Спосіб гіпотермічного зберігання ізольованої печінки

Спосіб гіпотермічного зберігання ізольованої печінки, який включає насичення органа консервувальним розчином, його ізоляцію і наступне зберігання при 0-4°С, який відрізняється тим, що попередньо in vivo вводять цитозоль ембріональних тканин людини, а як консервувальне середовище використовують сахарозовмісний розчин. Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використана для зберігання ізольованої печінки при 0-4°С з метою подальшої трансплантації. Найбільш близьким до способу, що заявляется, є спосіб гіпотермічного зберігання ізольованої печінки в середовищи UW, яке містить: лактобіонат калію - ЮОмМ; калій фосфорнокислий -25мМ; магній сірнокислий - 5мМ; рафіноза - ЗОмМ; аденозін - 5мМ; глутатіон - ЗмМ; бактеріум - 0,5мл; дексаметазон - 8мг; алопуринол -1мМ; гідроксіетилкрохмаль - 50г. Згідно зі спосібом печінку насичують середовищем UW зі швидкістю 5-10мл/хв при 0°С і переносять в бюкси для подальшого гіпотермичного зберігання при 0-4°С [1]. Недоліком способу є те, що він не забезпечує збереження високої функціональної активності клітин печінки впродовж ії гіпотермічного зберігання. Вже після 2 годин починається поступове зниження такого важливого енергетичного параметра як рівень АТФ, а також спостерігається підвищення рівня ТБК-активних продуктів. Це пов'язано з тим, що консервувальний розчин містить ряд проникаючих в клітину компонентів (Ю", РО43", Мд 2+ , SO42'), які в умовах гіпотермії викликають порушення осмотичного тиску в клітинах і призводять до набряку тканини. В основу корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб гіпотермічного зберігання ізольованої печінки тварин, в якому попередня обробка in vivo біологічно активною речовиною ембріонального походження і заміна консервуючого середовища дозволять зменшити ступінь пошкодження печінки і, таким чином, підвищити функціональну активність клітин органу. Ця задача вирішується тим, що у способі гіпотермічного зберігання ізольованої печінки, який включає насичення органу консервувальним розчином, його ізоляцію і наступне зберігання при 04°С, згідно з корисною моделлю, тваринам попередньо in vivo вводять цитозоль ембріональних тканин людини (ЦЕТ), а в якості консервуючого середовища використовують сахарозовмістний розчин. Введення до організму in vivo ЦЕТ дозволяє підвищити функціональну активність печінки протягом довгострокового гіпотемічного зберігання ізольованого органу (по показникам АТФ на 24%). Спосіб здійснюють таким чином. Через 4 години після введення ЦЕТ, печінку анестезованих щурів відмивають від крові, насичують сахарозовмістного середовищем і піддають гіпотермічному зберіганню при 0-4°С. Приклад. Дослідження здійснювали на нелінійних білих щурах вагою 200-250г, які знаходились на стандартному харчовому раціоні в умовах віварію. Усі маніпуляції з тваринами проводили згідно з правилами Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших дослідних цілях". В якості джерела біологічно активної речовини (22) 01.04.2005 (24)15.11.2005 (46) 15.11.2005, Бюл. № 1 1 , 2005 р. (72) Петренко Олександр Юрійович, Семенченко Ольга Анатоліївна, Черкашина Дар'я Вікторівна, Сомов Олександр Юрійович, Ткачова Олена Миколаївна (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБЮЛОПЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ CD CM 10264 ембріонального походження був використаний препарат „Фетатек", який являє собою цитозоль ембріональних тканин людини Для виготовлення фетатеку отримували 40%-й гомогенат м'яких тканин плодів людини 9-12 тижнів гестаци, який центрифугували протягом 40хв при 8000д Супернатант було піддано високошвидкісному ультрацентрифугуванню (105000д, 90хв) для отримання постмікросомальної фракції, яку використовували в роботі Усі маніпуляції щодо отримання фетатеку проводили в стерильних умовах на холоді, готовий препарат зберігали при -18°С або в рідкому азоті Як максимально ефективне було обрано введення фетатеку щурам за 4 години до ізоляції печінки у стегнову вену у дозі 0,Змл/100г ваги Контрольні групи отримували рівні об'єми фізіологічного розчину Роботу з тваринами проводили з використанням наркозу (діетиловий ефір) Через 4 години після введення in vivo фетатеку або фізіологічного розчину, печінку анестезованих щурів перфузували in situ охолодженим до 4 °С фізіологічним розчином через портальну вену з використанням перистальтичного насосу зі швидкістю 2 5-3 Омл/хв/г ВІДТІК крові і перфузату здійснювали через нижню порожнисту вену, яку надсікали в момент початку перфузп Печінку, після відмивання і насичення й середовищем консервування, видаляли з тіла тварини і негайно переносили в бюкси, наповнені охолодженим розчином консервування Підготовлену описаним вище чином печінку щурів зберігали в умовах побутового холодильника при температурі 0-4°С протягом 1 і 24 годин Наприкінці кожного терміну зберігання з печінки готували гомогенат, в якому визначали вміст АТФ і рівень ТБК-активних продуктів В якості середовищ консервування використовували розчин UW і сахарозовмютний розчин (натрій фосфорнокислий - 1 8г/л, калій фосфорнокислий - 2 04г/л, калій хлористий 0 37г /л, магній сернокислий 0 45г/л, кальцій хлористий 0 71г/л і сахароза 85г/л бідістільованої води, рН 7 4) [2] При дослідженні внутрішньоклітинного вмісту АТФ після 1-годинного зберігання ізольованого органу в розчині UW і сахарозовмістному середовищі були отримані аналогічні результати, які свідчать про високий рівень інтактності клітин печінки і про їх адекватну реакцію на умови короткочасного гіпотермічного зберігання (табл 1) При вивченні ефективності введення щурам фетатеку, гіпотермічне зберігання печінки протягом 1 години призводило до різкого збільшення рівня АТФ (в 1 5 рази), що може бути доказом прямої ди ембрюспецифічних факторів, розташованих у препараті Після 24-ГОДИННОГО гіпотермічного зберігання печінки в розчині UW зафіксовано значне зниження рівня АТФ, використання сахарозовмістного розчину, дозволяло зберегти цей показник на вірогідно вищому рівні Однак найвищий результат був отриманий після попередньої обробки тварин фетатеком Для подальшого обґрунтування попередньої обробки щурів цитозолем ембріональних тканин in vivo була вивчена інтенсивність вільнорадикальних процесів в печінці після гіпотермічного зберігання (табл 2) Вже через 1 годину зберігання спостерігалось підвищення базального рівня ТБКактивних продуктів Попередня обробка тварин фетатеком сприяла антиоксидантному захисту Аналогічні закономірності були отримані і при продовженні терміну зберігання печінки до 24 годин Попередня обробка фетатеком приводила до нормалізації базального рівня ТБК-активних продуктів у печінці на всіх етапах експерименту Таким чином, отримані результати свідчать, що цитозольна фракція ембріональних тканин при гіпотермічному зберіганні органу має значну гепатопротекторну дію, що супроводжується нормалізацією вільнорадикальних процесів та збереженням рівня АТФ, що може бути ефективним засобом попередньої підготовки організму в цілому і, зокрема печінки, перед стресорним впливом Таблиця 1 Вміст АТФ (мкмоль/г) в печінці після и зберігання при 4 °С (п=7) Умови зберігання Термін зберігання, година Розчин UW Сахарозовмютний р-н без Сахарозовмютний р-н, з обробки ЦЕТ обробкою ЦЕТ 5 18±0 24* 1 (контроль), 2 75 ± 0 007 8 48 ± 0 5** 24 0 15±0 02 1 89 ±0 28* 2 23 ± 0 6 - зміни достовірні порівняно з умовами збе- зміни достовірні порівняно з розчином UW рігання без обробки ЦЕТ Таблиця 2 Базальний рівень ТБК-активных продуктів, пмоль МДА /мг білка (п=7) Термін зберігання, (4 Сахарозовмютний розчин Сахарозовмютний розчин, з обробкою ЦЕТ без обробки ЦЕТ °С) година 0 (інтакт) 406,1+58,9 498,8 ±19,0** 1 год 662,2 ± 78 2* 348,0 ±31,5** 24 год 558,0 ±31,6 ** - зміни достовірні порівняно з умовами збе- зміни достовірні порівняно з інтактом рігання без обробки ЦЕТ 5 10264 Джерела інформації: 1. Churchill Т., Fuller BJ. Effects of sodium and potassium channel antagonists on the energy metabolism of rat liver during cold storage // Transplantation. -1995. - 59. - P. 904-907. Комп'ютерна верстка Д Дорошенко 6 2. Семенченко О.А., Шаніна І.В., Петренко О.Ю. Середовище для гіпотермічного зберігання ізольованої печінки. Патент України № 57680 А, A01 N1/02,2003 Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601