Спосіб оцінки впливу різних доз біомаси гриба ganoderma lucidum на гуморальну імунну відповідь

Реферат: Спосіб оцінки впливу різних доз біомаси гриба Ganoderma Lucidum на гуморальну імунну відповідь включає дослідження крові. В якому додатково визначають титр гемолізинів та гемаглютинінів в сироватці крові, кількість антитілоутворюючих клітин в селезінці до і після лікування, розраховують співвідношення їх по відношенню до контролю і при зміні показників оцінюють гуморальну імунну відповідь до біомаси гриба Ganoderma Lucidum. UA 101556 U (12) UA 101556 U UA 101556 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до фармакотерапії, і може бути використана для оцінки впливу різних доз біомаси гриба GANODERMA LUCIDUM на гуморальну імунну відповідь. Пошук та розробка імуномодуляторів рослинного походження з метою застосування їх у комплексній терапії хворих з різною соматичною патологією, інфікованих вірусними, бактеріальними, грибковими та атиповими збудниками є актуальною проблемою. Увагу дослідників багатьох країн світу привертають до себе природні об'єкти, зокрема їстівні гриби, які використовуються не тільки як продукти харчування, але і як цінна сировину для одержання речовин лікувально-профілактичної і лікувальної дії. Більшість традиційних знань про лікувальні властивості грибів походить з Далекого Сходу, де здавна вирощуються, культивуються та використовуються такі базидіальні гриби, як Ganodermalucidum (тpyтовик лакований), Lentinusedodes (шиїтаке), Coriolusversicolor (трутовик різнокольоровий) та ін. [1]. Один з найвідоміших базидіальних грибів - Ganodermalucidum (трутовик лакований). Дослідження Ganodermalucidum останніх років призвели до виділення з нього біологічноактивних речовин, що мають імуномодулюючі, протипухлинні, противірусні, антибіотичні, гепатопротекторні, антиоксидантні, гіполіпідемічні, гіпоглікемічні, генопротекторні властивості, здатні регулювати роботу серцево-судинної, дихальної та нервової системи [2]. Більшість з перерахованих вище біологічних ефектів, в тому числі і протипухлинна дія, обумовлена імуномодулюючими властивостями гриба. Не дивлячись на те, що загальна кількість публікацій, присвячених Ganodermalucidum, значна, відчувається дефіцит досліджень найбільш перспективних для практичного використання штамів гриба. З огляду на роль профілактичного напряму в охороні здоров'я населення України, проблема розробки біологічно-активних продуктів на основі рослинної сировини з адаптогенними та імуностимулюючими властивостями є надзвичайно актуальною. Не менш важливим аспектом проблеми є пошук та розробка імуномодуляторів з метою застосування їх у комплексній терапії хворих з різною соматичною патологією, інфікованих вірусними, грибковими та атиповими збудниками. В численних дослідах in vitro та in vivo було показано, що водні екстракти плодових тіл, спор і міцелію G. Lucidum та виділені з них полісахаридні фракції та індивідуальні полісахариди, а також деякі тритерпени і білок LZ-8, мають виражені імуномодулюючі властивості. Характер дії біологічно-активних речовин G. Lucidum на імунну систему різноманітний та включає в себе вплив на функції гуморального та клітинного імунітету. Найбільш важливими біологічно активними речовинами, що проявляють імуномодулюючу активність є полісахариди, зокрема βD-глюкани. Незважаючи на велику кількість досліджень по вивченню впливу окремих біологічноактивних речовин, виділених з міцелію, плодового тіла, спор гриба GanodermalucidumHa стан імунітету, цікавим залишається вивчення можливості застосування міцелію гриба Ganodermalucidum для корекції імунодефіцитних станів. Для визначення наявності або відсутності імунотоксичної дії дослідного лікарського засобу застосовують методи дослідження, які дозволять оцінити вплив досліджуваного препарату на: В-клітинний імунітет (гуморальна відповідь); Т-клітинний імунітет (клітинні реакції); фактори неспецифічного імунітету та активність факторів, що беруть участь у специфічному імунітеті. Найближчим аналогом до способу, що заявляється, є спосіб використання димедролу, що має імунотоксичні властивості [3]. Однак, цей спосіб не дозволяє прогнозувати вплив різних доз біомаси гриба GANODERMA LUCIDUM на гуморальну імунну відповідь. Для вивчення гуморальної імунної відповіді дослідного лікарського засобу застосовують методи дослідження, які дозволяють оцінити функціональний стан різних ланок системи імунітету. В основу корисної моделі поставлена задача вивчення характеру дії (імуносупресорна, імуностимулююча) біомаса гриба Ganoderma Lucidum на гуморальну імунну відповідь при курсовому введенні. Ці дані дозволять обґрунтувати наступні дослідження по вивченню імуномодулюючої дії Ganoderma Lucidum на експериментальних моделях, що виникають при порушеннях у функціонуванні імунної системи. Технічний результат, що досягається при здійсненні заявленої корисної моделі, полягає у підвищенні точності оцінки ефективності на гуморальну відповідь біомаси гриба Ganoderma Lucidum за рахунок дослідження загальної кількості лімфоцитів периферійної крові та лейкоцитарної формули та реакції бласттрансформації лімфоцитів. За доступними літературними даними такий спосіб не відомий. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб включає дослідження крові, в якому, згідно з корисною моделлю, додатково визначають титр гемолізинів та гемаглютинінів в сироватці крові, кількість антитілоутворюючих клітин в селезінці до і після лікування, розраховують 1 UA 101556 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 співвідношення їх по відношенню до контролю і при зміні показників, оцінюють гуморальну імунну відповідь до біомаси гриба Ganoderma Lucidum. Переваги цього способу: простота у проведенні досліджень і визначенні показників. Спосіб здійснюється наступним чином: Дослідження імунотоксичної дії проводили на статевозрілих (віком 3-5 міс.) тваринах: мишах-самцях лінії СВА/Са. Тварини були розподілені на 5 груп: контрольні, які отримували розчинник та опитні, які протягом місяця отримували біомасу гриба Ganoderma Lucidum у різних дозах: з розрахунки 0,01 мг на 20 гр маси тіла; 10 мг на 20 гр маси тіла; 1 мг на 20 гр маси тіла або 10 мг на 20 гр маси тіла. Об'єм імунологічних досліджень включають визначення: 1. Факторів, що беруть участь у специфічному імунітеті, оцінка впливу препаратів на масу та клітинність лімфоїдних органів. 2. Вплив на гуморальний імунітет: визначення титру гемолізинів та гемаглютинінів, визначення кількості антитілоутворюючих клітин в селезінці [3]. Забір крові у лабораторних тварин та отримання сироватки. Для евтаназії мишей застосовували передозування ефіру медичного для наркозу [4]. Після проведення процедури евтаназії тварин проводили процедуру забору крові з орбітального синусу шляхом енуклеації. Кров центрифугували при 1500 об/хв протягом 15 хвилин. Сироватку відбирали в пробірки. Відібрану сироватку використовували (після заморожування при -20 °C) для визначення титрів гемолізинів і гемаглютинінів [5]. Виділення лімфоїдних органів. Одразу після видалення селезінку або тимус занурювали до розчину Хенксу, який містив в собі 10 % сироватки ембріонів корів (СЕК). Селезінку гомогенізували в 3,0-5,0 мл розчину Хенксу, тимус гомогенізували в 1,0 мл розчину Хенксу. Подрібнену у гомогенізаторі тканину переносили у центрифужні пробірки, фільтруючи її через капроновий фільтр. Пробірки з клітинами центрифугували 10 хв при 1500 об/хв та температурі + 4 °C. Після центрифугування зливали надосад, відбирали клітини для підрахунку. Підрахунок загальної кількості клітин проводили у камері Горяєва з використанням 3 % оцтової кислоти, що дозволяє вилучити з обліку еритроцити [6]. Відносну масу тимусу та селезінки розраховували як відсоток співвідношення маси тимуса або селезінки до маси тіла. Індекс заселення лімфоїдними клітинами тимусу та селезінки розраховували як співвідношення кількості клітин в органі до маси органу. Виділення клітин кісткового мозку. Одразу ж після видалення стегнові кістки вміщували до чашки Петрі. Стегнові кістки ретельно відокремлювали від м'яких тканин, ножицями зрізали епіфізи. Вилучали клітини шляхом вимивання розчином Хенксу (в об'ємі 1,0 мл) з додаванням 15 % СЕК за допомогою шприца з ін'єкційною голкою. Відбирали клітини для підрахування. Підраховували кількість клітин у камері Горяєва [6]. Визначення титру гемаглютинінів та гемолізинів в сироватці крові. Визначення титру гемаглютинінів. Для того, щоб виключити імунний гемоліз, дослідну сироватку декомплементували шляхом нагрівання протягом 30 хв. при температурі 56 °C. Потім готували ряд послідовних розведень (у об'ємному відношенні 1:4, 1:8, 1:16 т.д.) у пластикових круглодонних планшетах в об'ємі 0,2 мл. До розведень сироватки додавали 0,1 мл 1 % завис еритроцитів барана та залишали при кімнатній температурі. Оцінку реакції проводили через 2-4 години. При позитивній реакції, еритроцити, що аглютинували, вистилають дно лунки рівномірним шаром. При негативній реакції усі еритроцити збираються разом у вигляді крапки. Визначення титру гемолізинів. Сироватку дослідних тварин, як і при визначенні гемаглютинінів, декомплементували шляхом нагрівання протягом 30 хв. при температурі 56 °C. Потім готували ряд послідовних розведень (у об'ємному відношенні 1:4, 1:8, 1:16 т.д.) у пластикових круглодонних планшетах в об'ємі 0,2 мл, і додавали 0,1 мл 1 % завису еритроцитів барана та 30 хв. інкубували при температурі 37 °C. До суміші додавали комплемент мурчака в об'ємі 0,05 мл, який попередньо розводили фізіологічним розчином у об'ємному відношенні 1:10. Суміш перемішували та інкубували при температурі 37 °C одну годину. Оцінка результатів. Результати визначення гемаглютинінів виражали у вигляді титру антитіл - величини, зворотної останньому розведенню сироватки, яка ще аглютинує еритроцити. Найбільше розведення сироватки, яке викликає гемоліз еритроцитів, визначали як титр гемолізинів. Результати представляли в одиницях - log2 [7]. Реакція локального гемолізу в гелі (за Єрне). Для оцінки рівня гуморальної імунної відповіді 8 тварин імунізували еритроцитами барана внутрішньочеревинно в дозі 2,5·10 клітин на мишу (0,2 мл 3 % завис еритроцитів барана на фізіологічному розчині). Тварин забивали на 5-у добу після ін'єкції. 2 UA 101556 U 5 10 15 20 25 30 35 Для постановки реакції виділяли селезінку. Готували 1 % розчин агарози на розчині Хенкса. Чашки Петрі розставляли на столику для підігріву, заливали в кожну розплавлений розчин 1 % агарози, розрівнювали круговими рухами та переставляли на вирівнювальний столик для застигання. 10 клітин селезінки (у відповідному об'ємі) додавали до 0,65 мл суміші розплавленої агарози з 3 % зависом еритроцитів барана (5:1). Агарозу з еритроцитами тримали на водяній бані при температурі 48 °C. Отриману суміш спленоцитів з антигеном обережно розмішували та виливали на підігріту чашку Петрі поверх першого шару агарози, давали застигнути на вирівнюючому столику та вміщували до термостату. Чашки інкубували 1 годину при 37 °С. В кінці інкубації поверх другого шару (суміші спленоцитів з антигеном) додавали по 0,8 мл розведеного 1:10 розчину комплементу (ліофілізованої сироватки мурчаків). Чашки інкубували з комплементом при 37 °C ще 1,5 год. Оцінка результатів. Підраховували кількість видимих зон гемолізу на чашку. Результати 6 представляли у вигляді кількості антитілоутворюючих клітин (АУК) на 10 клітин, або абсолютної кількості АУК в перерахунку на загальну кількість клітин в органі [8]. Експериментальні дані оброблялися загальноприйнятими методами варіаційної статистики. Кількісні характеристики випадкових величин представлені у вигляді середніх значень (М) та помилок середніх значень (m). Розрахунки проводились за допомогою комп'ютерних програм "Statistica 6.1" та "Ехсel". Значущість розбіжностей показників оцінювалася за критерієм Ст'юдента (t) (у разі нормального розподілу) або за критерієм Вілкоксона-Манна-Уітні (U) (у разі відмінності закону розподілу від нормального). Зміни показників вважали вірогідними при P