Зменшення супутніх інфекцій у свиней за допомогою антигену pcv2

Реферат: UA 104129 C2 (12) UA 104129 C2 У заявці описаний спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, що викликаються одним або декількома патогенами, відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості білок ORF-2 PCV2 або імуногенну композицію, яка містить білок ORF-2 PCV2. UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перелік послідовностей У дану заявку входить перелік послідовностей у паперовій і електронній версії, сутність і зміст якого включений у даний опис як посилання. Перелік послідовностей ідентичний переліку, включеному у WO 06/072065. Передумови створення винаходу Область техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до ветеринарії, зокрема до інфекційних хвороб. Крім того, даний винахід відноситься до способу зниження супутніх інфекцій у свиней, які викликаються патогенами, відмінними від PCV2. Опис відомого рівня техніки У 1996 р. було описано нове захворювання, позначене як "синдром після окремого мультисистемного виснаження" (PMWS), стосовно до випадків, які були виявлені у Канаді 5-ма роками раніше (Clark T. Pathology of the Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome of Pigs, 1996, сс. 22-25). Як основний збудник цього синдрому хвороби був ідентифікований цирковірус свиней типу 2 (PCV2). При цьому PMWS виявлений практично у всіх регіонах миру, в яких розводять свиней (Brunborg I.M., Moldal T., Jonassen C.M., J Virol Methods 15, 122(2), 20 грудня 2004 р., сс. 171-178). Найбільше часто уражаються свині віком 5-15 тижнів (Allan G, McNeilly F., PMWS/PCVD: Diagnosis, Disease and Control: What do we know?, 16 липня-19 липня 2006 р., Allan GM і ін., Vet Microbiol, 98(2), 4 лютого 2004 р., сс. 165-168; Chae C., Vet J, 168(1), липень 2004 р., сс. 41-49). Клінічні ознаки включають значне збільшення коефіцієнта смертності, виснаження, генералізоване збільшення лімфатичних вузлів, респіраторні симптоми й іноді блідість, жовтяницю й діарею (Chae C., Vet J, 169(3), травень 2005 р., сс. 326-336; Segales J. і ін., Vet Microbiol, 98(2), 4 лютого 2004 р., сс. 151-158). Ці клінічні ознаки не всі проявляються одночасно в ураженій PMWS череді свиней, але, імовірно, що прояв клінічних ознак побічно пов'язано зі специфічними для ферми копатогенами, мішенню яких є різні системи органів (Krakowka S. і ін., Vet Pathol, 38(1), січень 2001 р., сс. 31-42). Епідеміологічні дослідження продемонстрували, що найбільше часто синдром захворювання зустрічається у сполученні з присутністю збудника репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), вірусу свинячого грипу (SIV), парвовірусу свиней (PPV), Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), Streptococcus suis і Mycoplasma hyopneumoniae (Chae C., Vet J, 168(1), липень 2004 р., сс. 41-49). Було постульовано, що для прояву PMWS основне значення має активація імунної системи (Krakowka S. і ін., Vet Pathol, 38(1), січень 2001 р., сс. 31-42). У той час як експериментальна інокуляція тільки PCV2 приводила до виникнення лише асимптоматичних інфекцій і дуже незначного гістологічного прояву запалення, подвійне зараження PCV2 і PPV або PRRSV приводило до більше серйозних клінічних ознак, макроскопічним і гістологічним ушкодженням, більше широкому поширенню й більше високому рівню вірусного навантаження PCV2 в уражених тканинах. Ці результати дозволяють припустити, що основну роль грає PCV2, оскільки зараження тільки PRRSV або PPV не приводить до порівнянних клінічних ознак або ушкоджень (Allan і ін., J Comp Pathol, 121(1), липень 1999 р., сс. 1-11; Allan G.M. і ін., Arch Virol, 145(11), 2000, сс. 2421-2429; Harms P.A. і ін., Vet Pathol, 38(5), вересень 2001 р., сс. 528-539; Krakowka S. і ін., Vet Pathol, 37(3), травень 2000 р., сс. 254-263; Ostanello F. і ін., Vet Microbiol, 108(3-4), 1 липня 2005 р., сс. 179-186; Rovira A. і ін., J Virol, 76(7), квітня 2002 р., сс. 3232-3239). Крім того, аналогічного посилення серйозності захворювання можна досягати також у відсутності коінфікуючих агентів при імуностимуляції свиней гемоціаніном лімфи равлика у неповному ад'юванті Фрейнда (KLH/ICFA) (Krakowka S. і ін., Vet Pathol, 38(1), січень 2001 р., сс. 31-42). Вплив PCV2 на імунну систему свиней поки недостатньо вивчений. Відомо, що основними клітинами-мішенями, у яких відбувається реплікація PCV2, є лінія клітин моноцитів/макрофагів, а також інші антигенпрезентуючі клітини, такі як фолікулярні дендритні клітини (Darwich L. і ін., Arch Virol, 149(5), травень 2004 р., сс. 857-874). У декількох дослідженнях було висунуте припущення про те, що PCV2 заражає клітини, які діляться, макрофаги й B-лімфоцити, індукуючи апоптоз B-клітин, що приводить до ушкодження лімфоїдних тканин, яке обумовлює значне виснаження лімфоцитів (Darwich L. і ін., Arch Virol, 149(5), травень 2004 р., сс. 857-874). В уражених PMWS свиней, насамперед, проявляються інфільтрація гістіоцитів і виснаження лімфоцитів, як фолікулярних центрів, так і парафолікулярних зон, тобто симптоми, асоційовані з присутністю PCV2 (Segales J. і ін., Vet Microbiol, 98(2), 4 лютого 2004 р., сс. 151-8; Darwich L. і ін., Arch Virol, 149(5), травень 2004, сс. 857-874). Ці факти дозволяють припустити, що зараження PCV2 може приводити до імуносупресії (Darwich L. і ін., Arch Virol, 149(5), травень 2004, сс. 857874; Krakowka S. і ін., Viral Immunol 15(4), 2002, сс. 567-582). Підходи до лікування викликаних PCV2 інфекцій, засновані на застосуванні ДНК-вакцини, 1 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описані в US 6703023. У WO 03/049703 описане одержання живої химерної вакцини, що містить каркас PCV-1, у якій ген каркаса PCV-1 замінений на імуногенний ген патогенних штамів PCV2. У WO 99/18214 описано декілька штамів PCV2 і процедури одержання вбитої вакцини проти PCV2. Ефективна субодинична вакцина на основі ВРЗ-2 (відкриті рамки зчитування 2) описана у WO 06/072065. Кожна із зазначених вакцин призначена для застосування з метою вакцинації/лікування свиней від PMWS. У цей час відсутні дані про потенційну роль викликаних PCV2 інфекцій на зустрічальність супутніх інфекцій, які викликаються різними відповідними свинячими патогенами. Зокрема, відсутні дані про потенційну взаємодію PCV2 і специфічних патогенів, таких як Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella multocida, PRRSV, Salmonella spp., SIV або Strepococcus suis. Крім того, незважаючи на те, що вже протягом деякого часу відомі різні вакцини проти PCV2, їхній вплив на супутні відмінні від PCV2 інфекції свиней поки не встановлений. Короткий опис креслення На кресленні показаний профіль появи вірусу PCV2 у крові (віремія). Одержували зразки крові з попередньо відібраних оброблених плацебо тварин (фіг. 1A; n=110) і вакцинованих тварин (фіг. 1Б; n=110) у певні моменти часу. На основі результатів кількісної ПЦР тварин 4 6 групували у класи тварин із субклінічними вірусними навантаженнями (10 – 10 геномних 6 еквівалентів (гЕ)/мл) і з клінічно значимими вірусними навантаженнями (> 10 гЕ/мл). Білими стовпчиками позначена частка тварин із субклінічними вірусними навантаженнями, а чорні стовпчики ілюструють частку тварин із клінічно значимими вірусними навантаженнями у день добору зразків. Докладний опис винаходу При створенні даного винаходу зненацька було встановлено, що вакцина проти PCV2 може не тільки знижувати відсоток PCV2-інфекцій у свиней або у череді свиней, але також знижувати відсоток супутніх інфекцій, викликаних патогенами, відмінними від цирковірусу, зокрема відмінними від PCV2. Таким чином, одним з об'єктів даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, викликаних одним або декількома патогенами, що відмінні від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2. Поняття "супутні інфекції" у контексті даного опису означає (але, не обмежуючись тільки ними) будь-яку інфекцію свиней, викликану такими патогенами як віруси, бактерії, гриби або хробаки, відмінними від цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2. Поняття "супутній патоген" у контексті даного опису означає (але, не обмежуючись тільки ними) патоген свиней, відмінний від цирковірусу, зокрема, відмінний від PCV2. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, викликаних одним або декількома патогенами, такими як віруси, бактерії, гриби або хробаки, відмінними від цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, що містить антиген PCV2. Переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома бактеріальними, вірусними або грибними патогенами або їхніми комбінаціями. Більше переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома бактеріальними або вірусними патогенами або їхньою комбінацією. Відповідно до іншого об'єкта даного винаходу поняття "супутні інфекції" означає також, що свиню, яка заражена одним або декількома супутніми патогенами, відмінними від цирковірусу, зокрема відмінними PCV2, коінфікують PCV2. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, коінфікованих PCV2, у якому супутні інфекції викликаються одним або декількома патогенами, відмінними від цирковірусу, зокрема відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2. Переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома такими патогенами як віруси, бактерії, гриби або хробаки, відмінними від цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2. Поняття "коінфікований PCV2" у контексті даного винаходу означає (але, не обмежуючись тільки ними) будь-яку форму коінфекції PCV2, це означає,що зараження PCV2 має місце до, одночасно або після зараження патогенами, відмінними від цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2. Під поняття підпадають також субклінічні, що мають клінічний прояв, блискавичні й хронічні форми викликаних PCV2 інфекцій. У цьому контексті форми прояви не обмежені PMWS, а включають також інші клінічні прояви викликаних PCV2 інфекцій, такі як комплекс респіраторних хвороб свиней (PRDC), синдром свинячого дерматиту й нефропатії (PDNS), зниження репродуктивної функції, гранулематозні ентерити й, можливо, уроджений тремор (CT 2 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 AII) і перинатальний міокардит (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс. 326-336). Однак поняття "супутня інфекція" не обов'язково має на увазі, що свиня або череда свиней конінфіковані PCV2. Поняття "супутня інфекція" відноситься також (але, не обмежуючись тільки ними) до випадків, коли свині або череда свиней піддаються впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, які піддаються впливу PCV2 або піддаються ризику зараження PCV2 або є чутливими до зараження PCV2, де супутні інфекції викликаються одним або декількома патогенами, відмінними від цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2. Переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома такими патогенами як віруси, бактерії, гриби або хробаки, відмінними від цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2. Поняття "зниження відсотка супутніх інфекцій" означає, що кількість свиней, заражених патогеном, відмінним від цирковірусу, знижена більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, більш переважно більше ніж на 30 %, ще більш переважно більше ніж на 40 %, ще більш переважно більше ніж на 50 %, ще більш переважно більше ніж на 60 %, ще більш переважно більше ніж на 80 %, ще більше переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. У цьому контексті поняття "невакцинована контрольна група" означає групу свиней, яким не вводили в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, що містить антиген PCV2. Таким чином, насутпним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, викликаних патогеном, відмінним від цирковірусу, зокрема відмінним від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому кількість свиней, заражених патогеном, відмінним від цирковірусу, знижують більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, більш переважно більше ніж на 30 %, ще більш переважно більше ніж на 40 %, ще більш переважно більше ніж на 50 %, ще більш переважно більше ніж на 60 %, ще більш переважно більше ніж на 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. Переважно супутня інфекція викликається вірусним, бактеріальним або грибним патогеном, відмінним від цирковірусу, зокрема, відмінним від PCV2. Більш переважно свині або череда свиней коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2 або чутливі до зараження PCV2. Супутні інфекції, викликані вірусним, бактеріальним або грибним патогеном, відмінним від цирковірусу, зокрема, відмінним від PCV2, можуть проявлятися у заражених тварин у вигляді ентериту, симптомів, пов'язаних із впливом на респіраторну систему, репродуктивну систему, центральну нервову систему або локомоторну активність. Можна знижувати прояв кожного із зазначених клінічних симптомів, викликаних відповідними патогенами. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, які викликаються одним або декількома відмінними від PCV2 патогенами, зараження якими може проявлятися у вигляді ентериту, впливу на респіраторну систему, репродуктивну систему, центральну нервову систему або локомоторну активність, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2. Переважно свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2 або чутливі до зараження PCV2. Більш краща кількість свиней, інфікованих відмінним від цирковірусу патогеном, зараження яких проявляється у вигляді ентериту, впливу на респіраторну систему, репродуктивну систему, центральну нервову систему або локомоторну активність, знижують відносно патогена, зараження яких проявляється у вигляді ентериту, впливу на респіраторну систему, репродуктивну систему або центральну нервову систему або локомоторну активність, більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, більш переважно більше ніж на 30 %, ще більш переважно більше ніж на 40 %, ще більш переважно більше ніж на 50 %, ще більш переважно більше ніж на 60 %, ще більш переважно більше ніж на 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. Прикладами патогенів, які викликають ентерит (ентеричних патогенів), є Lawsonia intracellularis, E.coli, Streptococcus suis, Clostridium spp, Salmonella spp., Brachyspira spp., ротавіруси або коронавіруси. Прикладами патогенів, які впливають на респіраторну систему, є PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, M. hyorhinis. Прикладами патогенів, які впливають на репродуктивну систему, є Leptospira spp., PRRSV, Chlamydia spp. Прикладами патогенів, які впливають на локомоторну активність, є S. suis, M. hyorhinis, Erysipelotrix rusiopathiae. Прикладами патогенів, які впливають на центральну нервову систему, є вірус псевдосказу, S. 3 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 suis, Haemophilus sp. У цілому, поняття "патоген, відмінний від PCV2" відноситься (але, не обмежуючись тільки ними) до одного або декількох патогенів, вибраних із групи, що включає: Actinobacillus suis; Arcanobacterium pyogenes; Actinobacillus pleuropneumonia (APP); вірус африканської чуми свиней; Aspergillus spp.; Astroviruses; Ascaris suum; Blastocystis spp.; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., B. hyodysenteriae, B. pilosicoli; Brucella suis, біовари 1, 2 і 3 Brucella suis; Candida spp.; вірус класичної чуми свиней; Clostridium spp., зокрема C. difficile, C. perfringens типів A, B і C, C. novyi, C. septicum, C. difficile, C. tetani; Chlamydia spp., Cryptosporidium spp.; вірус енцефаломіокардиту; Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix ruhsiopathiae; Escherichia coli; Fusarium spp.; Haemophilus parasuis; гемагглютинуючий вірус енцефаломієліту; вірус гепатиту E; вірус японського енцефаліту; Hyostrongylus rubidus; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe, L. bratislava; Mannheimia haemolytica; вірус вірус "Менангл"; Mycobacterium spp., M. avium, M. intracellulare, M. tuberculosis; Mycoplasma spp., M. hyopneumoniae, M. hyorhinis; вірус Ніпах; Oesophagostum spp., Oesophagostum dentatum, Oesophagostum quadrospinulatum; Pasteurella spp., P. multocida; Penicillium spp.; аденовірус свиней; цитомегаловірус свиней; ентеритні каліцивіруси свиней; ентеритні пікорнавіруси свиней; парвовірус свиней; респіраторний коронавірус свиней; вірус PRRS; вірус псевдосказу; реовірус; ротавірус; рубулавірус; Salmonella spp., S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin; Sarcoptes spp.; Staphylococcus hyicus; Streptococcus spp., S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, S. dysgalactiae subsp. equisimilis; Strongyloides ransomi; вірус герпеса свиней; вірус свинячого грипу; вірус віспи свиней; вірус трансмісивного гастроентериту; Trichuris spp. Taenia spp., Trichinella spiralis; вірус везикулезного стоматиту; вірус везикулезної екзантеми свиней; вірус Західного Нілу; або Yersina spp.,Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, які викликаються одним або декількома патогенами, відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому патогени, які викликають супутні інфекції, вибирають із групи, що включає: Actinobacillus suis; Arcanobacterium pyogenes; Actinobacillus pleuropneumonia (APP); вірус африканської чуми свиней; Aspergillus spp.; Astroviruses; Ascaris suum; Blastocystis spp.; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., B. hyodysenteriae, B. pilosicoli; Brucella suis, біовари 1, 2 і 3 Brucella suis; Candida spp.; вірус класичної чуми свиней; Clostridium spp., зокрема C. difficile, C. perfringens типів A, B і C, C. novyi, C. septicum, C. difficile, C. tetani; Chlamydia spp., Cryptosporidium spp.; вірус енцефаломіокардиту; Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix ruhsiopathiae; Escherichia coli; Fusarium spp.; Haemophilus parasuis; гемагглютинуючий вірус енцефаломієліту; вірус гепатиту E; вірус японського енцефаліту; Hyostrongylus rubidus; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe, L. bratislava; Mannheimia haemolytica; вірус "Менангл"; Mycobacterium spp., M. avium, M. intracellulare, M. tuberculosis; Mycoplasma spp., M. hyopneumoniae, M. hyorhinis; вірус Ніпах; Oesophagostum spp., Oesophagostum dentatum, Oesophagostum quadrospinulatum; Pasteurella spp., P. multocida; Penicillium spp.; аденовірус свиней; цитомегаловірус свиней; ентеритні каліцивіруси свиней; ентеритні пікорнавіруси свиней; парвовірус свиней; респіраторний коронавірус свиней; вірус PRRS; вірус псевдосказу; реовірус; ротавірус; рубулавірус; Salmonella spp., S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin; Sarcoptes spp.; Staphylococcus hyicus; Streptococcus spp., S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, S. dysgalactiae subsp. equisimilis; Strongyloides ransomi; вірус герпеса свиней; вірус свинячого грипу; вірус віспи свиней; вірус трансмісивного гастроентериту; Trichuris spp. Taenia spp., Trichinella spiralis; вірус везикулезного стоматиту; вірус везикулезної екзантеми свиней; вірус Західного Нілу; або Yersina spp.,Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica. Переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома патогенами, вибраними із групи, що включає: Actinobacillus pleuropneumoniae; Haemophilus parasuis; Mycoplasma hyrhinis; Pasteurella multocida; PRRS; Salmonella spp. і Strepococcus suis. Більш переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома патогенами, вибраними із групи, що включає: Actinobacillus pleuropneumoniae; Haemophilus parasuis; Mycoplasma hyrhinis; Pasteurella multocida; PRRS; Salmonella spp. і Strepococcus suis. Найбільше переважно супутні інфекції викликаються одним або декількома патогенами, вибраними із групи, що включає Actinobacillus pleuropneumoniae; Mycoplasma hyrhinis і PRRS. Найбільше переважно супутні інфекції викликаються Mycoplasma hyrhinis і/або PRRS. Переважно свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають 4 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ризик зараження PCV2, або чутливі до зараження PCV2. Більш кращу кількість свиней, інфікованих одним або декількома зазначеними вище патогенами, відмінними від цирковірусу, знижують відносно зазначеного патогену більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, більш переважно більше ніж на 30 %, ще більш переважно більше ніж на 40 %, ще більш переважно більше ніж на 50 %, ще більш переважно більше ніж на 60 %, ще більш переважно більше ніж на 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. У випадку декількох інфекцій зазначене вище зниження рівнів відноситься до кожного конкретного патогену. Наприклад, зниження більше ніж на 10 % супутніх інфекцій у зараженої декількома патогенами свині означає, що рівень зараження відносно конкретного патогена знижується більше ніж на 10 %. Це не обов'язково означає, що рівень зараження всіма патогенами знижується більше ніж на 10 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою, або у випадку череди, що менше 10 % свиней у зазначеній череді інфіковані всіма зазначеними патогенами. Поняття "антиген PCV2" у контексті даного опису відноситься до амінокислотної послідовності, що викликає імунологічну відповідь проти PCV2 у хазяїна. Антиген у контексті даного опису включає повнорозмірну послідовність будь-яких білків PCV2, їхніх аналогів або їхніх імуногенних фрагментів. Поняття "імуногенний фрагмент" означає фрагмент білка, що містить один або декілька епітопів, і у результаті цього викликає імунну відповідь у хазяїна. Такі фрагменти можна ідентифікувати за допомогою кожного із численних методів картирування епітопів, добре відомих у даній області (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, під ред. Glenn E. Morris, изд-в Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Наприклад, лінійні епітопи можна виявляти, наприклад, здійснюючи конкурентний синтез великої кількості пептидів на твердих підкладках, де пептиди відповідають фрагментам молекули білка, і, піддаючи пептиди взаємодії з антитілами, при цьому пептиди залишаються прикріпленими до підкладок. Такі методи відомі у даній області й описані, наприклад в US 4708871; в Geysen і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 3998-4002; Geysen і ін., Molec. Immunol. 23, 1986, сс. 709-715. Аналогічно цьому, конформаційні епітопи легко можна ідентифікувати шляхом визначення просторової конформації амінокислот, наприклад, за допомогою рентгенівської кристалографії й 2-мірного ядерного магнітного резонансу (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols, вище). Зазначене поняття включає також синтетичні антигени, наприклад, поліепітопи, фланкуючі епітопи й інші отримані методами рекомбінації або синтезу антигени (див., наприклад, Bergmann і ін., Eur. J. Immunol. 23, 1993, сс. 2777-2781; Bergmann і ін., J. Immunol. 157, 1996, сс. 3242-3249; Suhrbier A., Immunol, і Cell Biol. 75, 1997, сс. 402-408; Gardner і ін., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 червня-3 липня 1998 р.). Поняття "імунна відповідь" відноситься (але, не обмежуючись тільки зазначеним) до формування у хазяїні клітинно- і/або антитіло-опосередкованої імунної відповіді на антиген, що представляє інтерес, композицію або вакцину. Як правило, "імунна відповідь" включає (але, не обмежуючись тільки ними) одну або декілька з наступних реакцій: виробництво або активацію антитіл, B-клітин, T-клітин-хелперів, T-клітин-супресорів і/або цитотоксичних T-клітин, специфічно спрямованих на антиген або антигени, включений(і) у композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Переважно організм-хазяїн повинен виробляти або терапевтичну, або захисну імунологічну (вторинну імунну) відповідь так, щоб підвищувалася стійкість до нової інфекції й/або знижувалася клінічна серйозність захворювання. Таку захисну дію можна виявляти або по зниженню рівня або серйозності симптомів, або за відсутності одного або декількох симптомів, асоційованих із зараженням хазяїна PCV2, уповільненню появи вірусу у крові (віремія), зниженню персистентності вірусу, зниженню загального вірусного навантаження й/або зниженню вірусної екскреції. Поняття "імуногенна композиція" або "вакцина" (обоє поняття є синонімами) у контексті даного опису відносяться до будь-якої фармацевтичної композиції, що містить антиген PCV2, при цьому, композицію можна застосовувати для попередження або лікування асоційованого із зараженням PCV2 захворювання або стану у тварини. Краща імуногенна композиція може індукувати, стимулювати або підвищувати імунну відповідь на PCV2. Під це поняття підпадають як субодиничні імуногенні композиції, описані нижче, так і композиції, які містять вбиті (повністю знешкоджені) або ослаблені й/або інактивовані PCV2. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, що викликаються одним або декількома відмінними від PCV2 патогенами, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому імуногенна композиція 5 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являє собою субодиничну імуногенну композицію, композицію, що містить повністю знешкоджені або ослаблені й/або інактивовані PCV2. Переважно свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2 або чутливі до зараження PCV2. Більш кращу кількість свиней, інфікованих зазначеними патогенами, відмінними від цирковірусу, знижують у відношенні одного або декількох зазначених патогенів більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, більш переважно більше ніж на 30 %, ще більш переважно більше ніж на 40 %, ще більш переважно більше ніж на 50 %, ще більш переважно більше ніж на 60 %, ще більш переважно більше ніж на 80 %, ще більше переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. У контексті даного опису поняття "субодинична імуногенна композиція" відноситься до композиції, що містить щонайменше один імуногенний поліпептид або антиген, але не всі антигени, виведені або являються гомологами антигену PCV2. Така композиція практично вільна від інтактного PCV2. Таким чином, "субодиничну імуногенну композицію" одержують щонайменше із частково очищених або фракціонованих (переважно практично очищених) імуногенних поліпептидів PCV2, або їх рекомбіантних аналогів. Субодинична імуногенна композиція може містити субодиницю антигену або антигенів, що представляють інтерес, які практично вільні від інших антигенів або поліпептидів з PCV2 або є фракціонованими. Краща імуногенна субодинична композиція містить білок ОРС-2 PCV2, описаний нижче. Найбільш кращими є імуногенні субодиничні композиції, які містять будь-який з антигенів PCV2, представлених у WO 06/072065, що повністю включена у даний опис як посилання. Таким чином, наступним об'єктом винаходу є імуногенна композиція, як вона визначена у контексті даного опису, що найбільше переважно містить поліпептид або його фрагмент, який експресується ОРС-2 PCV2. ДНК ОРС-2 PCV2 і білок, які застосовують відповідно до винаходу для готування композицій і за допомогою способів, запропонованих у винаході, являє собою висококонсервативний домен в ізолятах PCV2 і тому відповідно до винаходу будь-яка ОРС-2 PCV2 повинна бути ефективною як джерело ДНК ОРС-2 PCV і/або поліпептид. Кращим білком ОРС-2 PCV2 є білок, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 11 у WO 06/072065. Іншим кращим поліпептидом ОРС-2 PCV є поліпептид, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 5 у WO 06/072065. Однак фахівцям у даній області повинно бути очевидно, що послідовність може варіюватися у межах 6-10 % відповідно до поняття гомології послідовностей і усе ще зберігати антигенні характеристики, які роблять її прийнятною для включення в імуногенні композиції. Антигенні характеристики імунологічної композиції можна оцінювати, наприклад, шляхом експериментів по контрольному зараженню, описаних у прикладі 4 WO 06/072065. Крім того, антигенні характеристики модифікованого антигену усе ще зберігаються, коли модифікований антиген забезпечує щонайменше 70 %, переважно 80 %, більш переважно 90 % захисного імунітету у порівнянні з білком ОРС-2 PCV2, який кодується полінуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 у WO 06/072065. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, що викликаються відмінними від PCV2 патогенами, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому антиген PCV2 являє собою антигенний білок ОРС-2 PCV2, що забезпечує щонайменше 70 %, переважно 80 %, більш переважно 90 % захисного імунітету у порівнянні з білком ОРС-2 PCV2, який кодується полінуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 у WO 06/072065. Переважно білок ОРС-2 PCV2 має послідовність, представлену у SEQ ID NO: 11 або SEQ ID NO: 5 у WO 06/072065. Переважно свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2 або чутливі до зараження PCV2. Більш краща кількість свиней, інфікованих зазначеними патогенами, відмінними від цирковірусу, знижується більше ніж на 40 %, переважно більше ніж на 50 %, більш переважно більше ніж на 60 %, ще більш переважно більше ніж на 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. У деяких варіантах імуногенні ділянки білка ОРС-2 PCV2 застосовують в якості антигенного компонента в імуногенній композиції, що містить антиген PCV2. Поняття "імуногенна ділянка" у контексті даного опису відноситься до вкорочених форм й/або формам, що мають заміни, або фрагментам білка й/або полінуклеотиду ОРС-2 PCV2 відповідно. Переважно такі вкорочені форми й/або форми, що мають заміни, або фрагменти повинні містити щонайменше 6 суміжних амінокислот з повнорозмірного поліпептиду ОРС-2. Більш переважно вкорочені форми й/або форми, що мають заміни, або фрагменти повинні містити щонайменше 10, більш переважно щонайменше 15 і ще більш переважно щонайменше 19 суміжних амінокислот з повнорозмірного поліпептиду ОРС-2 PCV. Дві кращі у цьому плані послідовності представлені у вигляді SEQ ID 6 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 9 і SEQ ID NO: 10 у WO 06/072065. Варто розуміти також, що зазначені послідовності можуть являти собою частину більших фрагментів або вкорочені форми. Як зазначено вище, кращим є також будь-який поліпептид ОРС-2 PCV2, який кодується нуклеотидними послідовностями SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Крім того, як повинно бути очевидно фахівцям у даній області, ця послідовність може варіюватися у межах 6-20 % відповідно до поняття гомології послідовностей і усе ще зберігати антигенні характеристики, які роблять її прийнятною для включення в імуногенні композиції. У деяких варіантах вкорочені форми й/або форми, що мають заміни, або фрагменти поліпептиду ОРС-2 PVC2 застосовують як антигенний компонент у композиції. Переважно такі вкорочені форми й/або форми, що мають заміни, або фрагменти повинні містити щонайменше 18 суміжних нуклеотидів з повнорозмірної нуклеотидної послідовності ОРС-2 PVC2, наприклад, SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Більш переважно вкорочені форми й/або форми, що мають заміни, або фрагменти повинні містити щонайменше 30, більш переважно щонайменше 45 і ще більш переважно щонайменше 57 суміжних нуклеотидів з повнорозмірної нуклеотидної послідовності ОРС-2 PVC2, наприклад, представленої у SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4. Поняття "ідентичність послідовностей", як відомо у даній області, відноситься до споріднення між двома або більшою кількістю поліпептидних послідовностей або двома або більшою кількістю полінуклеотидних послідовностей, а саме між референс-послідовністю й розглянутою послідовністю, що підлягає порівнянню з референс- послідовністю. Ідентичність послідовностей визначають шляхом порівняння даної послідовності з референс-послідовністю після оптимального вирівнювання послідовностей для одержання найбільш високого ступеня подібності послідовностей, що визначають по сумісності відрізків зазначених послідовностей. Після вирівнювання ідентичність послідовностей оцінюють за основами, що перебувають в однакових положеннях (по типу "положення з положенням"), наприклад, послідовності є "ідентичними" у певному положенні, якщо у цьому положенні нуклеотиди або амінокислотні залишки ідентичні. Загальну кількість таких ідентичних положень потім ділять на загальну кількість нуклеотидів або залишків у референс-послідовності, одержуючи % ідентичності послідовностей. Ідентичність послідовностей легко можна розраховувати за допомогою відомих методів, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) описані в: Computational Molecular Biology, під ред. Lesk A. N., вид-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, під ред. Smith D.W., вид-во, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, частина I, під ред. Griffin A.M. і Griffin H. G., вид-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., вид-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, під ред. Gribskov M. і Devereux J., вид-во M. Stockton Press, New York, 1991; і Carillo H. і Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с. 1073, зміст яких включений у даний опис як посилання. Кращі методи визначення ідентичності послідовностей створені так, щоб одержувати найбільшу відповідність між досліджуваними послідовностями. Методи визначення ідентичності послідовностей наведені у систему в доступних громадськості комп'ютерних програмах, які дозволяють визначати ідентичність послідовностей для розглянутих послідовностей. Прикладами таких програм є (але, не обмежуючись тільки ними) пакет програм GCG (Devereux J. і ін., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с. 387), BLASTP, BLASTN і FASTA (Altschul S. F. і ін., J. Molec. Biol., 215, 1990, сс. 403-410). Програма BLASTX є доступною для наукової громадськості від фірми NCBI і інших джерел (BLAST Manual, Altschul S. і ін., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. F. і ін., J. Molec. Biol., 215, 1990, сс. 403410), зміст яких включений у даний опис як посилання). Ці програми дозволяють здійснювати оптимальне вирівнювання послідовностей за допомогою прийнятих за замовчуванням значень таких, як вага пролому, для того, щоб одержувати найбільш високий рівень ідентичності послідовностей для розглянутої послідовності й референс-послідовності. Як ілюстрація: коли згадується полінуклеотид, нуклеотидна послідовність якого щонайменше на 85 %, переважно на 90 %, ще більш переважно на 95 % "ідентична послідовності" нуклеотидної референспослідовності, то мається на увазі, що нуклеотидна послідовність даного полінуклеотиду ідентична референс-послідовності за винятком того, що дана полінуклеотидна послідовність може включати аж до 15, переважно аж до 10, ще більш переважно аж до 5 точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів нуклеотидної референс-послідовності. Інакше кажучи, для того, щоб полінуклеотид мав нуклеотидну послідовність, ідентичну щонайменше на 85 %, переважно на 90 %, ще більш переважно на 95 % нуклеотидної референс-послідовності, аж до 15 %, переважно 10 %, ще більш переважно 5 % нуклеотидів у референс-послідовності можна вилучати шляхом делеції або заміняти на інший нуклеотид, або аж до 15 % нуклеотидів, переважно 10 %, ще більш переважно 5 % від загальної кількості нуклеотидів у референспослідовності можна вбудовувати у референс-послідовність. Ці мутації референс-послідовності 7 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть мати місце на 5'- або 3'-кінці нуклеотидної референс-послідовності або у будь-якому положенні між цими кінцями, або перебуваючи індивідуально серед нуклеотидів у референспослідовності, або у вигляді однієї або декількох суміжних груп у референс-послідовності. Аналогічно цьому, коли згадують поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична щонайменше, наприклад на 85 %, переважно на 90 %, ще більш переважно на 95 % амінокислотної референс-послідовності, то мають на увазі, що розглянута амінокислотна послідовність поліпептиду ідентична референс-послідовності за винятком того, що розглянута поліпептидна послідовність може включати аж до 15, переважно аж до 10, ще більш переважно аж до 5 амінокислотних замін на кожні 100 амінокислот амінокислотної референс-послідовності. Інакше кажучи, для одержання даної поліпептидної послідовності, що щонайменше на 85 %, переважно на 90 %, ще більш переважно на 95 % ідентична послідовності амінокислотної референс-послідовності, аж до 15 %, переважно аж до 10 %, ще більш переважно аж до 5 % амінокислотних залишків у референс-послідовності можна вилучати шляхом делеції або заміняти на іншу амінокислоту, або аж до 15 % амінокислот, переважно аж до 10 %, ще більше переважно аж до 5 % від загальної кількості амінокислотних залишків у референс-послідовності можна вбудовувати у референс-послідовність. Ці зміни референс-послідовності можуть мати місце на аміно- або карбоксикінці амінокислотної референс-послідовності або у будь-якому положенні між цими кінцевими положеннями, або перебуваючи індивідуально серед залишків у референс-послідовності, або у вигляді однієї або декількох суміжних груп у референспослідовності. Переважно положення залишків, які є неідентичними, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. Однак консервативні заміни не відносять до сумісних при визначенні ідентичності послідовностей. Визначення "гомології послідовностей" у контексті даного опису відноситься до методу визначення подібності двох послідовностей. Для визначення гомології послідовностей дві або більшу кількість послідовностей піддають оптимальному вирівнюванню й при необхідності інтродукують пролому. На відміну від оцінки ідентичності послідовностей при визначенні гомології послідовностей консервативні амінокислотні заміни вважають задовольняючими умовам гомології. Інакше кажучи, для того, щоб поліпептид або полінуклеотид мав 95 % гомологію послідовності з референс-послідовністю, 85 %, переважно 90 %, ще більш переважно 95 % амінокислотних залишків або нуклеотидів у референс-послідовності повинні відповідати або містити консервативну заміну на іншу амінокислоту або нуклеотид, або кількість амінокислот або нуклеотидів, що становить аж до 15 %, переважно аж до 10 %, ще більш переважно аж до 5 % від загальної кількості амінокислотних залишків або нуклеотидів, не включаючи консервативні заміни, у референс-послідовності можна вбудовувати у референспослідовність. Переважно гомологічна послідовність містить щонайменше ділянку, яка складається з 50, ще більш переважно з 100, ще більш переважно з 250, ще більш переважно з 500 нуклеотидів. Поняття "консервативна заміна" відноситься до заміни амінокислотного залишку або нуклеотиду на інший амінокислотний залишок або нуклеотид, що має подібні характеристики або властивості, включаючи розмір, гідрофобність тощо, у результаті чого загальна функціональність не змінюється істотно. Поняття "виділений" означає "змінений людиною" щодо його стану, який зустрічається у природних умовах, тобто, якщо він зустрічається у природі, то його змінюють або видаляють із природного оточення, або здійснюють і те, і інше. Наприклад, полінуклеотид або поліпептид, який зустрічається у природних умовах у живому організмі, не є "виділеним", але цей же полінуклеотид або поліпептид, відділений від матеріалу, разом з яким він присутній у своєму природному стані, є "виділеним" відповідно до застосовуваного в описі поняття. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, що викликаються одним або декількома відмінними від PCV2 патогенами, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому білок ОРС-2 PCV2 являє собою кожний із зазначених вище білків. Переважно білок ОРС-2 PCV2 являє собою: I) поліпептид, що містить послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 або SEQ ID NO: 11 у WO 06/07065; II) будь-який поліпептид, що щонайменше на 80 % гомологічний поліпептиду, зазначеному в I); III) будь-який імуногенний фрагмент поліпептидів, зазначених в I) і/або II); IV) імуногенний фрагмент, зазначений в III), який містить щонайменше 10 суміжних амінокислот, що входять у послідовності, представлені у SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 або SEQ ID NO: 11 у WO 06/072065; 8 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 V) поліпептид, який кодується ДНК, що містить послідовність, представлену у SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 у WO 06/072065; VI) будь-який поліпептид, який кодується полінуклеотидом, що щонайменше на 80 % гомологічний полінуклеотиду, зазначеному в V); VII) будь-який імуногенний фрагмент поліпептидів, які кодуються полінуклеотидом, зазначеним в V) і/або VI); VIII) імуногенний фрагмент, зазначений в VII), де полінуклеотид, який кодує імуногенний фрагмент, містить щонайменше 30 суміжних нуклеотидів, що входять у послідовності, які представлені у SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 у WO 06/072065. Переважно будь-який із зазначених імуногенних фрагментів має імуногенні характеристики білка ОРС-2 PCV2, який кодується послідовностями, що представлені у SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 4 у WO 06/07065. Переважно інфіковані свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2, або чутливі до зараження PCV2. Більш кращу кількість свиней, інфікованих зазначеними патогенами, відмінними від цирковірусу, знижують у відношенні одного або декількох зазначених патогенів більше ніж на 10 %, більш переважно більше ніж на 20 %, ще більш переважно більше ніж 30 %, ще більш переважно більше ніж 40 %, ще більш переважно більше ніж 50 %, ще більш переважно більше ніж 60 %, ще більш переважно більше ніж 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. Таким чином, відповідно до наступного об'єкта винаходу білок ОРС-2 PCV2 утримується в імуногенній композиції з таким рівнем включення антигену, що є ефективним для лікування тварин, заражених PCV2 на субклінічному рівні. Переважно рівень включення білка ОРС-2 PCV2 становить щонайменше 0,2 мкг антигена/мл кінцевої імуногенної композиції (мкг/мл), більш переважно від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 0,6 до приблизно 15 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 1,4 до приблизно 2,5 мкг/мл, ще більш переважно від приблизно 1,5 до приблизно 2,0 мкг/мл і найбільше переважно приблизно 1,6 мкг/мл. Згідно ще одному об'єкту винаходу рівень включення антигену ОРС-2 PCV становить щонайменше 0,2 мкг білка ОРС-2 PCV2, описаного вище, на дозу кінцевої антигенної композиції (мкг/дозу), більш переважно від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,6 до приблизно 15 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,4 до приблизно 2,5 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,5 до приблизно 2,0 мкг/дозу й найбільше переважно приблизно 1,6 мкг/дозу. Поліпептид ОРС-2 PCV2, що застосовується в імуногенній композиції, запропонованій у даному винаході, можна одержувати будь-яким методом, включаючи виділення й очищення ОРС-2 PCV2, стандартний метод синтезу білків і метод рекомбінантної ДНК. Кращі методи одержання поліпептиду ОРС-2 PCV2 представлені у WO 06/072065, сутність і зміст якої повністю включений у даний опис як посилання. У цілому, метод полягає в наступному: заражають чутливі клітини рекомбінантним вірусним вектором, який містить послідовності ДНК ОРС-2 PCV2, що кодують, експресують поліпептид ОРС-2 PCV2 за допомогою рекомбінантного вірусу й виділяють експресований поліпептид ОРС-2 PCV2 із супернатанта шляхом фільтрації, і інактивують загальноприйнятим методом, переважно використовуючи бінарний етиленімін (БЕІ), який потім нейтралізують для припинення процесу інактивації. Поняття "імуногенна композиція" у контексті даного опису відноситься також до композиції, що містить I) будь-який білок ОРС-2 PCV2, описаний вище, переважно у зазначених вище концентраціях, і II) щонайменше частину вірусного вектора, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, переважно рекомбінантного бакуловірусу. Крім того, імуногенна композиція може містити I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у зазначених вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, який експресує білок ОРС-2 PCV2, 9 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно рекомбінантного бакуловірусу, і III) частину супернатанта клітинної культури. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, що викликаються одним або декількома відмінними від PCV2 патогенами, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому антиген PCV2 являє собою рекомбінантний ОРС-2 PCV2, що переважно експресується у бакуловірусі ОРС-2 PCV2. Переважно рекомбінантні або експресовані у бакуловірусі ОРС-2 PCV2 мають зазначену вище послідовність. Поняття "імуногенна композиція" у контексті даного опису відноситься також до композиції, що містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у зазначених вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, переважно рекомбінантного бакуловірусу, і III) частину клітинної культури; де приблизно 90 % компонентів мають розмір менше 1 мкм. Поняття "імуногенна композиція" у контексті даного опису відноситься також до композиції, що містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у зазначених вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Переважно БЕІ є присутнім у концентраціях, ефективних для інактивації бакуловірусу, переважно від 2 до приблизно 8мМ БЕІ, переважно приблизно 5мМ БЕІ. Поняття "імуногенна композиція" у контексті даного опису відноситься також до композиції, що містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у зазначених вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, і V) нейтралізуючий агент, призначений для припинення інактивації, опосередкованої інактивуючим агентом, де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Переважно, якщо інактивуючий агент являє собою БЕІ, то зазначена композиція містить тіосульфат натрію у кількостях, еквівалентних кількості БЕІ. Поліпептид включають у композицію, яку можна вводити тварині, чутливій до зараження PCV2. У кращих варіантах у композицію можна включати додаткові компоненти, відомі фахівцям у даній області (див. також Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е вид., вид-во Mack Publ., Easton, 1990). Крім того, до складу композиції можуть входити один або декілька прийнятних для застосування у ветеринарії носіїв. У контексті даного опису поняття "прийнятний для застосування у ветеринарії носій" включає (але, не обмежуючись тільки ними) будь-які з перерахованих або всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, ад'юванти, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні й протигрибкові агенти, агенти для надання ізотонічності, агенти, що сповільнюють адсорбцію тощо. У кращому варіанті здійснення винаходу імуногенна композиція містить білок ОРС-2 PCV2, описаний вище, переважно у зазначених вище концентраціях, який змішують із ад'ювантом, переважно карбополом, і фізіологічним розчином. Фахівцям у даній області повинно бути очевидно, що композиція, яку застосовують відповідно до винаходу, може включати відомі придатні для ін'єкції фізіологічно прийнятні стерильні розчини. Для готування готового до застосування розчину для парентеральної ін'єкції або інфузії широко використовують водні ізотонічні розчини, такі, наприклад, як фізіологічний розчин або відповідні розчини білків плазми. Крім того, імуногенні композиції й вакцини, запропоновані у даному винаході, можуть включати розріджувачі, агенти для надання ізотонічності, стабілізатори або ад'юванти. Розріджувачі можуть являти собою воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин тощо. Агенти для надання ізотонічності можуть являти собою серед іншого хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу. Стабілізатори являють собою серед іншого альбумін і солі лужних металів і етилендіамінтетраоцтової кислоти. Поняття "ад'юванти" у контексті даного опису може відноситися до гідроксиду алюмінію й фосфату алюмінію, сапонінам, таким, наприклад, як Quil A, QS-21 (фірма Cambridge Biotech Inc., Кембрідж, шт. Массачусетс), GPI-0100 (фірма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бірмінгем, шт. Алабама), емульсії вода-в-маслі, емульсії масло-в-воді, емульсії вода-в-маслі-в-воді. Основою емульсії може бути, зокрема, легке рідке парафінове масло (відповідне Європейської фармакопеї); ізопреноїдне масло, таке як сквалан або сквален; масло, що утворилося у результаті олігомеризації алкенів, насамперед ізобутена або децена; ефіри кислот або спиртів, 10 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що містять лінійну алкільну групу, більш конкретно рослинні масла, етилолеат, ди(каприлат/капрат) пропіленгліколя, три(каприлат/капрат) гліцерини або діолеат пропіленгліколя; ефіри розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, ефіри ізостеаринової кислоти. Масла застосовують у сполученні з емульгаторами для одержання емульсії. Емульгатори переважно являють собою неіоногенні поверхнево-активні речовини, насамперед складні ефіри сорбітану, маніду (наприклад, безводний манітолеат), гліколя, полігліцерину, пропіленгліколя й олеїнової, ізостеаринової, рицинолеїнової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксилованими, і блок-співполімери поліоксипропілена-поліоксіетилена, зокрема продукти типу Pluronic, насамперед L121 (див. Hunter і ін., The Theory and Practical Application of Adjuvants, під ред. Stewart-Tull D. E. S., вид-во John Wiley and Sons, NY, сс. 51-94, 1995 і Todd і ін., Vaccine 15, 1997, сс. 564-570). Наприклад, можна застосовувати SPT-Емульсію, описану на с. 147 в: "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", під ред. M. Powell і M. Newman, вид-во Plenum Press, 1995, і емульсію MF59, описану на с. 183 у цій же публікації. Іншим прикладом ад'юванта є сполука, вибрана з полімерів акрилової або метакрилової кислоти й співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільного похідного. Кращими ад'ювантами є полімери акрилової або метакрилової кислоти, насамперед, зшиті з простими поліалкеніловими ефірами цукрів або багатоатомних спиртів. Ці сполуки відомі за назвою карбомери (Phameuropa, т. 8, № 2, червень 1996 р.). Фахівцям у даній області як посилання можна запропонувати US 2909462, у якому описані зазначені акрилові полімери, зшиті з полігідроксилованою сполукою, що має щонайменше 3 гідроксильні групи, переважно не більше 8, при цьому атоми водню щонайменше трьох гідроксильних груп заміщені ненасиченими аліфатичними радикалами, які мають щонайменше 2 атоми вуглецю. Кращими є радикали, які містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вінільні, алільні й інші ненасичені групи ряду етилена. Ненасичені радикали можуть самі містити інші замісники, такі як метил. Найбільш кращими є продукти, що надходять у продаж за назвою карбопол (фірма BF Goodrich, шт. Огайо). Вони зшиті з алілсахарозою або алілпентаеритритолом. Серед них насамперед варто згадати карбопол 974P, 934P і 971P. Найбільш кращим для застосування є карбопол 971P. Найбільше переважно застосовують карбопол, зокрема можна застосовувати карбопол 971P, переважно у кількостях від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу, ще більш переважно у кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу й найбільше переважно у кількості приблизно 1 мг на дозу. Іншими придатними ад'ювантами є (але, не обмежуючись тільки ними) система RIBIад'ювантів (фірма Ribi Inc.), блок-співполімери (фірма CytRx, Атланта, шт. Джорджія), SAF-M (фірма Chiron, Емеривілл, шт. Каліфорнія), монофосфорил-ліпід A, ад'ювант на основі аміну ліпіду акридина, термолабільний ентеротоксин E. coli (рекомбінантний або нерекомбінантний), токсин холери, IMS 1314 або мураміл-дипептид. Переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу. Найбільше переважно ад'ювант додають у кількості приблизно 1 мг на дозу. Крім того, композиція може включати один або декілька фармацевтично прийнятних носіїв. У контексті даного опису поняття "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-який з перерахованих або всі розчинники, дисперсійні середовища, матеріали для нанесення покриття, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні й протигрибкові агенти, агенти для надання ізотонічності, агенти, що сповільнюють адсорбцію тощо. Найбільше переважно композиція, запропонована у винаході, містить білок ОРС-2 PCV2, виділений із супернатанта культивуємих in vitro клітин, де зазначені клітини інфікують рекомбінантним вірусним вектором, що містить ДНК ОРС-2 PCV2 і експресує білок ОРС-2 PCV2, і де зазначену клітинну культуру обробляють від приблизно 2 до приблизно 8мМ БЕІ, переважно приблизно 5мМ БЕІ, для інактивації вірусного вектора й нейтралізуючим агентом, узятим в еквівалентній концентрації, переважно розчином тіосульфату натрію у кінцевій концентрації від приблизно 2 до приблизно 8мМ, переважно приблизно 5мМ. Згідно ще одному варіанту здійснення даний винахід відноситься також до застосування антигену PCV2 для готування імуногенної композиції, призначеної для зниження супутніх інфекцій, які викликаються одним або декількома патогенами, відмінними від PCV-2, у свиней або у череді свиней, де імуногенна композиція містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у зазначених вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного 11 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вектора, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, і V) нейтралізуючий агент, призначений для припинення інактивації, опосередкованої інактивуючим агентом, переважно тіосульфат натрію у кількостях, еквівалентних кількості БЕІ; і VI) прийнятний ад'ювант, переважно карбопол 971 у зазначених вище кількостях; де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Переважно зазначені свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або піддані небезпеці або чутливі до зараження PCV2. Більш краща кількість свиней, інфікованих зазначеними патогенами, відмінними від цирковірусу, знижується у відношенні одного або декількох зазначених патогенів більше ніж на 10 %, більш переважно більше ніж на 20 %, ще більш переважно більше ніж 30 %, ще більш переважно більше ніж 40 %, ще більш переважно більше ніж 50 %, ще більш переважно більше ніж 60 %, ще більш переважно більше ніж 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. Згідно ще одному об'єкту винаходу зазначена імуногенна композиція містить також фармацевтично прийнятну сіль, переважно фосфат, у фізіологічно прийнятних концентраціях. Краще значення pH зазначеної імуногенної композиції доводять до фізіологічного значення pH, тобто приблизно 6,5-7,5. У контексті даного опису поняття "імуногенна композиція" відноситься також до композиції, що містить в одному мл: I) щонайменше 1,6 мкг білка ОРС-2 PCV2, описаного вище, II) щонайменше частину бакуловірусу, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) приблизно від 2 до 8мМ БЕІ, V) тіосульфат натрію у кількостях, еквівалентних кількості БЕІ, і VI) приблизно 1 мг карбопола 971, і VII) фосфат у фізіологічно прийнятній концентрації; де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм, і значення pH зазначеної імуногенної композиції доведено приблизно до 6,5-7,5. Імуногенні композиції можуть містити також один або декілька інших імуномодулюючих агентів, таких, наприклад, як інтерлейкіни, інтерферони або інші цитокіни. Імуногенні композиції можуть містити також гентаміцин і мертіолат. Хоча фахівець у даній області легко може визначити кількості й концентрації ад'ювантів і добавок, які можна застосовувати у контексті даного винаходу, у даному винаході запропоновані композиції, що містять від приблизно 50 до приблизно 2000 мкг ад'юванта й переважно приблизно 250 мкг/мл дози композиції вакцини. Так, імуногенна композиція, запропонована у винаході, являє собою також композицію, що містить від приблизно 1 до приблизно 60 мкг/мл антибіотиків і більш переважно менше приблизно 30 мкг/мл антибіотиків. У контексті даного опису поняття "імуногенна композиція" відноситься також до композиції, що містить I) будь-який з білків ОРС-2 PCV2, описаних вище, переважно у зазначених вище концентраціях, II) щонайменше частину вірусного вектора, який експресує зазначений білок ОРС-2 PCV2, III) частину клітинної культури, IV) інактивуючий агент, призначений для інактивації рекомбінантного вірусного вектора, переважно БЕІ, і V) нейтралізуючий агент, призначений для припинення інактивації, опосередкованої інактивуючим агентом, переважно тіосульфат натрію у кількостях, еквівалентних кількості БЕІ; VI) прийнятний ад'ювант, переважно карбопол 971 у зазначених вище кількостях; VII) соляний буфер у фармацевтично прийнятній концентрації, переважно фосфтат, і VIII) протимікробна діюча речовина; де приблизно 90 % компонентів I)-III) мають розмір менше 1 мкм. Поняття "імуногенна композиція, яку можна застосовувати відповідно до винаходу", TM відноситься також до Ingelvac® CircoFLEX (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, СентДжозеф, шт. Міссурі, США), CircoVac® (фірма Merial SAS, Ліон, Франція), CircoVent (фірма Intervet Inc., Міллсборо, шт. Делавер, США) або Suvaxyn PCV-2 One Dose® (фірма Fort Dodge Animal Health, Канзас-Сіті, шт. Канзас, США). Таким чином ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб зниження відсотка супутніх інфекцій у свиней або у череді свиней, що викликаються одним або декількома відмінними від PCV2 патогенами, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому імуногенна композиція, що містить антиген PCV2, являє собою Ingelvac® TM CircoFLEX , CircoVac®, CircoVent і/або Suvaxyn PCV-2 One Dose®, переважно Ingelvac® TM CircoFLEX . Переважно інфіковані свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2, або чутливі до зараження PCV2. Більш краща кількість свиней, інфікованих зазначеними патогенами, відмінними від цирковірусу, знижується у відношенні одного або декількох зазначених патогенів більше ніж на 10 %, більш переважно більше ніж на 20 %, ще більш переважно більше ніж 30 %, ще більш переважно більше ніж 40 %, ще більш переважно більше ніж 50 %, ще більш переважно більше ніж 60 %, ще більш переважно більше ніж 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з 12 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 невакцинованою контрольною групою. Поняття "ефективна кількість антигену PCV2" у контексті даного опису означає (але, не обмежуючись тільки зазначеним) кількість антигену PCV2, що викликає або може викликати імунну відповідь у тварини, якій вводять антиген PCV2 в ефективній дозі. Ефективна кількість залежить від інгредієнтів вакцини й схеми введення. Як правило, коли у комбінованій вакцині застосовують препарат інактивованого вірусу або модифікованого живого 2,0 9,0 вірусу, то вакцину застосовують у кількості, що становить від приблизно 10 до приблизно 10 3,0 8,0 TCID50 на дозу, переважно від приблизно 10 до приблизно 10 TCID50 на дозу, більш 4,0 8,0 переважно від приблизно 10 до приблизно 10 TCID50 на дозу. Зокрема, коли у вакцинах застосовують модифікований живий PCV2, то рекомендована доза, призначена для введення 3,0 чутливій тварині, становить переважно від приблизно 10 TCID50 (середня цитопатогена доза, 6,0 що інфікує 50 % клітин) /дозу до приблизно 10 TCID50/дозу й більш переважно від приблизно 4,0 5,0 10 TCID50/дозу до приблизно 10 TCID50/дозу. У цілому, кількість антигену повинна становити 2,0 9,0 3,0 6,0 від приблизно 0,2 до 5000 мкг і від 10 до 10 TCID50, переважно від 10 до 10 TCID50, більш 4,0 5,0 переважно від 10 до 10 TCID50, при застосуванні очищеного антигену. Субодиничні вакцини, як правило, вводять із рівнем включення антигену, що становить щонайменше 0,2 мкг антигена на дозу, переважно від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,6 до приблизно 16 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/дозу. Введення антигену PCV2 свиням не тільки приводить до зниження відсотка супутніх інфекцій, які викликаються патогенами, відмінними цирковірусу, зокрема, відмінними від PCV2, але також приводить до загального поліпшення стану здоров'я, насамперед до стійкості до зазначених супутніх інфекцій. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є також спосіб підвищення стійкості свиней до однієї або декількох супутніх інфекцій, що викликаються патогенами, відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2. Переважно свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2, або чутливі до зараження PCV2. Поняття "підвищення стійкості свиней до супутніх інфекцій" у контексті даного опису відноситься (але, не обмежуючись тільки їм) до процесу, при якому кількість свиней, заражених патогеном, відмінним від цирковірусу, знижується у відношенні зазначеного патогену більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, ще більш переважно більше ніж 30 %, ще більш переважно більше ніж 40 %, ще більш переважно більше ніж 50 %, ще більш переважно більше ніж 60 %, ще більш переважно більше ніж 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є спосіб підвищення стійкості свиней до супутніх інфекцій, що викликаються одним або декількома патогенами, відмінними від PCV2, який полягає в тому, що вводять свині(ям) в ефективній кількості антиген PCV2 або імуногенну композицію, яка містить антиген PCV2, у якому кількість свиней, заражених одним або декількома патогенами, відмінними від цирковірусу, знижується відносно одного або декількох зазначених патогенів більше ніж на 10 %, переважно більше ніж на 20 %, ще більш переважно більше ніж 30 %, ще більш переважно більше ніж 40 %, ще більш переважно більше ніж 50 %, ще більш переважно більше ніж 60 %, ще більш переважно більше ніж 80 %, ще більш переважно більше ніж на 100 % у порівнянні з невакцинованою контрольною групою. Переважно свині коінфіковані PCV2, як зазначено вище, піддані впливу PCV2 або мають ризик зараження PCV2, або чутливі до зараження PCV2. Докладний опис кращих варіантів здійснення винаходу Нижче у прикладах представлені кращі матеріали й процедури, що застосовуються у даному винаході. Хоча при втіленні на практиці й перевірці даного винаходу можна застосовувати будьякі методи й матеріали, аналогічні або еквівалентні представленим у даному описі, нижче описані кращі методи, пристрої й матеріали. Однак варто розуміти, що ці приклади дані тільки з метою ілюстрації й не спрямовані на обмеження загального обсягу винаходу. Приклад 1 Виявлення супутніх інфекцій у заражених PCV-2 тварин Досліджувана популяція Дослід проводили у південній частині Німеччини. Гібридних свиней товарних кроссбредів 13 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (порода Ландрас (Landrace) або Едельшвайн (Edelschwein) (f) × Піетрейн (Pietrain) (m)) одержували з 15 різних племінних ферм, що входять у "співтовариство виробників свиней". Племінні ферми різнилися за розміром (від 50 до 300 свиноматок), вмісту й стану здоров'я тварин. Загальноприйняті профілактичні міри, що застосовуються відносно поросят на всіх племінних фермах, включали ін'єкцію заліза, видалення зубів (іклів і окрайків), обрізання хвоста й кастрацію. Після відібрання у віці приблизно 4 тижнів поросят з різних племінних ферм перевозили у розплідник для поросят із системою виробництва типу "all-in-all-out" (повне заповнення/звільнення). Їх довільно розміщали у трьох свинарниках із загонами, кожний з яких був розрахований на вміст 60-120 свиней. Загальноприйняті профілактичні міри, прийняті у розплідниках для поросят, включали профілактичну обробку тетрацикліну гідрохлоридом у перші десять днів після прибуття тварин. У процесі вирощування здійснювали чотири заміни складу корму. Корм для тварин готували безпосередньо у розпліднику на основі ячменя й мінералів. У віці приблизно 12 тижня свиней перевозили у відгодівельну ферму із системою виробництва типу "all-in-all-out". Їх знову перегруповували й розміщали у двох стійлах, кожне з яких було розраховано на вміст 10-130 свиней. У період відгодівлі здійснювали три заміни складу корму. Корм для тварин готували безпосередньо на фермі на основі ячменя, пшениці, кукурудзи й концентрату сироватки. Свиней витримували на відгодівельній фермі протягом 1318 тижнів. Історія хвороби Схема захворювання, що відповідає PMWS, стала проявлятися клінічно за 3 роки до початку досліду у листопаді 2002 р. і була підтверджена серологічно у грудні 2002 р. Наприкінці стадії вмісту у розпліднику/початку стадії відгодівлі у тварин почали проявлятися ознаки PMWS, такі як виснаження, респіраторні симптоми й помітне підвищення коефіцієнта смертності. Хвороба супроводжувалася коінфекціями PRRSV. Коефіцієнт смертності у процесі знаходження у розпліднику (вік 4-12 тижнів), як правило, становив від 3,5 до 4,8 %, однак у деяких випадках одержували також дані про сягаючий пік значеннях смертності аж до 10 %. Протягом середньоїпізньої фази відгодівлі основними ознаками у заражених PCV2 тварин були респіраторні симптоми й затримка росту. Коефіцієнт смертності протягом фази відгодівлі (свині віком 12-26 тижнів) становив приблизно 1,7-2,4 % і кількість відбракованих тварин становила 1 %. Середній добовий приріст маси тіла перебував лише на середньому рівні (719-731 г/день). За три місяці до початку досліду діагноз PMWS був підтверджений на основі клінічних симптомів і наявності віремії PCV2, обидві ознаки виявлені у тварин віком приблизно 9-13 тижнів. PRRSV і Mycoplasma hyorhinis ідентифіковані у зразках промивної рідини легенів у заражених PCV2 тварин в якості коінфікуючих патогенів. Досліджувані продукти Для активної вакцинації проти PCV2 вводили інактивовану субодиничну вакцину (Ingelvac® TM CircoFLEX , фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH). Вакцина включала капсидний білок ОРС-2 PCV2 як діючу речовину й карбомер як ад'ювант. Послідовність ОРС-2 одержували з Північноамериканського ізоляту PCV2, що був виділений зі зразків мигдалин і печінки двох свиней, що мають симптоми PMWS. Потім послідовність ОРС-2 вбудовували у бакуловірусну систему експресії за допомогою лінії клітин комах, виведеної з яєчників совки Spodoptera frugiperda (клітини SF+), як хазяїн. Як контрольний продукт застосовували плацебо, до складу якого входив супернатант клітинної культури, який не містить капсидний білок PCV2, і карбомер як ад'ювант. План експерименту Польовий дослід здійснювали відповідно до принципів належної клінічної практики ("Good Clinical Practice" (GCP)), використовуючи план рандомізованого, що включає застосування негативного контролю, подвійного сліпого, паралельного експерименту. Усього 1519 здорових поросят розділяли нарівно на дві оброблювані групи з урахуванням початкової ваги тіла й приналежності до певного калу. За один тиждень до відібрання одну групу поросят (n=754) TM вакцинували за допомогою Ingelvac® CircoFLEX , а іншу групу (n=765) обробляли плацебо. Досліджувані продукти вводили у вигляді однократної дози об'ємом 1 мл внутрішньом'язово у правий шийний відділ, коли поросятам було 25,4+3,18 дні (середнє значення + С.К. О). Після відібрання свиней з обох оброблюваних груп утримували у вигляді змішаних груп до кінця завершального періоду відгодівлі з метою максимальної однорідності впливу патогенів. Полімеразні ланцюгові реакції Застосовували описані вище аналізи за допомогою полімеразної ланцюгової реакції для виявлення специфічних для PRRSV нуклеїнових кислот (Mardassi H. і ін., J Clin Microbiol, 32(9), 1994, сс. 2197-2203), Mycoplasma hyorhinis (Caron J. і ін., J Clin Microbiol, 38(4), 2000, сс. 13901396), Mycoplasma hyopneumoniae (Calsamiglia M. і ін., J Vet Diagn Invest, 11(3), травень 1999 р., 14 UA 104129 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сс. 246-251), Streptococcus suis (Wisselink H.J. і ін., J Clin Microbiol, 40(8), серпень 2002 р., сс. 2922-2929), Pasteurella multocida (Townsend K.M. і ін., J Clin Microbiol, 36(4), квітня 1998 р., сс. 1096-1100), Actinobacillus pleuropneumoniae (Schaller A. і ін., Apx toxins in Pasteurellaceae species from animals. Vet Microbiol, 74(4), 12 червня 2000 р., сс. 365-376), Bordetella bronchispectica (Hozbor D. і ін., Res Microbiol, 150(5), червень 1999 р., сс. 333-341) і Haemophilus parasuis (Calsamiglia M. і ін., J Vet Diagn Invest, 11(2), березень 1999 р., сс. 140-145) у зразках тканини легені. Для кількісної оцінки вірусного навантаження PCV2 у сироватці кількісно оцінювали геномні еквіваленти PCV2 відповідно до методу, описаному у Brunborg і ін., J. Virol Methods 122, 2004, сс. 171-178.Для ампліфікації PCV2 застосовували праймери PCV2-84-1265U21 і PCV2-841319L21. Як відсічний рівень для позитивного зразка за допомогою експериментів за валідацією 4 було прийняте значення, рівне 10 копій матриці на 1 мл сироватки. Всі кількісні аналізи ДНК PCV2 здійснювали на фірмі bioScreen GmbH, Мюнстер, Німеччина. Результати PCV2-віремія Проводили вивчення того, чи зв'язаний початок і серйозність виявлених характерних для PMWS клінічних ознак і ушкоджень із початком PCV2-віремії у крові попередньо відібраних "модельних тварин". Як проілюстровано на кресленні, початок PCV2-віремії у тварин в обробленої плацебо групи виявлено, коли тварини досягали віку приблизно 9-10 тижнів. Максимальні рівні, що відповідають наявності аж до 85 % PCV2-позитивних тварин, були досягнуті, коли вік тварин становив приблизно 11-14 тижнів. З 14 тижня й до кінця періоду відгодівлі частка тварин, у яких виявлена PCV2-віремія, знижувалася, однак вона не досягала знову основного (вихідного) рівня. Середня індивідуальна тривалість віремії становила 56 днів (дані не представлені). У порівнянні з обробленою плацебо групою тварин частка PCV2-позитивних тварин у вакцинованій групі вірогідно знижувалася (p