Спосіб тривалого зберігання анаеробних мікроорганізмів

Реферат: Спосіб тривалого зберігання анаеробних мікроорганізмів включає приготування стерильного розчину альгінату натрію, в який інокулюють культуру анаеробних бактерій, мікробну завись вносять у ініціатор полімеризації. Як ініціатор полімеризації застосовують стерильний розчин лактату кальцію, отримані інкапсульовані зразки анаеробних культур зберігають у стерильних епендорфах при -70 °C. UA 104445 U (12) UA 104445 U UA 104445 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної мікробіології і може використовуватися для довготривалого зберігання штамів анаеробних бактерій. Відомі складні способи тривалого збереження штамів анаеробних мікроорганізмів із застосуванням методів кріоконсервації, ліофільного висушування та сорбційно-контактного зневоднення. Ліофілізація як ефективний спосіб довготривалого зберігання анаеробних музейних культур (більше 30 років) полягає у видаленні води із заморожених суспензій бактерій шляхом сублімації при низькому тиску (Акименко Л.І., Котляр Д.О., Палійчук Н.С. Методика виділення, ідентифікації та довгострокового зберігання штамів мікроорганізмів роду Clostridium / Л.І. Акименко, Д.О. Котляр, Н.С. Палійчук // Методи одержання чистих культур мікроорганізмів та їх довгострокового зберігання в колекціях. - Роботи співроб. Музею патогенних для людини мікроорганізмів. - Київ: Товариство "Знання" України. - Вип.2. - 2001. - С. 69-76). У період пізньої експоненціальної або ранньої стаціонарної фази вирощену біомасу мікроорганізмів в кількості 8 не менше 10 КУО/мл змивають, суспендують у середовищі, що містить кріопротектори, розливають в ампули, які закривають ватними пробками, заморожують клітини при температурі -65 °C і висушують за допомогою приладу ліофільної сушки. Недоліками цього способу збереження штамів є необхідність відпрацювання показників режиму висушування, визначення інгредієнтів стабілізуючого середовища та постійного технологічного обслуговування упродовж всього процесу висушування. Ліофілізація часто викликає порушення репаративних процесів бактерій, що призводить до зміни форми клітин, зморщування бактеріальної оболонки та лізису бактерій. Крім цього, ліофілізація не завжди може бути використана у зв'язку з відсутністю спеціального обладнання в мікробіологічних лабораторіях лікувально-профілактичних закладів та науково-дослідних установ. Метод сорбційно-контактного зневоднення (Пінчук Н.Г. Розробка технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення // Автореферат на здоб. наук. ступ. канд. вет.наук: 16.00.03. - Нац. наук. центр "Ін-т експерим. і клініч. вет. медицини". – Харків. - 2008. - 20 с.) включає приготування сорбційно-дисперсійного модуля, до складу якого входять: наповнювач-зневоднювач біомаси - гранульована іонообмінна смола марки КБ-4П-2, дезагрегант-диспергатор біомаси - гідрофобний аеросил марки AM-1-300 і посередник-зневоднювач - лактоза. Зазначені компоненти змішують у лабораторному кульовому барабані та додають суміш агарового змиву культури із захисним стабілізуючим сахарозо-желатиновим середовищем. Отриману суху біомасу відділяють від шарів барабану, витримують 5 годин при температурі 4-6 °C і знову інтенсивно перемішують. Оптимально підібране співвідношення адсорбенту та адсорбтиву за рахунок повного перерозподілу вологи від біомаси на наповнювач забезпечує високу стійкість отриманого препарату, який зберігають при температурі (4±2)°С (Пінчук Н.Г. Розробка технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення // Автореферат на здоб. наук. ступ. канд. вет. наук: 16.00.03. - Нац. наук. центр "Ін-т експерим. і клініч. вет. медицини". – Харків. 2008. - 20 с.). Застосування зазначеної технології забезпечує в незначній мірі вищий рівень збереження життєздатності бактерій в контактно зневоднених зразках порівняно з кількістю життєздатних мікробних клітин після ліофільного висушування. Недоліком вище вказаного способу є те, що для кожного таксономічного виду бактерій необхідно здійснювати індивідуальний підбір співвідношення адсорбенту з адсорбтивом та інгредієнтів стабілізуючого середовища. Відомий спосіб тривалого зберігання (більше 15 років) штамів роду Clostridium в замороженому стані при температурі рідкого азоту -196 °C у добре ізольованих резервуарах з використанням кріопротекторів: сахарози, лактози, глюкози, гліцерину, диметилсульфоксиду (Методы общей бактериологии // Под ред. Ф. Герхардта и др. - М.: Мир. - Т. 1. - 1983. - С. 517533). Спосіб включає приготування стабілізуючого середовища, в який вносять вище вказані кріопротектори. Клітини вирощеної рідкої культури анаеробних мікроорганізмів відокремлюють у стерильних умовах центрифугуванням, ресуспендують осад у стерильному середовищі, що містить кріопротектор, розливають у стерильні марковані ампули або епендорфи. Зразки заморожують зануренням у рідкий азот. Відновлення життєздатності проводять шляхом швидкого відігрівання на водяній бані при температурі 37 °C. Спосіб простий і перспективний, проте не для всіх регіональних мікробіологічних лабораторій доступний через високу вартість рідкого азоту та можливе періодичне припинення електропостачання. Відомий спосіб тривалого зберігання живої тканини, індивідуальних клітин (клітин Лангерганса, гепатоцитів, еритроцитів, ферментів та ін.), автора Франкліна Ліма (United States Patent № 4,352,883 Encapsulation of biological material // Franklin Lim, Richmond, Va. / C12N11/10; C12N11/04; C12N5/00. - Oct. 5, 1982), який полягає в інкапсуляції біологічного матеріалу з 1 UA 104445 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 утворенням напівпроникної мембрани і здійснюється шляхом суспендування останнього в розчині альгінату натрію, який характеризується стабілізуючими та желеподібними властивостями. При внесенні зазначеної суспензії у розчин хлориду кальцію (ініціатор полімеризації) утворюються желеподібні краплі-капсули, що містять біоматеріал. Спосіб доступний, проте приклади застосування даної методики описані тільки для деяких видів біологічного матеріалу без зазначення оптимального терміну тривалого зберігання. Недоліком використання як ініціатора полімеризації хлориду кальцію є те, що він є дуже їдким та призводить до осмотичного лізису бактеріальних клітин. В основу корисної моделі поставлено задачу створення технології способу зберігання анаеробних бактерій, в якому за рахунок застосування нових дій та нових речовин забезпечується збереження вихідних характеристик анаеробних бактерій, висока життєздатність цих культур, створюються найбільш оптимальні умови, наближені до фізіологічних, для підтримання життєдіяльності мікробних клітин. Спосіб зберігання анаеробних бактерій включає інокуляцію культури анаеробних бактерій у стерильний розчин альгінату натрію. Наступним етапом є внесення мікробної зависі у ініціатор полімеризації, що супроводжується утворенням желеподібних капсульних крапель, до складу яких входять мікроорганізми певного виду. Новим у способі є те, що як ініціатор полімеризації застосовують стерильний розчин лактату кальцію, отримані інкапсульовані зразки анаеробних культур зберігають у стерильних епендорфах при -70 °C. Застосування нових дій та нових речовин забезпечують збереження вихідних характеристик анаеробних бактерій, що має важливе практичне значення у процесі виготовлення імунобіологічних препаратів та є надзвичайно актуальною при підтриманні колекційних зразків культур у депозитаріях. Забезпечення високої життєздатності цих культур свідчить про перспективність застосування у мікробіологічних лабораторіях методики виготовлення інкапсульованих зразків музейних штамів мікроорганізмів для їх тривалого зберігання. Лактат кальцію до цього часу застосовувався як джерело живлення для дріжджів в хлібобулочних виробах, як отверджувач для фруктів (у консервах), а також як замінник кухарської солі, синергіст антиоксидантів. Використання лактату кальцію (кальцієва сіль молочної кислоти), у новій технології та за новим призначенням, запропоновано як донор кальцію, синергіст антиоксидантів, загущувач і фактор живлення для мікроорганізмів та як агент, що утримує вологу. Хлорид кальцію (СаСl2) і лактат кальцію (Са(С3Н5О3)·5Н2О), як і всі інші солі кальцію, - ініціатори полімеризації. При додаванні альгінату натрію з мікроорганізмами до лактату кальцію - альгінат натрію зв'язує іони кальцію, відбувається полімеризація біоматеріалу, утворюється нова сполука, що має желеподібні властивості. Дані експериментальних досліджень свідчать, що використання лактату кальцію замість хлориду кальцію більш доцільне, оскільки при цьому створюються найбільш оптимальні умови, наближені до фізіологічних, для підтримання життєдіяльності як мікробних клітин, так і взагалі будь-яких індивідуальних клітин (еритроцити, лімфоцити) макроорганізму (людини). Хлорид кальцію-сіль більш їдкої (агресивної) кислоти. Лактат кальцію є більш "м'якою" кращою сполукою як фактор живлення для мікроорганізмів. Приклад здійснення способу. Виготовлено зразки музейних штамів різних видів анаеробних мікроорганізмів, що мають промислове та діагностичне значення: Clostridium acetobutylicum 524, С. acetobutylicum 780, C. perfringens 27, С. novyi 198, C. sporogenes 275. Дослід проводили у кілька етапів у стерильних умовах. Для роботи підготовлено стерильний посуд, флакони, разові стерильні шприци, голки. На початковому етапі вирощували культури вище зазначених видів мікроорганізмів у флаконах з тіогліколевим середовищем (виробництва bioMerieux, Франція), при 37 °C в анаеростаті протягом 2-3 діб. Для контролю чистоти кожної культури паралельно проводили засів її на 2 чашки Петрі з кров'яним агаром, з яких одну клали в анаеростат, а одну інкубували при 37 °C в термостаті. Готували розчин альгінату натрію (2,0 г) шляхом розчинення останнього у тридистильованій воді (100,0 мл) на водяній бані. Наступний етап - приготування 0,1N розчину лактату кальцію (Са(С3Н5О3)·5Н2О). Останній в кількості 3,85 г розчиняли у 250,0 мл тридистильованої води. Обидва розчини стерилізували шляхом автоклавування при 121 °C 20 хвилин. В асептичних умовах культуру кожного виду анаеробних мікроорганізмів інокулювали у стерильний розчин альгінату натрію у співвідношенні 1:1 та з використанням стерильних голок для пункції вносили у флакони зі стерильним розчином лактату кальцію, що супроводжувалося полімеризацією бактерійного матеріалу та утворенням гелевих мікрокульок. В подальшому інкапсульовані культури було внесено у стерильні, попередньо марковані епендорфи та закладено для тривалого зберігання в температурних умовах -70 °C. Через 3, 6, 9, 12 та 15 2 UA 104445 U 5 10 15 місяців капсули культур розчиняли в 0,1 N розчині лимонної кислоти, який готували шляхом додавання 0,19 г кристалів лимонної кислоти до 1,0 л стерильної дистильованої води, та здійснювали засів у пробірки з тіогліколевим середовищем. В подальшому проводили пересів у напіврідкий 0,5 % цукровий поживний агар (ЦА) та висів на глюкозо-кров'яний агар Цейслера з наступною інкубацією в анаеростаті при 37 °C. Культури анаеробів досліджували за культуральними, морфологічними, тинкторіальними, біохімічними властивостями. При культивуванні вакцинних штамів мікроорганізмів роду Clostridium в більшості випадків стоїть завдання одержання не тільки біомаси, але і великої кількості активного продукту біосинтезу токсину, що гарантує повноцінну імунну відповідь. Для перевірки токсигенності штамів C. perfringens 27, С. novyi 198 проводили біологічну пробу шляхом підшкірного введення білим мишам добової культури зазначених штамів в дозі 0,2 мл. Визначення ефективності способу. Перевірка ростових властивостей експериментальних зразків музейних штамів анаеробних мікроорганізмів, що мають промислове та діагностичне значення, Clostridium acetobutylicum 524, С. acetobutylicum 780, C.perfringens 27, С. novyi 198, C.sporogenes 275 через З, 6, 9, 12 та 15 місяців, що зберігались в інкапсульованому виді при температурі -70° С показала високу життєздатність всіх досліджуваних штамів (таблиця). Таблиця Результати росту анаеробів на поживних середовищах Результати посіву на наявність анаеробів № п/п Штам Тіогліколеве середовище 0,5 % цукровий агар 1 ріст колонії у вигляді пушинок C. perfringens 27 ріст R-колонії у вигляді грудочок вати 4 С. novyi 198 ріст колонії у вигляді сочевиці 5 30 С. acetobutylicum 780 3 25 ріст колонії у вигляді пушинок 2 20 Clostridium acetobutylicum 524 C. sporogenes 275 ріст колонії у вигляді сочевиці Мікроскопія, забарвлення за Грамом Грампозитивні палички із субтермінальними спорами Грампозитивні палички із субтермінальними спорами Грампозитивні палички із центральними спорами Грампозитивні палички із субтермінальними спорами Грампозитивні палички із субтермінальними спорами Інтенсивний ріст культур анаеробів на тіогліколевому середовищі спостерігався вже на другу добу. Через 2-3 доби у стовпчиках 0,5 % цукрового поживного агару виростали ясно видимі візуально колонії мікробів-анаеробів у вигляді сочевиці та пушинок. На глюкозо-кров'яному агарі Цейслера виявлено характерні для кожного виду колонії, інколи оточені зоною гемолізу (С. novyi 198, C. perfringens 27). В мазках, забарвлених за Грамом, культури мали типові для штамів морфологію: грампозитивні палички із закругленими кінцями, розташовані поодинці, або в ланцюжках з 3-5 паличок, овальними спорами, розміщеними субтермінально або центрально (C. perfringens 27), капсул не утворюють. Біохімічні властивості штамів вивчали за здатністю ферментувати глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, маніт, саліцин. Підшкірне введення добових культур С. novyi 198 і C. perfringens 27 білим мишам в дозі 0,2 мл викликало загибель тварин через 20 годин. Отже, в результаті проведених етапів оживлення, пасажування зазначених штамів встановлено високу життєздатність цих культур, що свідчить про перспективність застосування 3 UA 104445 U 5 у мікробіологічних лабораторіях методики виготовлення інкапсульованих зразків музейних штамів мікроорганізмів для їх тривалого зберігання. Запропонована технологія довготривалого зберігання різних видів спороутворюючих анаеробних мікроорганізмів зі збереженням їх вихідних характеристик має важливе практичне значення у процесі виготовлення імунобіологічних препаратів, та є надзвичайно актуальною при підтриманні колекційних зразків культур у депозитаріях. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб тривалого зберігання анаеробних мікроорганізмів, що включає приготування стерильного розчину альгінату натрію, в який інокулюють культуру анаеробних бактерій, мікробну завись вносять у ініціатор полімеризації, який відрізняється тим, що як ініціатор полімеризації застосовують стерильний розчин лактату кальцію, отримані інкапсульовані зразки анаеробних культур зберігають у стерильних епендорфах при -70 °C. 15 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4