uncae, Drosophila melanogaster и Tetranychus cinnabarmus Считается, что токсичность р-экзотоксина обусловлена ингибированием ДНК-направленной РНК-полимеразы за счет конкуренции с АТФ Показано, что этот р-экзотоксин кодируется плазмидои Cry у пяти штаммов Bacillus thunngiensis ( B t ) и что он может быть классифифцирован как р-экзотоксин типов I и II (Levmson et al , 1990, J Bactenol 172 3172-3179) Как было показано, р-экзотоксин типа I образуется В t subsp thunngiensis серотипа 1, В t subsp tolworthi серотипа 9 и B t subsp darmstadiensis серотипа 10 Обнаружено, что р-экзотоксин типа II образуется B t subsp Momsoni серотипа 8ab и активен в отношении Leptmotarsa decemlmeata (колорадский картофельный жук) Иные водорастворимые субстанции, которые были выделены из В t , включают а-экзотоксин, который токсичен в отношении личинок Muska domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol Lett 8 1-7), гамма-экзотоксины, представленные различными протеолитическими ферментами, в том числе лецитиназами, хитиназами и протеазами, токсический эффект которых проявляется только в сочетании с бета-экзотоксином или дельта-эндотоксином (Forsberg et al , 1976, Bacillus thunngiensis Its Effects on Environmental Quality, Национальный Исследовательский Совет Канады, Объединенный Комитет Совета по Научным Критериям Качества Окружающей Среды, Подкомитеты по Пестицидам и Близким Соединениям и Биологическим Явлениям), сигмаэкзотоксин, который имеет структуру, близкую бета-экзотоксину и также является активным в отношении Leptmotarsa decemlmeata (Argaueret al , 1991, J Entomol Sci 26 206-213) и ангидротюрингиензин (Coll Czechoslovak Chem Comm 40,1775, 1975) WO 94/09630 описывает водорастворимое вещество, которое повышает активность Bacillus thunngiensis subsp kurstaki и Bacillus thunngiensis subsp aizawai Stonard et al (1994, в Natural and Engeneered Pest Management Agents, Paul A Mann, Robert M Hollmgworth, eds , ACS, Washington, D С , pp 2536) описывают диабротицины структуры RO O R 1 R, Ri, R2 = H, R3 = ОН Диабротицин А 2 R, RARg, R3 = ОН Диабротицин В Диабротицины были выделены из В subtihs Они активны в отношении Diabrotica undecimpunctata, Leptmotarsa decemlmeata, Anthomus grandis Boheman, личинок комаров, Staphylococcus aureus и Micrococcus lutea, но не активны в отношении мотылька кукурузного, Eschenchia col і, В subtihs и Pseudomonas aerugmosa Активность в отношении других вреди 49800 телей Stonard et al не показали Диабротицин А был также выделен из культуральных жидкостей В cereus Были предприняты попытки повысить летальный эффект препаратов В t Средства включали поиск новых штаммов с повышенным летальным эффектом, дальнейшую разработку существующих штаммов и разработку более эффективных композиций при смешивании спор и/или кристаллов B t с новыми пестцидными носителями или с химическими пестицидами Целью настоящего изобретения является улучшение инсектицидной активности известных препаратов В t Другим объектом настоящего изобретения является повышение пестицидной активности пестицидов, а также поиск новых способов применения пестицидных продуктов Полезным является выделение новых штаммов Bacillus thunngiensis для получения новых веществ, расширяющих спектр биопестицидов для каждого н асе ко мо го-вредителя Сущность изобретения Изобретение относится к новому штамму Bacillus thunngiensis, у которого практически вся пестицидная активность сосредоточена в супернатанте, полученном при ферментации указанного штамма Кристаллический белок и споры, полученные при ферментации штамма Bacillus thurmgiensis no настоящему изобретению, не имеют никакой пестицидной активности В частности, штамм выбран из группы, содержащей ЕМСС0077 с идентификационными характеристиками NRRL В-21090 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0077, ЕМСС-0078 с идентификационными характеристиками NRRL B21091 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0078, ЕМСС-0079 с идентификационными характеристиками NRRL B21092 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0079, ЕМСС-0080 с идентификационными характеристиками NRRL B21093 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0080, ЕМСС-0081 с идентификационными характеристиками NRRL B21094 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0081 Из супернатанта ферментации указанного штамма получено вещество, обладающее пестицидной активностью в отношении вредных насекомых из отряда Жесткокрылых и действующее совместно как, например, усилитель или синергидный агейт с другим пестицидом на основе Bacillus, против вредителей В предпочтительном варианте это вещество имеет LC50 (LC50 - концентрация данной пестицидной субстанции, необходимая для гибели 50% вредителей) 126 ц, активного ингредиента/г общего материала в отношении Leptmotarsa texana LC50 осадка, полученного при ферментации указанного штамма, превышает ЗОООц активного ингредиента/г общего материала по (аи/г) данным биотеста С другой стороны, указанное вещество обладает пестицидной активностью против вредных насекомых отряда Жесткокрылых В частности, это вещество имеет пестицидную активность против вредных насекомых видов Diabrotica undecimpunctata, Leptmotarsa texana, Anthomus grandis, a также проявляет неожиданную активность против вредных насекомых видов Ips calhgraphus, Popilha japomcus, Epilachna vanvastis, Leptmotarsa decemhneata и Dendroctonus frontahs из отряда Жесткокрылых Это вещество может усиливать инсектицидную активность кристаллического дельтаэндотоксина(ов) Bacillus thunngiensis против вредных насекомых В частности оно повышает инсектицидную активность кристаллического дельтатоксин a Bacillus thunngiensis subsp tenebnoms против вредных насекомых отряда Жесткокрылых В настоящем описании "пестицид на основе Bacillus" означает штамм или споры Bacillus (например, Bacillus thunngiensis или Bacillus subtihs) Пестицид на основе Bacillus может быть также веществом, выделенным из Bacillus, например белком или его фрагментом, обладающими активностью в отношении вредителей или убивающими их, веществом, обеспечивающим защиту растений, например веществом, препятствующим поеданию, или микроорганизмом, способным экспрессировать ген Bacillus, кодирующий белок Bacillus или его фрагмент, обладающие активностью в отношении вредителей или убивающими их (например, дельта-токсин Bacillus thunngiensis) и приемлемый носитель (см следующий раздел Композиции) Вредителями могут быть, например, насекомые, нематоды, клещи или улитки Микроорганизм способен экспрессировать ген Bacillus, кодирующий белок Bacillus или его фрагмент, обладающие активностью в отношении вредителей или убивающие вредителей, обитающих в филлоплане (поверхность листьев растений) и/или в ризосфере (почва вокруг корней растений) и/или в водной среде, и способный успешно конкурировать в определенной среде (посев или иное место обитания насекомого) с микроорганизмами дикого типа и обеспечивающий стабильное поддержание и экспрессию гена Bacillus, кодирующего белок Bacillus или его фрагмент, обладающие активностью в отношении вредителей или убивающие вредителей Примеры таких микроорганизмов содержат в числе прочих бактерии родов Bacillus, Pseudomonas, Erwima, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophihus, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc и Clostndium, водоросли из семейств Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillanophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasmophyceae и Chlorophyceae, и грибы, в частности дрожжи, например из родов Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodothorula и Aureobasidium В данном описании "пестицидная активность" означает количественное выражение активности против вредителя, которое убивает или задерживает рост вредителя или защищает растение от заражения вредителем 49800 Изобретение далее касается пестицид ных препаратов, содержащих вещество и пестицид на основе Bacillus, а также способов применения пестицидных композиций для борьбы с вредителями Изобретение относится также к способу получения "практически чистого" вещества по изобретению, который предусматривает стадии (а) культивирования штамма Bacillus thurmgiensis в подходящей среде для роста, (б) выделение супернатанта (а) и (в) обработку супернатанта (б) с помощью колоночной хроматографии для очистки вещества В настоящем описании, "практически чистое" вещество означает вещество, которое содержит менее 5% примесей, например белка дельтатоксина Краткое описание чертежей Эти и иные признаки, особенности и преимущества настоящего изобретения будут более понятными из следующего описания, прилагаемой формулы изобретения и сопутствующих чертежей, где На Фиг 1 представлена схема синтеза для получения структуры I На Фиг 2 представлены структуры производных А и В, Фиг 3 показывает проявление синергизма la/lb и NOVODOR™ в отношении Leptmotarsa decemhneata Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Получение вещества Вещество(а) может быть получено из супернатанта ферментации Bacillus thunngiensis из группы, содержащей в числе прочих штаммы B t ЕМСС-0077 с идентификационными характеристиками NRRL В-21090 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0077, ЕМСС0078 с идентификационными характеристиками NRRL B-21091 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0078, ЕМСС-0079 с идентификационными характеристиками NRRL B21092 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0079, ЕМСС-0080 с идентификационными характеристиками NRRL B21093 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0080, ЕМСС-0081 с идентификационными характеристиками NRRL B21094 или его мутанты с практически теми же свойствами, что ЕМСС-0081 Вещество активно против вредных насекомых отряда Жесткокрылых и действует вместе с пестицидами на основе Bacillus как, например, усилитель или синергидный агент В частности, вещество имеет структуру (I) где Ri - аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый) эфир, галоген, (Сі 5) алкокси-группа или аминокислота 10 из группы, содержащей в числе прочих, аланил, валинил, лейцинил, изолейцинил, фенилаланил, глицинил и фенилглицинил, R2- алкил (Сі ю), R3 - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый)эфир, галоген, (Сі 5)алкокси-группа, метиламин, диметиламин, тионил, метилтионил, цианогруппа или их соли из группы, включающей в числе прочих фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат, R4 - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый)эфир, галоген, (Сі б)алкокси-группа или их соли из группы, включающей, но не ограниченной, фосфатом, сульфатом, ацетатом, карбонатом и нитратом, Rs - водород, метокси-, аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый) эфир, галоген или (Ci s) алкокси-группа, R6 - аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый эфир, галоген или (Сі 5) алкокси-группа, R7 - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый)эфир, галоген, (Сі 5) алкокси-группа или их соли из группы, включающей в числе прочих, фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат, Rs - водород, аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый)эфир, галоген, (Сі 5)алкокси-группа, метиламин, диметиламин, тионил, метилтионил, цианогруппа или их соли из группы, включающей в числе прочих фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат, Rg - алкил (Сі ю) и R-іо - аминогруппа, гидроксил, алкил (Сі ю), алкиловый (Сі ю) эфир, ариловый (например, бензоиловый, нитробензоиловый, динитробензоиловый, галобензоиловый) эфир, галоген, (Сі 5) алкокси-группа или аминокислота из группы, содержащей в числе прочих, аланил, валинил, лейцинил, изолейцинил, фенилаланил, глицинил и фенилглицинил, Атомы азота пиразина могут быть замещены алкилом (Сі ю), алкиловым (Сі ю) эфиром, ариловым (например, бензоиловым, нитробензоиловым, динитробензоиловым, галобензоиловым) эфиром или кислородом 49800 11 Следует понимать, что изобретение охватывает все стереоизомерные формы соединений структуры I, а также рацематы В большинстве случаев, вещество структуры la далее будет упоминаться как la, а вещество структуры Ib - как Ib R4 OR R,R2N RO OR la R, Ri, R 2 R 3 = H Ib R, Ri,R2= H, R3 = OH Bacillus thunngiensis можно культивировать с использованием известных сред и способов ферментации (см , например, Rogoff et al , 1969, J Invertabrate Path 18 353-358, Dulmage et al , в Microbial Control of pests and Plant Diseases, H D Burges, ed Academic Press, N Y , 1980) После завершения цикла ферментации супернатант может быть получен выделением спор и кристаллов В t из культуральной жидкости известными способами, например центрифугированием и/или ультрафильтрацией Вещество, содержащееся в супернатанте, можно выделить известными способами, например ультрафильтрацией, выпариванием и высушиванием после разбрызгивания Вещество согласно изобретению можно также получить химическим синтезом с помощью известных способов Пиразиновое кольцо с подходящими замещающими и защитными группами для структуры I может быть получено рядом реакций, например спонтанной конденсацией а-аминокарбонильных соединений Образующееся дигидропиразиновое промежуточное соединение легко окисляется кислородом до пиразина Димеризация одного ааминокарбонильного соединения приведет к образованию одного пиразина, тогда как реакция двух различных а-аминокарбонильных соединений должна привести к образованию трех продуктов, указанное вещество можно выделить хроматографическим разделением (см, Фиг 1) Последняя реакция позволяет вести синтез пиразинов с различными заместителями с каждой стороны цикла Очистку вещества проводят различными известными способами, в том числе хроматографией (например, ионообменной хроматографией и гель-хроматографией), электрофорезом, использованием различной растворимости, экстракцией или иными известными стандартными способами (см, например Protein Purification, eds J-C Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989) Активность указаного вещества можетбыть проанализирована биотестом с использованием известных способов, например введением искусственного корма, раскладкой искусственного корма, окраской листьев, обмакиванием листьев и 12 разбрызгиванием по листве Подобные биотесты приведены ниже в разделе Примеры Композиции, содержащие вещество Предлагаемое вещество можно использовать индивидуально, вместе с пестицидом на основе Bacillus, который определен выше как штамм, споры, белок или его фрагмент с активностью в отношении вредителей или убивающей их, или с приемлемым носителем в пестицидных составах, которые представлены, например, суспензией, эмульсией, пылевидным порошком, диспергируемыми гранулами, смачивающимся порошком, эмульгирующимся концентратом, аэрозолем или пропитанными гранулами Примеры подобных штаммов Bacillus включают в числе прочих Bacillus thunngiensis subsp kurstaki (товарный знак DIPEL™ из Abbott Laboratoties, Inc , JAVELIN™ из Sandoz, BIOBIT™ из Novo Nordisk A/S, FORAY™ из Novo Nordisk A/S MVP™ из Mycogen, BACTOSPEINE™ из Novo Nordisk A/S и THURICIDE™ из Sandoz Bacillus thunngiensis subsp aizawai (товарный знак FLORBAC™ из Novo Nordisk A/S,H XENTARI™ из Abbott Laboratoties, Inc), Bacillus thunngiensis subsp tenebnonis (товарный знак NOVODOR™ из Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ из Sandoz, M-TRAK™ и M-ONE™ из Mycogen) Bacillus thunngiensis subsp israelensis (товарный знак BACTIMOS™ из Sandoz или SKEETAL™ из Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ из Sandoz и VECTOBAC™ из Abbott Laboratoties, Inc), Bacillus sphaencus (товарный знак SPRERIMOS™ из Novo Nordisk A/S), Bacillus thunngiensis kurstaki/tenebnoms (товарный знак FOIL™ из Ecogen), Bacillus thunngiensis kurstaki/aizawai (товарный знак CONDOR™ из Ecogen, и AGREE из Ciba-Geigy) и Bacillus thunngiensis kurstaki/kurstaki (товарный знак CUTLASS™ из Ecogen) Белок на основе Bacillus может быть выбран из группы, содержащей в числе прочих Cryl, Cryll, Crylll, CrylV, CryV, и CryVI Предлагаемое вещество может находиться в составе с другими факторами или веществами, выделенными из супернатанта Bacillus, включающими, но не ограниченными экзотоксином и/или усиливающим фактором Композиция может также содержать пестицид на основе Bacillus и/или вирус с пестицидными свойствами и приемлемый носитель В частности, компоненты состава могут проявлять синергетический эффект В результате предлагаемый состав может иметь более высокую эффективность, чем эффективность каждого отдельного компонента Синергизм может проявляться как равная или повышенная эффективность при более низких дозах и/или менее частых обработках, чем рекомендуется для каждого отдельного компонента Как вариант, указанное вещество может усиливать пестицид на основе Bacillus В составах, содержащих вещество и пестицид на основе Bacillus, количество вещества составляет 0,001-300 r/LTU В настоящем описании "LTU" означает единицу Leptmotarsa texana, определенную биотестом В биотесте сравнивают образец с стандартным референс-материалом Bacil 13 lus, используя Leptmotarsa texana или иного вредителя в качестве стандартного тест-организма Активность определяют делением LC50 референсстандарта с последующим умножением на активность референс-стандарта В частности, состав может содержать указанное вещество практически в чистом виде или супенатант Bacillus в высушенной, концентрированой или жидкой форме и подходящий пестицидный носитель, примеры которого приведены ниже Этот состав можно наносить отдельно на растения, например трансгенные растения В частности, состав можно наносить на растения, уже несущие ген Bacillus thunngiensis С другой стороны, состав можно нанести на растения, предварительно обработанные составом Bacillus thunngiensis Вещество присутствует в составе в количестве 0,001-60% (вес) Такие описанные выше составы можно получить добавлением поверхностно-активного агента, инертного носителя, консерванта, увлажнителя, пищевого стимулятора, аттрактанта, инкапсулирующего агента, связывающего агента, эмульгатора, красителя, агента, защищающего от УФлучей, буфера, агента текучести или иных компонентов, облегчающих обращение с продуктом и его применение против определенных целевых вредителей Подходящие поверхностно-активные агенты включают в числе прочих анионные соединения, такие, как карбоксилат, например карбоксилат металла жирной кислоты с длинной цепью, Nацилсаркозинат, моно- или диэфиры фосфорной кислоты и этокислатов жирного спирта или соли указанных эфиров, сульфаты жирного спирта, например додецилсульфат натрия, октадецилсульфат натрия или цитилсульфат натрия, сульфаты этоксилированного жирного спирта, сульфаты этоксилированного алкилфенела, сульфонаты лигнина, сульфонаты нефтяных продуктов, алкиларилсульфонаты, например алкилбензолсульфонаты или низшие алкилнафталинсульфонаты напримербутилнафталинсульфонат, соли конденсатов сульфонированного нафталин-формальдегида, соли конденсатов фенол-формальдегида или более сложные сульфонаты, например амиды сульфонатов, например сульфонированный продукт конденсации олеиновой кислоты и N-метилтаурина, или диалкилсульфосукцинаты, например сульфонат натрия или диоктилсукцинат Неионные агенты включают в числе прочих продукты конденсации эфиров жирных кислот, жирных спиртов, амидов жирных кислот или фенолов, замещенных жирными алкилами или алкенилами, с этиленоксидом, жирными эфирами простых эфиров спиртов, содержащих несколько атомов водорода, например сорбитановые эфиры жирных кислот, продукты конденсации указанных эфиров с этиленоксидом, например эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты, блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида, ацетиленовые гликоли, например 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4,7-диол, или этоксилированные ацетиленовые гликоли Катионные поверхностно-активные агенты включают, напри 49800 14 мер, алифатические моно-, ди- или полиамины в виде ацетата, нафтената или олеата, кислородсодержащий амин, например аминоксид полиоксиэтиленалкиламина, амин, связанный с амидом, полученный конденсацией карбоновой кислоты с ди- или полиамином, или четвертичную соль аммония Примеры инертных материалов включают в числе прочих неорганические минералы, например каолин, слюду, гипс, удобрения, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты или фосфаты, органические материалы, например сахар, крахмалы или циклодекстрины, или материалы растительной природы, например древесину, пробку, порошок из стержней початков кукурузы, шелуху риса, скорлупу арахиса или грецких орехов Составы настоящего изобретения могут быть в форме, подходящей для непосредственного применения или в виде концентрата или первичного состава, который требует разведения соответствующим количеством воды или иного растворителя перед применением Концентрация пестицида изменяется в зависимости от природы определенного состава, в частности, представлен ли он концентратом, или готов к употреблению Состав содержит 1-98% твердого или жидкого инертного носителя и 0-50%, преимущественно 0,1-50% поверхностно-активного вещества Эти составы применяют в концентрации, рекомендуемой для коммерческих продуктов, как правило 0,011-5,5кг/га в сухой форме и 0,0125-31,25л/га в жидкой форме Далее, пестицид и/или вещество на основе Bacillus могут быть обработаны перед получением состава для пролонгирования пестицидной активности при применении в среде обитания целевого вредителя Продолжительность обработки не должна быть вредной для пестицида и/или вещества на основе Bacillus Такую обработку проводят химическими и/или физическими средствами и продолжительность обработки не должна отрицательно сказываться на свойствах составов Примеры химических реагентов включают в числе прочих галогенирующие агенты, альдегиды, например формальдегид и глугаральдегид, обеззараживающие агенты, например хлорид зефирана, спирты, например изопропанол и этанол, и гистологические фиксаторы, например фиксаторы Boum и Helly (см , например, HUMASON, Animal Tissue Techniques, W H Freeman and Co , 1967) Составы по изобретению наносят непосредственно на растения, например разбрызгиванием или распылением во время начала появления вредителей на растениях или перед появлением вредителей в качестве профилактической меры Растения, которые можно защищать согласно изобретению, включают в числе прочих злаки (пшеницу, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и близкие культуры), свеклу (сахарную и кормовую), косточковые, семечковые и сочными плоды (яблоки, груши, сливы, персики, миндаль, вишню, землянику, малину и черную смородину), бобовые растения (люцерну, бобы, чечевицу, горох, сою), масличные растения (рапс, горчицу, мак, оливы, подсолнечник, кокос, клещевину, какао, арахис), 15 тыквенные (огурец, кабачок, дыни), текстильные растения (хлопок, лен, коноплю, джут), цитрусовые растениями (апельсины, лимоны, грейпфруты, мандарины), овощи (шпинат, салат, спаржу, капусту и другие растения рода Brassica, морковь, луки, томаты, картофель), лавровые (авокадо, коричное и камфорное деревья), лиственные и хвойные деревья (например, липа, тис, дуб, ольху, тополь, березу, ель, лиственницу, сосну) или такие растения, как кукурузу, дерновые растения, табак, орехи, кофе, сахарный тростник, чай, виноград, хмель, банан и растения-каучуконосы, а также декоративные растения Субстанцию применяют по листу, при вспашке, разбрасывают гранулы, раскладывают или пропитывают почву Важно получить хорошие результаты при борьбе с вредителями на ранних стадиях роста растения, когда оно может быть сильно повреждено Спрей или порошок могут при необходимости содержать другой пестицид Желательно нанесение предлагаемого состава прямо на растения Составы данного изобретения могут быть использованы для уничтожения вредителей отряда Жесткокрылых, например, Leptmotarsa sp (Leptmotarsa texana, Leptmotarsa decemlmeata), Diabrotica undecimpunctata, Dendroctonus frontahs, Anthonomus grandis, Acanthoscehdes obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna vanvestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicanus elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp, Cyclocephala boreahs, Cyclocephala Immaculata, Macrodactylus subspmosus, Popillla japomca, Rhizotrogus majahs, Alphitoblus diapermus, Palorus ratzeburgi, Tenebno mohtor, Tenebno obscurus, Tribohum castaneum, Tribohum confusum, Tnbohus destructor, Составы по изобретению также можно использовать для уничтожения в числе прочих вредителей отряда Чешуекрылых, например, Achroia gnsella, Aclens gfoverana, Aclens vanana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometana, Amyelois transitella, Anagasta kuehmella, Anarsia hneatella, Anisota senatona, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatahs, Archips sp , Argyrotaema sp , Athetis mmdara, Bombyx mon, Bucculatnx thurbenella, Cadra cautella, Choristoneura sp , Cochylls hospes, Cohas eurytheme, Corcyra cephalomca, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integernma, Dendrohmus sibencus, Desmia funerahs, Diaphama hyalmata, Diaphania mtidahs, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharahs, Ennomos subsignana, Eoreuma loftim, Ephestia elutella, Eranms tilana, Estigmene acrea, Euha salubncola, Eupocoelha ambiguella, Eupoeciha ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messona, Gallena mellonella, Graphohta molesta, Harnsma amencana, Hehcoverpa subflexa, Hehcoverpa zea, Hehothis virescens, Hemileuca ohviae, Homoeosoma electellum, Hyphantna cunea, Keifena lycopersicella, Lambdma fiscellana fiscellana, Lambdma fiscellana lugubrosa, Leucoma sahcis, Lobesia botrana, Loxostege sticticahs, Lymantna dispar, Macalla thyrsisahs, Malacosoma sp , Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca qumquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulahs, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp , Ostrima nubilahs, Paleacnta vernata, Papiho cresphontes, Pectinophora 49800 16 gossypiella, Phrygamdia cahformca, Phyllonorycter blancardella, Piens парі, Piens rapae, Plathyrena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptiha carduidactyla, Plodia mterpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia umpuncta, Pseudoplasia mcludens, Sabulodes aegrotata, Schizura concmna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp, Thaurnstopoea pityocampa, Tmeola blsselhella, Tnchoplusia m, Udea rubigahs, Xylomyges cunahs, Yponomeuta padella, Двукрылых, например, Aedes sp , Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barben, Anopheles quadnmaculatus, Armigeres subalbatus, Calhphora stydia, Calhphora vicma, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochhomyia macellana, Culex sp , Cuhseta mornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossma austem, Glossma brevipalpis, Glossma fuscipes, Glossma morsitans centrahs, Glossma morsitans morsitans, Glossma morsitans submorsitans, Glossma palhpipes, Glossma palpahs gambiensis, Glossma palpahs palpahs, Glossma tachmoides, Haemagogus equmus, Haematobius irntans, Hypoderma bovis, Hydoderma hneatum, Leucopis nmae, Luciha cuprma, Luciha sencata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannom, Lyconella mail, Mayetiola destructor, Musca autumnahs, Musca domestica, Neobelheria sp, Nephrotoma suturahs, Ophyra aenescens, Phaemcia sencata, Phlebotomus sp , Phormia regma, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercorana, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites ambomensis, Tnpteroides bambusa, Клещей, например, Ohgonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae, Перепончатокрылых, например, Indomyrmex humihs, Solenopsis mvicta, Термитов, например, Reticuhtermes hesperus, Reticuhtermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticolhs, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans, Блох, например, Ceratophyllus galImae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segms, Ctenocephahdes cams, Ctenocephahdes fehs, Echisnophaga gallmacea, Pulex irntans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabihs, Tunda penetrans, Тиленхид, например, Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения Примеры Пример 1 Культивирование различных изолятов B t Субкультуры ЕМСС-0077, ЕМСС-0078, ЕМСС0079, ЕМСС-0080 и ЕМСС-0081, которые поддерживали в пробирках со скошенным агаризованным питательным бульоном, использовали для инокуляции колб для качалок емкостью 250мл, содержащих 50мл среды следующего состава Кукурузный экстракт 15г/л Малтрин-100 40г/л Картофельный крахмал ЗОг/л КН2РО4 1,77г/л К2НРО4 4,53г/л рН среды довели до 7,0, используя 10 N NaOH 17 После инокуляции колбы для качалок инкубировали при 30°С на роторной качалке при 250об/мин в течение 72 час Цельные культуральные жидкости тестировали в отношении Diabrotica undecimpunctata Пример 2 Активность цельных культуральных жидкостей различных изолятов B t в отношении Diabrotica undecimounctata Из цельных культуральных жидкостей, полученных при описанной выше ферментации отобрали по 2,5мл и перенесли из качалочных колб в полипропиленовые пробирки для биотестов емкостью 50мл В каждую из пробирок добавили корм для Diabrotica undecimpunctata до конечного объема 25мл Корм и тест-материал интенсивно перемешали и распределили на пластинках для биотеста для проведения биотеста По три-шесть 49800 18 яиц Diabrotica undecimpunctata разложили на поверхности "корма" Пластинки для биотеста закрыли Mylar и инкубировали их при 28°С без фотопериода Подсчет проводили в течение 7 дней Гибель оценили на 7-ой день после инкубирования SS7 = размеру мертвой личинки на 7 день при сравнении с живой контрольной личинкой на тот же день, что SS7 из 4 SS7 = 3 SS7 = 2 и SS7 = 1 представляют размер личинки как 75%, 50%, 25% относительно живой контрольной личинки из 4 Результаты представлены ниже в Таблице 1 Эти результаты показывают, что все проверенные 5 штаммов давали 100% гибели Более того, размер мертвых личинок составлял 12,5% от размера контрольной живой личинки Таблица 1 Активность в отношении Diabrotica undecimpunctata в цельной культуральнои жидкости Штамм % Гибели SS7 ЕМСС-0077 100 05 ЕМСС-0078 100 05 ЕМСС-0079 100 05 ЕМСС-0080 100 05 ЕМСС-0081 100 05 Пример 3 Локализация активности в отношении Diabrotica undecimpunctata Для проверки, связана ли активность Diabrotica undecimpunctata с дельтаэндотоксином/спорами или супернатантом 2,5мл цельных культуральных жидкостей ЕМСС-0077, ЕМСС-0080 и ЕМСС-0081 и NB125 (Bacillus thurmgiensis subsp tenebnoms, выращенная в идентичных условиях) центрифугировали на центрифуге Sorvall RC-5B при 15000об/мин (ротор Sorvall SS34) в течение 15мин для разделения супернатанта и осадка В осадке выделялись кристаллические дельта-эндотоксины и споры Дельта-эндотоксины, образуемые активным в отношении Diabrotica undecimpunctata изолятом В t ЕМСС-0077, имели молекулярные массы 66кД, 29кД и 12кД поданным SDS-PAGE Дельтаэндотоксины, образуемые активным в отношении Diabrotica undecimpunctata изолятом B t ЕМСС0078 имели мол массы 153кД, 77кД, 67кД, 61 кД, 50кД, 42кД, 34кД, ЗОкД, 24кД по данным SDSPAGE Дельта-эндотоксины, образуемые активным в отношении Diabrotica undecimpunctata изолятом B t ЕМСС-0079 имели мол массы 135145кД по данным SDS-PAGE Дельтаэндотоксины, образуемые активным в отношении Diabrotica undecimpunctata изолятом B t ЕМСС 0080 имели мол массы 94кД и 40кД поданным SDS-PAGE Дельта-эндотоксины, образуемые активным в отношении Diabrotica undecimpunctata изолятом Bt ЕМСС-0081 имели мол массы 129кД и 32кД по данным SDS-PAGE Каждый супернатант (2,5мл), полученный описанным выше центрифугированием перенесли в полипропиленовые пробирки для биотестов емкостью 50мл Затем осадок ресуспендировали в 2,5мл стерильной дистиллированной воды и перенесли в отдельную полипропиленовую пробирку для биотестов емкостью 50мл Затем в пробирки для биотестов, которые содержали супернатант или ресуспендированный осадок добавили корм для Diabrotica undecimpunctata до конечного объема 25мл Остальные стадии биотеста идентичны описанным выше Результаты учитывали как описано выше Результаты, представленные в Таблице 2 показывают, что активность ЕМСС-0077, ЕМСС0080 и ЕМСС-0081 в отношении Diabrotica undecimpunctata присутствует во всех супернатантах, тогда как в осадке незначительная активность в отношении Diabrotica undecimpunctata известного Bacillus thunngiensis subsp tenebnoms сконцентрирована (споры и кристаллы) 19 49800 20 Таблица 2 Аісгивность в отношении Diabrotica undecimpunctata в супернатанте и осадке Штамм Фракция % Гибели Задержка роста ЕМСС-0077 Супернатант 100 0,5 Осадок 10 3,0 ЕМСС-0080 Супернатант 100 0,5 Осадок 0 4,0 ЕМСС-0081 Супернатант 100 0,5 Осадок 0 3,0 NB125 Супернатант 0 3,0 Осадок 50 1,5 Пример 4 Активность в отношении Leptmotarsa texana После фильтрации через мембрану 0,2ц супернатант ЕМСС-0080, полученный в Примере 1, использовали для анализа активности в отношении жуков Фильтрованный супернатант нанесли на листья баклажана в объеме 190 (л/га) Использовали разведения 0, 1 1 , 14, 1 8 (супернатант деиони зированная вода, объем/объем) Личинки Leptmotarsa texana поместили на обработанные листья согласно стандартным способам На каждый лист помещали по 20 личинок Leptmotarsa texana Результаты приведены в Таблице 3 ниже, где показано, что фильтрованный супернатант ЕМСС0080 активен в отношении Leptmotarsa texana Таблица 3 Активность в отношении Leptmotarsa taxana у ЕМСС-0080 Штамм Разведение 0 11 ЕМСС-0080 14 18 Необработанный контроль Пример 5 Синергичный эффект ЕМСС-0080 и NOVODOR™ Результаты, представленные в Таблице 3 выше, показывают, что один супернатант ЕМСС0080 не активен в разведении 1 8 Однако, при обработке листьев баклажана 1,25% или 2,5% сконцентрированным в 10 раз супернатантом % Гибели 95 55 20 0 0 ЕМСС-0080 вместе с 200цг NOVODOR™ (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)/Mn получают синергичный эффект, проявляющийся в резком уменьшении LC5o и LC9o NOVODOR™ Данные приведены в Таблице 4 ниже Таблица 4 Синергичный эффект ЕМСС-0080 и NOVODOR™ Образец LCsoOLr/r)1 І_С90(цг/гГ NOVODOR™ 642 4286 NOVODOR™ + 1 25% ЕМСС-0080 250 1292 NOVODOR™ + 2 5% ЕМСС-0080 98 490 YCso определена, как концентрация, которая убивает 50% популяции целевых насекомых 2 LCgo определена, как концентрация, которая убивает 90% популяции целевых насекомых 3 наклон кривой представляет собой кривую зависимости % гибели от логарифма концентрации Пример 6 Очистка активного в отношении Жесткокрылых вещества, образуемого штаммом B t ЕМСС-0080 Штамм В t ЕМСС-0080 выращивают в течение 24 час при 30°С в среде следующего состава в г/л при рН 7,0 Мальтодекстрин 40г Наклон кривой 1,55 1,79 1,83 Соевый белок 40г 1,8г КН2РО4 4,5г К2НРО4 0,Зг MgSO4 x7H2O Микроэлементы 0,2мл Клетки и иные нерастворимые компоненты удалили из цельной культуральнои жидкости штамма B t ЕМСС-0080 центрифугированием с последующей фильтрацией супернатанта через Целит и мембрану 0,2ц Раствор после мембранного разделения, затем сконцентрировали в 10 раз выпариванием Выделение активных в отношении жесткокрылых веществ(а) из сконцентрированного в 10 раз 21 49800 раствора провели четырехстадийным способом очистки Во время очистки провели мониторинг активности с помощью поверхностного биотеста с использованием Diabrotica undecimpunctata, а чистоту определили капиллярным электрофорезом, как описано в Примере 8 На всех хром ато графических стадиях провели детекцию при длине волны 226нм В частности, поверхностный биотест провели следующим образом Образцы сконцентрированного в 10 раз раствора после мембранной фильтрации внесли в отдельные лунки планшета для микротитрования, содержащие 200 шп отвержденного искусственного корма для насекомых на лунку и высушили на воздухе Двух-четырех новорожденных Diabrotica undecimpunctata (корневые черви, CRW) осторожно поместили в каждую лунку с помощью кисточки Затем планшеты для микротитрования закрыли Mylar с отверстиями для воздухообмена и инкубировали их при 30°С и 80% влажности Оценку процента гибели проводили в течение 5 дней На первой стадии сконцентрированный в 10 раз раствор сначала очистили на хроматографических колонках Pharmacia SP Sephadex® C-25 (катионобменник) (размер колонки 5х30см) Образцы сконцентрированного в 10 раз раствора по 450мл развели до 18л деионизированной водой, нанесли на колонку, предварительно уравновешенную 20мМ аммоний-ацетатным буфером рН 5,0 Элюацию с колонки проводили со скоростью 18мл/мин 5,0л непрерывного градиента от 20мМ до 0,5М аммоний-ацетатного буфера рН 5,0 Фракции по 10мл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту Активные фракции объединили (приблизительно 150мл), лиофилизировали и перерастворили в деионизированной воде до приблизительно 1/5 исходного объема На второй стадии 25мл образца, полученного на первой стадии, нанесли на колонку для гельфильтрации BioRad P2 (extra fine) размером 5x100см, которую предварительно уравновесили деионизированной водой Элюацию с колонки проводили со скоростью 1 мл/мин деионизированной водой Фракции по 10мл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту капиллярным электрофорезом Активные фракции объединили (приблизительно 400мл) На третьей стадии 400мл, полученные на второй стадии, развели до 16л деионизированной водой Раствор нанесли на колонку Pharmacia S Sepharose® Fast Flow (сильный катионообменник) размером 5х30см, которую предварительно уравновесили 20мМ аммоний-ацетатного буфера при рН 5,0 Элюацию с колонки проводили со скоростью 17мл/мин 5,0л непрерывного градиента от 20мМ до 0,5М аммоний-ацетатного буфера рН 5,0 Фракции по 20мл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту Активные фракции объединили (приблизительно 250мл), а затем лиофилизировали досуха для удаления летучего аммоний-ацетатного буфера На четвертой стадии лиофилизированный образец, полученный на третьей стадии, перерастворили в 400мл деионизированной воды Рас 22 твор наносили на колонку BioRad Chelex® 100 (0,9х30см), которую предварительно уравновешивали 20мМ аммоний-формиатным буфером, рН 4,0 Элюацию с колонки проводили со скоростью 5мл/мин 2,4л ступенчатого градиента от 0,02->0,1—>0,2—>0,35->0,5->1,0М аммонийформиатного буфера, рН 4,0 Фракции по 20мл отобрали, анализировали биотестом и определили чистоту Активные фракции объединили (приблизительно 300мл), а затем лиофилизировали досуха для удаления летучего аммонийформиатного буфера С помощью капиллярного электрофореза показали, что очищенный активный в отношении Жесткокрылых материал содержит два вещества, la и Ib Пример 7 Доказательство структуры вещества, активного в отношении Жесткокрылых Структуры соединений la и Ib установили на основании данных спектроскопии, полученных для их ацетилированных производных 114мг смеси la и Ib ацетилировали 5мл уксусного ангидрида в 5мл пиридина с кристаллами 4диметиламинопиридина в качестве катализатора в течение 24 часов при комнатной температуре, а затем очистили с помощью полупрепаративной RP-Cis ВЭЖХ 5мг образца в 25шп нанесли на колонку и элюировали со скоростью 4мл/мин смесью вода-ацетонитрил (80% 20%) Детекцию проводили при длине волны 254нм После очистки получили 2 ацетилированных производных, названных Производное А и Производное В Структуры производных А и В представлены на Фиг 4 Данные ЯМР-спектроскопии, полученные для Производного А указывают на присутствие 14 атомов углерода и 17 протонов Однако, массспектральные данные предполагают мол массу 652 и формулу C28H40N6O12 (точная масса 653,2801,МН+, расчетная 653,2782) Это позволило установить, что соединение симметрично, причем только половина сигналов наблюдается при ЯМР-спектроскопии При ЯМР-спектроскопии наблюдается несколько спиновых систем Центральное пиразиновое кольцо, замещенное в положениях 2 и 5 определено по синглетам протонов в сильном поле при 8,6ррт (Н-3 и Н-6), которые проявили широкий диапазон взаимодействия со всеми атомами углерода в цикле и с первым атомом углерода боковой цепи (С-7) Боковая цепь из трех атомов углерода ацетилирована по положениям 7 и 8 с метиленом в положении 9 Атом углерода 9, как показано, имеет широкий диапазон корреляции с карбонилом эфира, а эфир, как установлено, является частью аланина, который ацетилирован по аминогруппе Структура Производного В отличается по одному положению от Производного А В одной из боковых цепей производного В атом углерода С-7 не ацетилирован и не связан с кислородом, а, как было показано, представлен метиленом Другая боковая цепь идентична таковой Производного А Это различие только по одному атому кислорода также наблюдали в данных масс-спектрометрии 23 Данные масс-спеїсгрометрии показали точную массу 595,2722 (МН+, расчетная 595,2727) для Производного В, что соответствует формуле Оптические плотности Производных 27 А и В следующие Производное А - [а]о27 = -6,9°, a 49800 24 Производное В - [а]о = +32° Полные оценки данных ПМР- и ^С-ЯМР-спектроскопии сделаны на основе экспериментов по нарушению влияния, COSY, HMQC и НМВС Данные представлены в таблице 5 Таблица 5 Данные ПМР- и '^С-ЯМР-спектроскопии Производного А и Производного В в D-4 метаноле 1Н(мультипл ,хим сдвиг, константа спинізс положение спинового взаимодействия) Производи А Производи В A В 2 152,9 154,7 3 144,2 144,4 8,6(5,1 Н) 8,54(s,1 H) 5 152,9 151,1 6 144,2 145,6 8,6(5,1 Н) 2,95(dd,1H, J=13,9, 7 5,84(d,1HIJ=7,4Hz 9,2)3,10(dd,1H, J=13,9, 74,0 37,5 4,8 8 52,1 50,2 4,72(m,1 H) 4,48(m,1 H) 4,24(dd,1H, J=11,5, 4,11(dd,1H, 9 6,7Hz)4,30(dd,1H, 63,5 66,3 J=11,4,6,7) 4,20(m,1 H) J=11,5, 6,7Hz) 10 174,8# 174,7 11 4,20(q,1H, J=7,1Hz) 50,3 49,8 4,20(m,1 H) 12 17,8 18,1 1,2(d,3H, J=7,1Hz) 1,17(d,3H, J=7,3) 13 74,0 73,9 5,84(d,1H, J=7,4Hz) 5,80(d,1H, J=7,4) 14 52,1 52,1 4,72(m,1 H) 4,70(m,1 H) 4,24(dd,1H, J=11,5, 4,20(m,1 H) 6,7Hz)4,30(dd,1H, 15 63,5 63,6 4,30(dd,1H, J=11,6, 6,8) J=11,5,6,7) 16 174 8 f 174,7 17 4,20(q,1H, J=7,1Hz) 50,3 50,4 4,20(m,1 H) 18 17,8 17,8 1,2(d,3H, J=7,1Hz) 1,20(d,3H, J=7,3Hz) 19 171,4f 171,4 20 2,1* 1,97 20,6** 20,6 21 172,9f 172,4 22 2,0* 2,02 20,5** 22,5 23 172,3f 172,5 24 1,95* 2,09 22,5** 22,6 25 172,3f 172,9 26 1,95* 2,03 22,5** 20,7 27 172,9f 171,4 28 2,0* 1,95 20,5** 20,6 29 171,4f 30 2,1* 20,6** *, **, f - сигналы могут обмениваться Данные масс-спектроскопии для смеси соединений la и Ib дают два молекулярных иона - 400 и 384 На основании этих данных установлено, что молекулярная формула соединения la СібН28МбОє и соединения Ib - C16H28N6O5 Структуры la и Ib установлены сравнением данных ЯМР-спектрометрии для Производного А и Производного В с данными ЯМР-спектрометрии для смеси la и Ib Структуры la и Ib приведены ниже lai R, R1, R2, R3= H Ib R, Ri,R 2 = H, R3 = OH Свойства соединений la и Ib и их ацетилированных производных R3 OR R,R2N RO OR представлены ниже Производное А Молекулярный вес Эмпирическая фор 652 С28ГІ40І\ІбОі2 25 мула UV(MeOH) MS(FAB) Производное В Молекулярный вес Эмпирическая формула UV(MeOH) MS(FAB) la Молекулярный вес Эмпирическая формула UV(H2O) MS(FAB) Ib Молекулярный вес Эмпирическая формула UV(H2O) MS(FAB) 49800 275, ЗЮнм (М+Н) 653,2801, 653,2782 m/z расч 594 C26H3840N6O10 275, ЗЮнм (М+Н) m/z 595,2722, расч 595,2727 400 C 16 H 28 N 6 O 6 275, 310 nm (М+Н) 401 384 C16H28N6O5 275, ЗЮнм (М+Н) 385 Пример 8 Определение количества соединений la и Ib в культуральных жидкостях Штамм B t EMCC-0080 выращен, как описано в Примере 1 Концентрация соединений la и Ib в культуральных жидкостях установлена капиллярным электрофорезом Для количественного определения была использована система капиллярного электрофореза BioRad Biofocus 3000, снабженная капилляром без оболочки (50 цм х 50см), 0,1 М фосфат при рН 2,5, напряжение 20кВ, полярность от положительной до отрицательной и детекция при длине волны 200нм Объем образца составляет ЗОцл при дополнительной инжекции 0,35кг/см2 Время анализа составило 10 минут при элюации активных в отношении Жесткокрылых соединений la и Ib 6,0 и 5,9 минут, соответственно Альтернативно, для количественного определения была использована система капиллярного электрофореза Beckman P/ACE 2100, снабженная капилляром без оболочки (50цм х 47см), 0,1 М фосфатный буфер при рН 2,5, напряжение 20КВ, полярность от положительной до отрицательной, и детекция при длине волны 200нм Объем образца составляет ЗОшп при инжекции под давлением в течение Юсек Время анализа составляет 10 минут при элюции активных в отношении Жесткокрылых соединений la и Ib 7,0 и 6,7 минут, соответственно Клетки и иные нерастворимые компоненты удалили из цельной культуральной жидкости штамма B t EMCC-0080 центрифугированием и фильтрацией через Целит и мембрану 0,2 Полученный супернатант анализировали способом капиллярного электрофореза, как описано выше Результаты показали, что активные в отношении Жесткокрылых соединения la и Ib присутствуют в культуральной жидкости в концентрации приблизительно 90мг/л каждая 26 Пример 9 Определение активности соединений la и Ib Относительная активность неочищенной смеси соединений la и Ib (в соотношении приблизительно 1 1) установлена при использовании Leptmotarsa texana в качестве тест-н асе ко мого и сравнении гибели, ассоциированной с препаратом Bacillus thunngiensis subsp tenebnoms в качестве внутреннего стандарта Биотесты на листьях провели для установления активности неочищенной смеси соединений la и Ib в отношении Leptmotarsa texana Для проведения биотеста на листьях тест-материалы и стандарты отвесили в центрифужные пробирки емкостью 50мл и суспендировали в деионизированной воде, содержащей 0,1% Tween® 20 1200мг стандарта Bacillus thunngiensis subsp tenebnoms отвесили и суспендировали с получением конечной концентрации 12000ц/г Тестобразцы (например NOVODOR™ и NOVODOR™ с соединениями la и Ib) обрабатывали подобным образом, пока уровень результатов биотеста не показывал, что внесенная доза слишком велика или слишком низка для получения достаточного количества достоверных данных В таком случае концентрацию первичного раствора повышали или понижали изменением количества добавленного в него растворителя Затем каждый образец гомогенизировали в течение ЗОсек, используя гомогенизатор Virtis и обработали ультразвуком в течение 20сек, ЮОвт с помощью ультразвукового гомогенизатора Braunsomc 1510 Каждый из этих исходных растворов затем развели, используя Hamilton Microlab 1000 для получения 7 серийных разведении, содержащих 3000, 2000, 1333, 857, 545, 364 и 245 ц/мл в 16мл Каждый из этих растворов по 16мл нанесли на приблизительно 19дм2 листьев баклажана с помощью распылителя Devnes Linear Track, откалиброванного для нанесения 190л/га Контрольные листья опылили 16мл деионизированной воды Листья высушили на воздухе и поместили в одноунциевую прозрачную пластмассовую чашку, содержащую 5 личинок Leptmotarsa texana второй возрастной стадии На листья затем поместили картонные крышки и вдавливанием крышек вырезали из листьев диски по 4см и внесли их в чашки Затем чашки перевернули и личинки упали на обработанные поверхности листьев Для каждого из 7 серийных разведении готовили по 8 чашек Чашки сложили, пометили, поместили на подставки и инкубировали в течение 3 дней при 30°С и 65% относительной влажности Эти 56 экспериментальных и 8 контрольных чашек составляли один биотест Через 3 дня определили уровень гибели насекомых После резкого удара по каждой чашке определили, какие личинки неподвижны, и посчитали их мертвыми Процент гибели вычислили, а данные анализировали с помощью параллельного пробит-анализа При этом оценивали LC50, LC90 наклон линии регрессии, коэффициент вариации, а также активности Для определения активности неочищенную смесь соединений la и Ib развели, анализировали биотестом и сравнили со стандартом Bacillus thur 27 49800 mgiensis subsp tenebnonis, аісгивность которого составляла 20000 LTU/г (единиц Leptmotarsa texana/г) Результаты активности, представленные в таблице 6 ниже, показывают, что неочищенная 28 смесь соединений 1а и Ib (1 1) имеет активность 75555 LTU на г активного ингредиента при LC50 70цг/мл (1,8мг общего активного ингредиента/мл) Таблица 6 Образец Смесь la/lb Активность смеси соединений la и Ib LC50 м-г/мл 70 Пример 10 Потенцирование кристаллического дельта-эндотоксина Bacillus thunngiensis subsp tenebnonis соединениями la и Ib Способность соединений la и Ib усиливать инсектицидную активность кристаллического дельтаэндотоксина Bacillus thunngiensis subsp tenebnonis в отношении Leptmotarsa texana была установлена добавлением неочищенной смеси соединений la и Ib к NOVODOR™ и определением LCso с помощью параллельного пробит-анализа Биотесты на листьях проводили в отношении Leptmotarsa texana, как описано в примере 9, для определения уровня усиления, полученного при добавлении соединений la и Ib к NOVODOR™ Растворы серийно разводили, используя Hamilton Microlab 1000 для получения исходных растворов, содержащих NOVODOR™ в концентрации 1000,0, Оценка активности 75555 LTU 666,7, 444,4, 285,7, 181,8, 121,2 и 80,0ш7г Два различных разведения смеси la и Ib готовили для получения 7 серийных разведении, содержащих 72,0, 48,0, 32,0, 20,6, 13,1, 8,7 и 5,8ш7г (2,5%об с 1000ш7г NOVODOR™) и 36,0, 24,0, 16,0, 10,3, 6,5, 4,4 и 2,9ш7г (1,25%об с 1000ш7г NOVODOR™) Неразбавленные образцы без соединений la и Ib и упомянутые вещества готовят таким же образом LCso пар неразбавленных образцов делят на значения LCso при усилении, что дает степень снижения LCso, связанного со смесью соединений la и Ib Результаты представлены в таблице 7 ниже, они показывают, что неочищенная смесь соединений la и Ib усиливает инсектицидную активность NOVODOR™ в отношении Leptmotarsa texana Таблица 7 Потенцирование NOVODOR™ смесью соединений la и Ib в отношении Leptmotarsa texana Образец LC50 //г/мл Коэффициент усиления NOVODOR™ 642 0 NOVODOR™ + 1 25% la/lb 250 2,6 NOVODOR™ + 2 50% la/lb 98 6,5 Пример 11 Активность смеси соединений la и Ib в отношении жуков IDS calhgraohicus и Dendroctonus frontahs Токсичность неочищенной смеси соединений la и Ib определяли в отношении жуков Ips calhgraphicus и Dendroctonus frontahs Змл неочищенного раствора соединений la и Ib (1,8мг активного ингредиента в мл) добавили к 5г лиофильно высушенной флоэмы сосны ладанной и 7мл дистиллированной воды Контрольный корм готовили с 10мл воды Корм разделили на 3 чашки Петри и 5-10 молодых жуков Ips и только что появившихся жуков Dendroctonus поместили на каждую чашку Три различных чашки обработанного корма и контрольного корма заселили 10-20 насекомыми Чашки Петри инкубировали в темноте при 25°С и подсчитывали количество мертвых насекомых на 4, 7 и 10-12 дни после заселения Представленные данные являются средними по 2 или 3 опытам для каждого вида насекомых Результаты для Ips calhgraphicus представлены в таблице 8 ниже Они указывают на то, что неочищенная смесь соединений la и Ib является инсектицидной Таблица 8 Обработка Контроль Контроль Контроль la/lb la/lb la/lb Оценка смеси соединений la и Ib в отношении Ips calhgraphicus Дней после обСреднее # мерт# насекомых работки вых 4 20 0 7 20 0 10 20 1 4 20 1 7 20 7 10 20 20 Средний % гибели 0 0 3 5 35 100 Результаты для Dendroctonus frontahs представлены в таблице 9 ниже Они показывают, что неочищенная смесь соединений 1а и Ib является инсектицидной Таблица 9 Обработка Контроль Контроль Контроль la/lb la/lb la/lb Оценка смеси соединений 1а и Ib в отношении Dendroctonus frontahs Дней после обСреднее # мертСредний % гибе# насекомых работки вых ли 4 14-20 0 0 7 14-20 1 7 10-12 14-20 3 16 4 10-20 1 51 7 10-20 1 5 10 20 14 83 Пример 12 Активность в отношении Popilha іаропіса (японского жука) Неочищенную смесь соединений la и Ib тестировали на пестицидную активность в отношении Popilha japomca третьей возрастной стадии Корни плевела (11-дневные) обмакнули в неочищенную смесь соединений la и Ib (1,8мг la и lb/мл) и подсушили Одну треть личинок третьей возрастной стадии Popilha japomca поместили в металлическую емкость с несколькими обработанными корнями Через 24 часа корни и личинки покрыли глиной Wooster Контрольные корни обмакнули в воду и необработанные контроли, содержащие личинки, поместили непосредственно в глину на день 1 Емкости инкубировали в темноте при температуре 25°С, а число мертвых личинок учитывали через 7, 10, 21, 28 и 36 дней и отмечали гибель относительно контроля {(Выживаемость в контроле выживаемость при обработке)/выживаемость в контроле) х 100%} Для каждой обработки использовали в общем 25 личинок Результаты, приведенные в таблице 10 показали, что неочищенная смесь соединений la и Ib эффективна в отношении Popilha japomca третьей возрастной стадии Таблица 10 Необработанные Водный контроль la и Ib Активность соединений la и Ib в отношении Popilha japomca 7 сут 10 сут 21 сут 28 сут # мертвых 2 2 4 5 # мертвых 2 3 8 10 %контроля 0 43 19 25 #мертвых 6 8 13 14 %контроля 174 26 1 42 9 45 Пример 13 Активность в отношении Epilachna varivesis (мексиканского Фасолевого жука) Неочищенную смесь соединений la и Ib тестировали на пестицидную активность в отношении Epilachna varivesis третьей возрастной стадии Колонию взрослых жуков Epilachna varivesis поддерживали на кустовой лимской фасоли Burpee в камерах для роста при фотопериоде 16 8 при 26,7°С и относительной влажности 50% Кладки яиц собрали и обеспечили их выведение на чашках Петри, содержащих влажные хлопковые фитили и листья лимской фасоли Через 2 дня собрали личинок второй возрастной стадии и использовали их в биотестах с обмакиванием листьев Для проведения биотеста собрали листья фасоли и пропустили черешок каждого листа через резиновую перегородку ботанической пробир 36 сут 5 11 30 15 50 ки, содержащей 4мл воды Затем листья обмакнули в серийные разведения в диапазоне 0-12% неочищенного материала, содержащего соединения la и Ib Листья высушили и на каждый лист поместили по 8-10 личинок второй возрастной стадии Насекомых, листья и ботанические пробирки поместили в 22-унциевую бумажную чашку, покрытую мелкоячеистой сеткой Чашки держали в той же камере роста, что и для колоний жуков Каждые 2 дня чашки вынимали из камеры роста, учитывали личинок, а листья заменяли свежими обработанными листьями Тестирование закончили через 8 дней Результаты, приведенные в таблице 11, показали, что неочищенная смесь соединений la и Ib активна в отношении личинок Epilachna varivesis Таблица 11 Доза, обеспечивающая гибель личинок Epilachna varivesis 95% принятых за основу сравнения пределов Дней после обработки LC50 % нижний верхний 4 5,6 2,58 10,65 6 2,12 3,03 9,37 8 1,94 0,75 2,81 49800 31 Пример 14 Полевые испытания в отношении Leptmotarsa decemlmeata (колорадского картофельного жука) Проведены испытания по защите картофеля (вариетет Katahdin) от Leptmotarsa decemlmeata с неочищенной смесью соединений la и Ib, применявшейся в концентрации 125, 250, 375 и 750г/га в сочетании с NOVODOR™ в концентрации 1,4 и 2,8л/га NOVODOR™ также применяли отдельно в концентрации 1,4, 2,8 и 5,6л/га Обработки проводили дважды через 7 дней с помощью ранцевого распылителя СОг, снабженного 3 полыми коническимаи патрубками систем разбрызгивания TXVX12/ряд и откалиброванного для разбрызгивания 32 GPA при 4,8км/час и 3,9кг/см2 Каждая обработка проводилась 4 раза на делянках по два ряда (на расстоянии 86,4см) по 7,5м, выбранных случайным образом Подсчеты взрослых особей и личинок Leptmotarsa decemlmeata проводили без повреждения листвы на свыше 15м ряда/делянку Результаты, представленные на Фиг 3 показывают, что неочищенная смесь соединений la и Ib дает значительную синергичную активность с NOVODOR™ на картофеле При 1,4л Штамм ЕМСС-0077 ЕМСС-0078 ЕМСС-0079 ЕМСС-0080 ЕМСС-0081 NOVODOR™/ra был отмечен 2 1 % от уровня контроля, тогда как 125г неочищенной смеси соединений la и Ib/ra дает 13% от уровня контроля Однако, при совместном применении NOVODOR™ и неочищенной смеси соединений la и Ib на этих уровнях процент в контроле поднимался до 8 1 % Аналогично, при использовании 250г неочищенной смеси соединений la и Ib/ra получили 28% от уровня контроля, тогда как 1,4л NOVODOR™/ra было отмечено 2 1 % от уровня контроля Но при совместном применении NOVODOR™ и неочищенной смеси соединений la и Ib, процент контроля повышался до 8 1 % Более того, когда неочищенную смесь соединений la и Ib в концентрации 125г/га и NOVODOR™ в концентрации 2,8л/га применяли вместе, процент в контроле повышался до 88% Депонирование микроорганизмов Следующие штаммы Bacillus thunngiensts были депонированы согласно Будапештскому Договору в Коллекции Культур Патентной Службы Сельскохозяйственных Исследований Северного Регионального Центра Исследований (NRRL), 1815 University street, Peona, Illinois, 61604, USA Регистрационный номер NRRLB-21090 NRRLB-21091 NRRLB-21092 NRRLB-21093 NRRLB-21094 Штаммы были депонированы на условиях, обеспечивающих доступность культуры в период рассмотрения этой патентной заявки лицам, которые определены Комиссаром по Патентам и Товарным Знакам, согласно 37 С F R параграф 114 и 35 U S С параграф 122 Депозит представляет чистые культуры каждого депонированного штамма Депозит доступен, как предписано зарубежными патентными законами в странах, где поданы копии заявки или ее продолжение Однако, следует понимать, что доступность депозита не означает права на использование изобретения в нару NHAC 0 R Производное A, R= OAc Производное В, R= H 32 Дата депонирования 10 мая 1993 10 мая 1993 10 мая 1993 10 мая 1993 10 мая 1993 шение патентных прав, предоставляемых правительственным решением Описанное и заявленное изобретение не ограничено представленными примерами применения Примеры приведены как иллюстрация различных аспектов изобретения Различные модификации изобретения в дополнение к тем, что показаны и описаны, будут для специалистов очевидны из описания Эти модификации считаются входящими в прилагаемую формулу изобретения Содержание ссылок, использованных в описании, полностью включено в описание 33 49800 34 O2 Re Фіг. 1 OAc N NA Hc NHAC і 12 II 0 9 5qt/ra Ia/Ib 250 г аи/га+ Novoaor2,5qt/ra_ Вез обрабопш о О 40 % 60 К О Н Т Р О Л Ь Фіг. З 4 SO DA2T Ю О