Спосіб отримання синтетичного димеру ціановірину з підсиленою антивірусною активністю

Реферат: Спосіб отримання рекомбінантного димеру ціановірину з підсиленою антивірусною активністю, що включає послідовне клонування двох копій гену ціановірину в плазмідний вектор, трансформацію спеціального штаму Е. соlі плазмідним вектором та афінне очищення рекомбінантного димеру ціанові рину. Розроблено дизайн генетичної конструкції pPAL-[CV]2 in silico, синтез цільового гену in vitro із використанням полімеразної ланцюгової реакції. Модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profinity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізин протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7. UA 102475 U (12) UA 102475 U UA 102475 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної біотехнології і може бути використана в процесах отримання антивірусного препарату ціановірину для медичного призначення. Ціановірин, низькомолекулярний білок з ціанобактерії Nostoc ellipsosporum, який був виявлений в ході тотального скринінгу інгібіторів ВІЛ [1]. Противірусна активність препарату опосередкована специфічною високою спорідненістю до взаємодії з поверхневими глікопротеїнами (олігоманозні цукри) вірусної оболонки. Ціановірин, специфічно зв'язуючись з глікопротеїдами вірусів, позбавляє їх можливості інфікувати клітини. Була продемонстрована висока антивірусна активність ціановірину проти вірусів грипу А і В (ефективна концентрація ЕС50=4-40 нг/мл) [2], проти вірусу гепатиту С (ЕС50=17 нг/мл) [3] та інших глікозильованих вірусів, включаючи вірус Ебола [4]. Відомий спосіб отримання рекомбінантного ціановірину (US 5962653), який відрізняється від заявленого тим, що як експресуючий вектор використовують pFLAG конструкцію, яка кодує з Nкінця ціановірину октапептид (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), відомий як FLAG-тег. Після індукції експресії рекомбінантного ціановірину в клітинах кишкової палички (Е.соlі) для його очищення використовують афінну хроматографію. Як афінний матрикс використовують антиFLAG моноклональні антитіла. Бактеріальний лізат наносять на афінну колонку, промивають 2+ 2+ буфером, який містить іони Са , оскільки взаємодія FLAG-тегу з антитілами є Са залежна. Після інтенсивного промивання від неспецифічних бактерійних протеїнів рекомбінантний FLAG2+ ціановірин елююється з афінного матриксу буфером, що містить Са хелатуючий реагент ЕДТА. Основним недоліком даного методу є наявність у складі молекули рекомбінантного ціановірину, N-кінцевого октапептиду FLAG, що може впливати на противірусну активність цього препарату. Найбільш близьким методом отримання рекомбінантного ціановірину, що заявляється, є пат. WO 2003072594 А2, згідно з яким отримують димер з підсиленою антивірусною активністю (ІС50 9 нМ) із використанням хроматографії під високим тиском та зворотною фазою (RP-HPLC). Бактерійний лізат після індукції експресії рекомбінантного димеру ціановірину наносять на матрикс С18, урівноважений 0,05 % трифтороцтовою кислотою. Елюцію ціановірину проводять лінійним градієнтом (20-40 %) ацетонітрилу. Недоліком методу є використання токсичних органічних розчинників та відсутність можливості масштабування процесу препаративного виділення рекомбінантого димеру ціановірину. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити технологію отримання рекомбінантного димеру ціановірину з підвищеною антивірусною активністю шляхом використання системи Profinity eXact™ (Bio-Rad), яка передбачає отримання біологічно активного димеру рекомбінантного ціановірину з підвищеною антивірусною активністю, що не містить у своєму складі N-термінального метіоніну, розміром 202 а.з. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб отримання синтетичного димеру ціановірину з підсиленою антивірусною активністю, що включає клонування гену ціановірину в плазмідний вектор, трансформацію спеціального штаму Е.соlі плазмідним вектором та афінне очищення димеру рекомбінантного ціановірину, згідно з корисною моделлю, включає дизайн генетичної конструкції pPAL-[CV]2 in silico, синтез цільового гену in vitro із використанням полімеразної ланцюгової реакції, модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profinity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізин протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7. Система Profinity eXact включає 3 модулі: для клонування чужорідних генів, бактерійної експресії рекомбінантних протеїнів в кишковій паличці (Е. соli) та афінного очищення цільового протеїну, вільного від тегів (http://www.bionixlab.com/index.php?page=shop.product_details&flypage=shop.flypage&product_id= 83&category_id=4&manufacturer_id=0&option=com_virtuemar&Itemid=1). Модуль для клонування чужорідних генів складається з плазмідної молекули ДНК pPAL-7, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує генетично змінений продомен субтилізину та унікальні сайти для клонування чужорідних генів у єдиній відкритій рамці зчитування із продоменом субтилізину, розміром 75 амінокислотних залишків (а.з.). Плазмідна ДНК pPAL-7 являє собою кільцеву молекулу ДНК, що складається з 5901 пар нуклеотидних залишків (п.н.з.) та містить наступні генетичні елементи: регуляторну промотерну ділянку з бактеріофагу Т7, ген, що кодує репресор LacI з бактеріофагу лямбда, ColE1 початок реплікації та ген бета-лактамази, що надає стійкість бактеріальному штаму Е. соlі, що містить плазміду pPAL-7, до антибіотику ампіциліну (фіг. 1). Модуль для експресії рекомбінантних протеїнів (трансформація спеціального штаму Е.соlі плазмідним вектором) представлений бактерійним штамом E. coli, BL21(DE3). Цей штам широко 1 UA 102475 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використовується в лабораторній практиці як спеціальний реципієнт для забезпечення індукованої експресії генів, що транскрибуються під контролем Т7 промотору. Штам BL21(DE3) лізогенний та містить у геномі копію Т7 РНК полімерази під контролем lacUV5 промотору. Індукція експресії за допомогою ІПТГ продукує Т7 РНК полімеразу, що в свою чергу призводить до ініціації транскрипції цільових генів, що знаходяться під контролем Т7 промотору плазміди pPAL-7. Крім цього, штам Е. coli BL21(DE3) є дефіцитним на протеази OmpT та lon, що забезпечує покращення стабільності рекомбінантних протеїнів. Модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profinity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізин протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7. Специфічна взаємодія (Kd