Спосіб одержання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній цукрових буряків на основі апозиготії та цитоплазматичної чоловічої стерильності

Реферат: Спосіб одержання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній цукрових буряків на основі апозиготії та цитоплазматичної чоловічої стерильності включає: безпилковий метод репродукції насіння; використання як донорів гаплоїдів і дигаплоїдів селекційних матеріалів з цитоплазматичною чоловічою стерильністю цукрових буряків і апозиготією; ідентифікацію гаплоїдів та міксоплоїдів в апоміктичних потомствах за генеративного ембріогенезу нерегулярного типу. З метою збільшення виходу гаплоїдів та ефективності індукції дигаплоїдів у три рази, порівняно з відомими способами, застосовуємо метод культури недозрілих апоміктичних зародків, додатково ідентифікацію мікдоплоїдів (n, 2n, 4n) і спонтанну поліплоїдизацію в умовах in vitro. UA 104295 U (12) UA 104295 U UA 104295 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільського господарства, а саме до селекції і генетики сільськогосподарських рослин, зокрема цукрових буряків і може бути використана для створення гаплоїдних і дигаплоїдних ліній в умовах in vitro на основі селекційних матеріалів з цитоплазматичною чоловічою стерильністю (ЦЧС) і апозиготичним способом репродукції насіння. Гаплоїдія - ефективний шлях одержання гомозиготних диплоїдних ліній у багатьох видів культурних рослин, в тому числі і у цукрових буряків. Дослідження насіння цукрових буряків, що отримане шляхом перехресного запилення показало, що моноплоїди в популяціях -6 зустрічаються з низькою частотою. Низька частота гаплоїдів (10 ) в зразках насіння змусила дослідників шукати більш ефективні методи у цукрових буряків (Лєван 1945 р.). На даний час у багатьох селекційних установах використовують біотехнологічних метод виділення гаплоїдів "цукрових буряків шляхом культивуванні недозрілих насіннєвих зачатків (Bosemark 1985 р., Славова 1986 p.; Білоус В.О. 2006 p.). Відсоток виходу гаплоїдних ембріонів із клітин зародкових мішків варіює від 0 % до 13 %. Вперше Малецький С.Г., Малецька К.І. виділили гаплоїди із зразків насіння отриманих апозиготичним способом при саморепродукції насіння у пилкостерильних рослин з ЦЧС (2010 p.). Вихід гаплоїдів за довжиною корінця не перевищував 6,25 %. Ембріологічні дослідження у цукрових буряків вказують на можливість, розвитку апоміктичних зародків, як із соматичних клітин (адвентивна ембріонія) так і з генеративних клітин зародкового мішка (гаметофітний ембріогенез) (Ширяева Е.Л. 1984р., Жужжалова Т.П. 2011 р.), рослини що утворюються із адвентивних зародків можуть формувати константне потомство завдяки розвитку із соматичних клітин нуцелусу та інтегументів. Нова генетична мінливість та висока гомозиготність характерна для апозиготичних зародків, що розвинулись з гаплоїдних клітин зародкового мішка (Малецька. К.І. 2009 р.). В основу корисної моделі поставлена задача, збільшити вихід гаплоїдів в умовах in vitro, завдяки використанню методу культури недозрілих апоміктичних зародків вдосконаленого добором за морфологічними маркерними ознаками, забарвлення мікророслин R+r-, спонтанною поліплоїдизацією та індукцією дигаплоїдів без використання поліплоїдизуючих мутагенних речовин. Сутністю корисної моделі є збільшення виходу гаплоїдів в умовах культури недозрілих апоміктичних зародків при апозиготії та ЦЧС в три рази, завдяки диференціації за маркерними ознаками, забарвленням мікророслин R+r- та плоїдністю з використанням цитофотометричних методів, спонтанної поліплоїдизації в основі індукції дигаплоїдів без дії мутагенних поліплоїдизуючих речовин. Відомий спосіб одержання ембріокультури, а саме гаплоїдних і дигаплоїдних рослин цукрових буряків, з використанням ізольованих насіннєбруньок і зародків в культурі in vitro (Білоус В.О., Ільєнко І.І., Олійник Н.А. та ін.). До методики одержання гаплоїдних рослин цукрових буряків з ізольованих незапліднених насіннєвих зачатків. // Цукрові буряки. - 2006. № 6. - С. 12-13. Спільні суттєві ознаки відомого способу і пропонованої корисної моделі: використання штучних живильних середовищ за співвідношенням макро- і мікроелементів, за прописами Гамборга; культивування їх на поживних середовищах; відбір гаплоїдів в умовах in vitro. Проте, у відомому способі для створення гаплоїдних ліній, використовують недозрілі насіннєбруньки, а із виділених гаплоїдних мікророслин, дигаплоїди запропоновано створювати з використанням середовища з 0,1 % колхіцину. Визначення плоїдності регенерантів можливе лише за допомогою складного цитологічного аналізу. Такий процес стабілізації гаплоїдних регенерантів є досить трудомістким, потребує великої кількості пасажів і на відміну від пропонованого винаходу значних затрат часу та праці. Корисна модель відрізняється від відомого способу: вихідним матеріалом для індукції гаплоїдів і дигаплоїдів є пилкостерильні лінії з ЦЧС, отримані в умовах безпилкового режиму; донорами ембріокультури є недозрілі апоміктичні зародки на 16, 20-ту добу після початку цвітіння; добір гаплоїдів, міксоплоїдії та диплоїдів проводиться з використанням генетичних селективних маркерів забарвлення мікророслин в умовах in vitro; поліплоїдизація гаплоїдів та виділення дигаплоїдів проводиться в процесі пасажування і спонтанної поліплоїдизації з використанням цитофотометричних методик. 1 UA 104295 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відомий спосіб диференціації апоміктичних зародків за типом апозиготії, методом цитологічних досліджень мікротомних препаратів Ширяева Е.Л. Методические указания по цитоэмбриологическим исследованиям в селекции сахарной свеклы // Киев 1984 р. С. 62. Спільними суттєвими ознаками відомого способу і корисної моделі є: диференціація зародків із соматичних клітин нуцелусу за типом адвентивної ембріонії та апоспорії; диференціація зародків за генеративним ембріогенезом нерегулярного типу із клітин зародкового мішка. Але, за результатом аналізу мікротомних препаратів ми не можемо відрізнити рослини отримані методом адвентивної ембріонії та апоспорії від генеративного ембріогенезу нерегулярного типу, так як різні типи апозиготії зустрічаються часто на одній насінній рослині, а також регенерують із однієї насіннєбруньки. Корисна модель відрізняється від відомого способу: ідентифікація апозиготичних потомств відбувається в умовах культури in vitro; добір апоміктичних зародків за генеративним і соматичним ембріогенезом відбувається з використанням генетичних селективних маркерів забарвлення мікророслин; аналіз плоїдності ембріокультури та ідентифікація гаплоїдних, міксоплоїдних, диплоїдних проростків проводиться з використанням цитофометричних методик за кількістю ядерного ДНК. Найбільш близьким до даної корисної моделі за сукупністю ознак є спосіб одержання гаплоїдів і дигаплоїдів в апозиготичних потомствах цукрових буряків Малецької К.І. і Малецького С.Г. (Малецкая К.И., Малецкий С.И. Гаплоиды в апозиготических потомства сахарной свеклы. Энциклопедия рода Beta: биология генетика и селекция, 2010 г.). Спільними суттєвими ознаками близького способу і даної корисної моделі є: використання як донорів гаплоїдів і дигаплоїдів, селекційних матеріалів з цитоплазматичною чоловічою стерильністю цукрових буряків і апозиготією; безпилковий метод репродукції насіння; ідентифікація гаплоїдів в апоміктичних потомствах на основі генеративного ембріогенезу нерегулярного типу. Проте, близький спосіб забезпечує виділення та ідентифікацію гаплоїдів на проростках апозиготичного насіння за їх довжиною. Для одержання гаплоїдних вегетуючих рослин необхідна пересадка в ґрунт. Наявність не стабільного мікроспрогенезу і макроспорогейезу у гаплоїдних і міксоплоїдних насінників, не дозволяє отримати гомозиготний насіннєвий матеріал, вирівняний за плоїдністю. Диплоїдні ж проростки за близького способу можуть формуватися, також із соматичних клітин насіннєбруньок (адвентивна ембріонія, диплоспорія) і не є дигаплоїдами та мають різну генетичну структуру. Основними відмінними суттєвими ознаками корисної моделі є добір насінних рослин, донорів недозрілих апоміктичних зародків, як гетерозигот за маркерним червоним забарвленням гіпокотелю R+r-; індукція недозрілих апоміктичних зародків на 16, 20 добу після початку цвітіння; диференціація гаплоїдних і дигаплоїдний ліній в умовах in vitro за маркерними ознаками (R+;r-); ідентифікація за плоїдністю регенерантів з використанням цитофотометричний методик; спонтанна, поліплоїдизація та добір дигаплоїдів впродовж 2, 3 пасажів. Модель одержання гаплоїдних і дигаплоїдний ліній на основі ембріокультури апозиготичних зародків пилкостерильних ліній цукрових буряків з ЦЧС за рецесивними та домінантними алелями антоціанового забарвлення в умовах in vitro зображена на кресленні. Згідно генетичної моделі, гаплоїдні регенеранти (R+;r-) як з відсутністю антоціанового забарвлення r-, так і з червоним забарвленням мікророслин, могли утворитися від диплоїдних донорних рослин лише в результаті гаметофітного ембріогенезу, із клітин зародкового мішка. Міксоплоїдні (n, 2n, 4n) мікророслини регенерують також із клітин зародкового мішка, за генеративним типом апозиготії, в, результаті раніше доведеного явища емдополіплоїдії при тканинній диференціації апоміктичних зародків (Юданова, 2004 р.). За результатом аналізу плоїдності цитофотометричними методами АП "Partec", ми виділяємо впродовж двох-трьох пасажів в умовах in vitro, стабільні за рівнем геному дигаплоїдні мікророслини. Серед диплоїдних клонів (2х) з червоним забарвленням присутні зародки, що розвинулись із соматичних клітин насіннєбруньок, та не є дигаплоїдами (табл. 1). 2 UA 104295 U Таблиця 1 Мінливість за плоїдністю, антоціановим забарвленням мікророслин, в умовах культури недозрілих зародків Генотипи Кількість рослин за висаджених Кількість № Селекційний генами насіннєбруньок регенерованих п/п номер антоціанона 18, 20 добу, зародків, шт. вого шт. забарвлення B3S patula 1 R+r150 71 2010 F2S 2 R+r200 75 Гр. 2008 11-134чс 3 R+r150 55 к.7 4 F1ST№ 10 R+r250 73 Аналіз за плоїдністю* мікророслин у першого пасаж, % зелених, rчервоних R+ n 2х n, 2n, 4n n n, 2n, 4n 14,8 33,8 16,9 19,7 15,5 18,7 40,0 14,7 20,0 6,6 10,8 58,2 9,2 21,8 12,3 34,2 9,6 23,3 9,6 *Аналіз проведений на АП "Partec" за кількісним вмістом ядерного ДНК 5 10 15 20 25 30 Дані таблиці 1 свідчать, що вихід гаплоїдів, як за рецесивною r-, так і за домінантною R+ ознакою, в сумі становить від 21,9 до 33,4 % при апозиготії і перевищує близький спосіб Малецької К.І. за виходом гаплоїдів - 6,25 % в умовах in vivo (Малецкий С.І., Малецкая Е.І., 2010 г.). Крім того, міксоплоїдні регенеранти з присутністю в клітинній популяції листків гаплоїдних, диплоїдних клітин також дозволяють віднести їх до вихідного матеріалу для одержання дигаплоїдних ліній, що досягається завдяки стабілізації рівня геному впродовж двох-трьох пасажів. Згідно таблиці 1, за результатом визначення плоїдності регенерованих в умова in vitro апоміктичних зародків ми виділяємо: гаплоїдні лінії з зеленим забарвленням гіпокотелю r- та міксоплоїдні лінії, що утворилися методом генеративної ембріонії; гаплоїдні лінії з присутністю антоціанового забарвлення R+ та міксоплоїдні лінії на основі генеративного ембріогенезу нерегулярного типу; диплоїдні мікророслини з антоціановим забарвленням R+ в першому пасажі, серед яких виділяться регенеранти із соматичних клітин насіннєбруньок (інтегументи та нуцелус). Спосіб одержання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній цукрових буряків на основі апозиготії та ЦЧС здійснюється наступним чином: в умовах просторової ізоляції (у полі і теплиці) вирощують пилкостерильні, роздільноплідні лінії, донори недозрілих апозиготичних зародків; добір насінників чс-0 типу і браковка чс-І, чс-ІІ типу за Оуеном (1945 р.); відмітка цвітіння в період активного цвітіння насінних рослин; фіксація недозрілих зародків на 16-20 добу після відмітки цвітіння; одержання мікророслин в умовах штучних живильних середовищ; диференціація мікророслин за присутністю і відсутністю антоціанового забарвлення (R+r-); ідентифікація мікророслин за плоїдністю з використанням цитофотометричних методик; спонтанна поліплоїдизація та добір дигаплоїдних (2n) ліній на основі гаплоїдних та міксоплоїдних регенерантів впродовж другого і третього пасажів з використанням цитофотометричних методів та АП "Partec". Завдяки впровадженню методу культури апоміктичних зародків, використанню генетичних селективних маркерів антоціанового забарвлення мікророслин в умовах in vitro, браковці диплоїдів (2х) з червоним забарвленням та спонтанній поліплоїдізації гаплоїдів та міксоплоїдів з використанням цитофотометричних методів, дозволяє значно збільшити вихід подвоєних гаплоїдів не менше чим у три рази. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб одержання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній цукрових буряків на основі апозиготії та цитоплазматичної чоловічої стерильності включає: безпилковий метод репродукції насіння; використання як донорів гаплоїдів і дигаплоїдів селекційних матеріалів з цитоплазматичною 3 UA 104295 U 5 чоловічою стерильністю цукрових буряків і апозиготією; ідентифікацію гаплоїдів та міксоплоїдів в апоміктичних потомствах за генеративного ембріогенезу нерегулярного типу, який відрізняється тим, що з метою збільшення виходу гаплоїдів та ефективності індукції дигаплоїдів у три рази, порівняно з відомими способами, застосовуємо метод культури недозрілих апоміктичних зародків, додатково ідентифікацію мікдоплоїдів (n, 2n, 4n) і спонтанну поліплоїдизацію в умовах in vitro. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4