Спосіб виділення лектиноподібних білків рослин

Реферат: Спосіб виділення лектиноподібних білків рослин, який включає гомогенізацію рослинного матеріалу в калій-фосфатному буфері при рН 6,8 з додаванням захисних елементів з наступним фракційним центрифугуванням гомогенату на клітинні фракції, з яких отримують екстракт лектиноподібних білків, та очищують шляхом висолювання сульфатом амонію та осадження ацетоном. UA 104385 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб належить до біології, а саме до фізіології та біохімії рослин, і може бути використаний для встановлення фізіологічної ролі лектиноподібних білків у процесах життєдіяльності рослинного організму. Відомий спосіб виділення лектиноподібних білків [Алексидзе Г.Я., Королёв Н.П., Семёнов И.Л., Выскребенцева Э.И. Выделение лектинов и их возможных рецепторов из корнеплода сахарной свеклы // Физиология растений.-1983. - Т. 30, № 6. - С. 1069-1070], що включає: гомогенізацію рослинної тканини 0,01 М калій-фосфатним буфером при рН 7,4 з додаванням 0,4 М сахарози та 1,5 мМ дитіотрейтолу; розподіл отриманої суспензії на клітинні фракції шляхом віджимання; гомогенізацію отриманого осаду у вихідному 0,01 М калій-фосфатному буфері при рН 5,0 з додаванням 0,1 % Тритону Х-100 та 10 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА); їх екстракцію при температурі +4 °C протягом 4 год.; центрифугування отриманої суспензії протягом 30 хв при 20000 g; дрібне фракціонування сульфатом амонію розчину лектиноподібних білків клітинних стінок; центрифугування та розчинення отриманих осадів лектиноподібних білків у фізіологічному розчині; очищення розчинів лектиноподібних білків від надлишку солей шляхом діалізу; додаткове очищення розчинів лектиноподібних білків від усіх домішок шляхом афінної хроматографії з сефарозою 4Б. Недоліком цього способу є виділення тільки лектинів клітинних стінок, використання дорогого обладнання (ультрацентрифуга, афінний хроматограф) та реактивів (дитіотрейтол). Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: гомогенізація рослинної тканини калійфосфатним буфером з додаванням сахарози; розподіл отриманої суспензії на клітинні фракції шляхом віджимання; гомогенізація отриманого осаду у вихідному калій-фосфатному буфері з додаванням Тритону Х-100 та 10 мМ ЕДТА; екстракція лектиноподібних білків при температурі +4 °C; центрифугування отриманої суспензії; осадження лектиноподібних білків клітинних стінок сульфатом амонію; центрифугування та розчинення отриманих осадів лектиноподібних білків у фізіологічному розчині. Відомий спосіб виділення лектиноподібних білків [Бабоша А.В. Действие α-интерферона человека и вирусной инфекции на активность фитогемагглютининов и другие показатели в листьях растений табака и картофеля // Физиология растений.-1995. - Т.42, № 6. - С. 892], що включає: гомогенізацію рослинного матеріалу з 0,01 М фосфатним буфером з додаванням 0,15 М хлориду натрію та 0,1 М аскорбінової кислоти (рН 7,6); центрифугування протягом 15 хв при 10000 g для виділення легкорозчинних лектиноподібних білків; гомогенізацію осаду, що залишився, вихідним буфером з додаванням 0,05 М Тритона Х-100 та його центрифугування протягом 15 хв при 10 000 g для виділення лектиноподібних білків, локалізованих у мембрані. Недоліком цього способу є неможливість окремого виділення мембранних лектинів та лектинів клітинних стінок, а також порушення цілісності білків у процесі виділення без використання захисних компонентів у середовищі для гомогенізації (сахароза, ЕДТА або фенілметилсульфонілфторид). Спільними ознаками з рішенням, що заявляється, є: гомогенізація рослинного матеріалу в буферному розчині, використання в екстракційному середовищі 0,1 М аскорбінової кислоти, що попереджує необоротне окислення білків, а також додавання до екстракційного розчину для виділення лектиноподібних білків, зв'язаних з мембранами, 0,05 М Тритону Х-100; центрифугування отриманого гомогената, гомогенізація та центрифугування отриманого осаду. Відомий спосіб виділення лектиноподібних білків [Комарова Э.М., Выскребенцева Э.И., Трунова Т.И. Активность лектиноподобных белков клеточных стенок и внешних мембран органелл и их связь с эндогенными лигандами в проростках озимой пшеницы при холодовой адаптации // Физиология растений.-2003. - Т.50, № 4. - С. 512], що включає: екстракцію субклітинних фракцій та клітинних стінок 0,02 М калій-фосфатним буфером при рН 7,4 з додаванням 0,36 М сахарози, 0,5 мМ фенілметилсульфонілфториду та 1,5 мМ дитіотрейтолу; розподіл отриманої суспензії шляхом віджимання; гомогенізацію отриманого осаду у 0,02 М калій-фосфатному буфері при рН 5,0 з додаванням 0,36 М сахарози, 0,05 мМ фенілметилсульфонілфториду, 1,5 мМ дитіотрейтолу, 0,05 % Тритону Х-100 та 0,9 % хлориду натрію; їх екстракцію при температурі +4 °C та центрифугування отриманої суспензії протягом 15 хв при 1000 g; фракційне центрифугування суспензії, яка містить органели та цитозоль при 500 g, для розділення на осад ядер та розчин цитозолю з іншими органелами, послідовне центрифугування при 3 000, 10 000 та 100 000 g для відокремлення відповідно пластид, мітохондрій та мікросом. Недоліком цього способу є: виділення субклітинних фракцій, які містять лектиноподібні білки, використання дорогого обладнання (ультрацентрифуги) та дорогих реактивів (дитіотрейтолу та фенілметилсульфонілфториду). 1 UA 104385 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: екстракція клітинних фракцій 0,02 М калій-фосфатним буфером з додаванням 0,36 М сахарози; розподіл отриманої суспензії для відокремлення клітинних стінок від органел та цитозолю шляхом віджимання; гомогенізація отриманого осаду, що містить клітинні стінки, гомогенізація лектиноподібних білків клітинних стінок у 0,02 М калій-фосфатному буфері з додаванням 0,36 М сахарози та 0,05 % Тритону Х100; їх центрифугування та холодова екстракція; центрифугування отриманої суспензії для виділення розчину лектиноподібних білків клітинних стінок; центрифугування суспензії, яка містить органели та цитозоль для розділення на осад органел та розчин цитозолю. Відомі методи виділення лектиноподібних білків не підходять для льону олійного, який у всіх органах, навіть вегетативних, містить багато слизу, що заважає виділенню лектиноподібних білків. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб виділення лектиноподібних білків рослин, який шляхом гомогенізації, екстракції та фракційного центрифугування, з наступним осадженням ацетоном, дозволяє отримати лектиноподібні білки різної клітинної локалізації, спрощує та здешевлює очистку отриманих препаратів лектиноподібних білків для подальшого їх використання. Суттєвими ознаками рішення, що заявляється, є: гомогенізація рослинного матеріалу при наявності піску та карбонату кальцію у співвідношенні 10:1:1 у 0,02 М калій-фосфатному буфері при рН6,8 з додаванням 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА (вихідний буфер); розподіл отриманої суспензії для відокремлення клітинних стінок від органел та цитозолю шляхом віджимання; гомогенізація отриманого осаду, що містить клітинні стінки, для виділення лектиноподібних білків у вихідному буфері при рН 4,0 з додаванням 0,05 % Тритону Х-100 та 0,9 % хлориду натрію; холодова екстракція лектиноподібних білків; центрифугування отриманої суспензії для виділення розчину лектиноподібних білків клітинних стінок; центрифугування суспензії, яка залишилася після вилучення клітинних стінок для видалення цілих клітин, які утворюють осад; центрифугування надосадової рідини, що містить органели та цитозоль для розподілення на осад органел та розчин цитозолю; гомогенізація отриманого осаду, що містить органели, для виділення лектиноподібних білків органел у вихідному буфері з додаванням 0,05 % Тритону Х-100; екстракція лектиноподібних білків органел; центрифугування отриманої суспензії для виділення розчину лектиноподібних білків органел; осадження лектиноподібних білків з їх розчинів, окремо для клітинних стінок, органел та цитозолю шляхом додавання солі сульфату амонію; центрифугування отриманих розчинів; розчинення отриманих осадів лектиноподібних білків у фізіологічному розчині; очищення розчину від нелектинових білків шляхом осадження ацетоном; центрифугування отриманих розчинів; розчинення отриманих осадів лектиноподібних білків у фізіологічному розчині; очищення від залишків Тритону Х-100 ізоаміловим спиртом; центрифугування отриманих розчинів. Відмінними від прототипу ознаками є те, що: усі етапи гомогенізації рослинного матеріалу здійснюють при наявності піску та карбонату кальцію у співвідношенні 10:1:1 у калійфосфатному буфері при рН 6,8 з додаванням 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА; та додатково здійснюють центрифугування суспензії, яка залишилася після вилучення клітинних стінок для видалення цілих клітин, які утворюють осад; гомогенізацію отриманого осаду, що містить органели, для виділення лектиноподібних білків органел у вихідному буфері з додаванням 0,05 % Тритону Х-100; екстракцію лектиноподібних білків органел; осадження лектиноподібних білків з їх розчинів, окремо для клітинних стінок, органел та цитозолю шляхом додавання солі сульфату амонію; центрифугування отриманих розчинів; розчинення отриманих осадів лектиноподібних білків у фізіологічному розчині; очищення розчину від нелектинових білків шляхом осадження ацетоном; центрифугування отриманих розчинів; розчинення отриманих осадів лектиноподібних білків у фізіологічному розчині; очищення від залишків Тритону X-100 ізоаміловим спиртом; центрифугування отриманих розчинів. Спосіб здійснюють таким чином. Рослинний матеріал гомогенізують при наявності піску та карбонату кальцію у співвідношенні 10:1:1 у 0,02 М калій-фосфатному буфері при рН 6,8 з додаванням захисних речовин - 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та0,01 М ЕДТА. Для відокремлення клітинних стінок отриману суспензію віджимають крізь 2 шари лляної тканини. Осад клітинних стінок гомогенізують у вихідному 0,02 М калій-фосфатному буфері при рН 4,0, в який додають захисні речовини - 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА, що додатково містить 0,9 % хлориду натрію та 0,05 % Тритону Х-100. Лектиноподібні білки з клітинних стінок екстрагують протягом 12 год. при 4 °C. Отриману суспензію центрифугують протягом 15 хв при 1000 g, при цьому лектиноподібні білки клітинних стінок переходять у розчин. 2 UA 104385 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для відділення органел суспензію, яка залишилася після вилучення клітинних стінок, центрифугують протягом 5 хв при 100 g, при цьому цілі клітини та шматочки клітин випадають в осад, а надосадова рідина містить органели та цитозоль. Суспензію, яка залишилася після вилучення цілих клітин, центрифугують при 100 g протягом 5 хв для відділення органел, а надосадова рідина містить цитозоль з розчиненими в ньому лектиноподібними білками. Для виділення лектинів з органел осад гомогенізують у вихідному 0,02 М калій-фосфатному буфері при рН 6,8, що містить 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти, 0,01 М ЕДТА та 0,05 % Тритону Х-100 і залишають для екстракції на 20 хв при кімнатній температурі. Отриману суспензію центрифугують протягом 15 хв при 1000 g, у результаті чого лектиноподібні білки органел переходять у розчин. Отримані розчини лектиноподібних білків концентрують та очищують від небілкових домішок шляхом висолювання білків сульфатом амонію при 70 % від його повного насичення. Висолювання проводять протягом 20 хвилин при 4 °C, в результаті цього білки зворотно денатурують та випадають в осад, який відділяють шляхом центрифугування протягом 15 хв при 10 000 g та розчиняють у 0,9 % розчині хлориду натрію. Отримані розчини додатково очищають від нелектинових білків шляхом осадження ацетоном, доводячи його концентрацію в розчині до 60 %. Суспензію витримують 20 хв при 4 °C, після чого центрифугують протягом 15 хв при 10000 g. Отриманий осад розчиняють в 0,9 % розчину хлориду натрію. Залишки Тритону Х-100 видаляють шляхом його екстракції ізоаміловим спиртом та наступним центрифугуванням протягом 5 хв при 10 000 g. У результаті верхній ізоаміловий шар містить Тритон Х-100, а нижній сольовий - лектиноподібні білки. Приклад конкретного виконання. З рослин льону олійного сорту "Південна ніч", які знаходилися на стадії "ялинки", збирали листя у кількості 0,5 г та гомогенізували його у 8 мл 0,02 М калій-фосфатного буферного розчину при рН 6,8 з додаванням 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА при наявності піску та карбонату кальцію у співвідношенні 10:1:1 для нейтралізації кислого клітинного соку. Для відокремлення клітинних стінок віджимали отриману суспензію крізь 2 шари лляної тканини. Осад клітинних стінок, який залишився після віджимання, гомогенізували з додаванням 5 мл 0,02 М калій-фосфатного буфера при рН 4,0, що додатково містив 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти, 0,01 М ЕДТА, 0,9 % хлориду натрію та 0,05 % Тритону Х100, і залишали для екстракції на 12 год. при температурі +4 °C. Після чого центрифугували протягом 15 хв при 10000 g. У розчин при цьому переходили лектиноподібні білки клітинних стінок. Для відділення органел суспензію, яка залишилася після вилучення клітинних стінок, центрифугували протягом 5 хв при 100 g, при цьому цілі клітини та шматочки клітин випадали в осад, а надосадова рідина містила органели та цитозоль. Для відділення органел суспензію, яка залишилася після вилучення цілих клітин, центрифугували: органели при цьому переходили в осад, а надосадова рідина містила розчинені в цитозолі лектиноподібні білки. Для виділення лектинів з органел осад гомогенізували з 0,5 мл вихідного 0,02 М калійфосфатного буфера при рН 6,8, що додатково містив 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти, 0,01 М ЕДТА та 0,05 % Тритону Х-100 і залишали для екстракції на 20 хв при кімнатній температурі. Отриману суспензію центрифугували протягом 15 хв при 10000 g, у результаті цього лектиноподібні білки органел переходили в розчин. Отримані розчини лектиноподібних білків клітинних стінок, органел та цитозолю концентрували та очищували від небілкових домішок, у тому числі і від слизу, шляхом висолювання білків сульфатом амонію при 70 % від його повного насичення із розрахунку 0,5 г цієї солі на 1 мл розчину. Висолювання проводили протягом 20 хв при 4 °C. Білки при цьому денатурували та випадали в осад, який розчиняли в 0,5 мл 0,9 % розчину хлориду натрію. Небілкові домішки в розчин не переходили. Отримані розчини додатково очищували від нелектинових білків шляхом осадження при 60 % насичені ацетону із розрахунку 1 мл ацетону на 0,5 мл розчину лектиноподібних білків. Лише лектиноподібні білки стійкі до денатуруючого впливу такої високої концентрації ацетону, тому при подальшому розчинені осаду у фізіологічному розчині вони відновлювали свою початкову структуру. Решта білків при такій концентрації ацетону остаточно денатурувала. Отриману суспензію витримували 20 хв при 4 С, після чого центрифугували протягом 15 хв при 10000 g. Отриманий осад розчиняли в 0,5 мл 0,9 % розчину хлориду натрію. Сліди Тритону Х-100, який заважає при визначенні активності лектиноподібних білків, видаляли шляхом їх екстракції ізоаміловим спиртом, для чого до 0,5 мл розчину лектиноподібних білків додавали 0,2 мл ізоамілового спирту та центрифугували протягом 5 хв. при 10000 g. У результаті верхній ізоаміловий шар містив Тритон Х-100, а нижній сольовий - розчин лектиноподібних білків. 3 UA 104385 C2 5 У результаті було отримано 3 розчини об'ємом по 0,5 мл, які містили очищені лектиноподібні білки клітинних стінок, органел та цитозолю відповідно. Концентрація лектиноподібних білків клітинних стінок в отриманому розчині склала 1,59 мг/мл, лектиноподібних білків органел - 0,41 мг/мл, а лектиноподібних білків цитозолю - 1,33 мг/мл. Таким чином, рішення, що заявляється, дозволяє оптимізувати та здешевити екстракцію лектиноподібних білків. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 20 Спосіб виділення лектиноподібних білків рослин, який включає екстракцію клітинних фракцій калій-фосфатним буфером з додаванням сахарози; відокремлення клітинних стінок від інших фракцій; виділення лектиноподібних білків клітинних стінок шляхом гомогенізації у калійфосфатному буфері з додаванням сахарози і Тритону Х-100 та центрифугування; додаткове центрифугування суспензії, яка містить органели та цитозоль, який відрізняється тим, що гомогенізацію рослинного матеріалу здійснюють при наявності піску та карбонату кальцію у співвідношенні 10:1:1, а при гомогенізації та екстракції до калій-фосфатного буфера (рН 6,8) додають аскорбінову кислоту та ЕДТА; додатково здійснюють видалення цілих клітин та екстракцію лектиноподібних білків з органел та цитозолю шляхом їх гомогенізації з додаванням у буфер Тритону Х-100 та центрифугування; а очищення отриманих розчинів лектиноподібних білків здійснюють шляхом висолювання сульфатом амонію, осадження ацетоном та видалення Тритону Х-100. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4