Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення

Реферат: Винахід належить до галузі медицини, зокрема клінічної імунології, акушерства і гінекології, та може бути використаний для прогнозування результату екстракорпорального запліднення (ЕКЗ), зокрема у жінок, які багаторазово мали негативний результат ЕКЗ. Спосіб за винаходом передбачає дослідження в венозній периферичній крові показників: цитотоксичності природних кілерів, активаційних маркерів на Т-лімфоцитах, Т-цитотоксичних лімфоцитах, Т-хелперах, природних кілерах, експресії CD158а та CD8 на природних кілерах (ПК), з наступним UA 101821 C2 (12) UA 101821 C2 визначенням їх відхилення у % від меж відповідних показників, отриманих при дослідженні жінок з успішним ЕКЗ. За сумою балів, що характеризують ступінь відхилення кожного із визначених показників, розраховують прогностичний індекс, підвищення якого понад 1 вказує на зменшення вірогідності успішності ЕКЗ. UA 101821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, зокрема клінічної імунології, акушерства і гінекології, може бути використаний для прогнозування результату екстракорпорального запліднення у жінок, зокрема у жінок, які багаторазово мали негативний результат екстракорпорального запліднення. Протягом досить тривалого часу були виявлені окремі імунологічні ознаки негативного результату екстракорпорального запліднення. В розробках різних авторів при багаторазових невдачах екстракорпорального запліднення були зареєстровані підвищення активації Тлімфоцитів периферичної крові у вигляді підсилення експресії на них активаційних маркерів CD69 та HLA-DR, а також підвищення рівня TNF- продукуючих Т-хелперів [Соulam С.В., Roussev R.G. Increasing circulating T-cell activation markers are linked to subsequent implantation failure after transfer of in vitro fertilized embrios // Am. J. Reprod. Immunol.- 2003.-50-P.340-345]. Підсилення домінанти Th1 типу імунної відповіді відображає системний внесок Th1 цитокінів при багаторазових невдачах екстракорпорального запліднення [Kwak-Kim J. Y.H., Chung-Bang H.S., Ng S.C, Ntrivalas E.I., Mangubat С.Р., Веаmаn K.D., Beer A.E., Gilman-Sachs A. Increased T helper 1 cytokine responses by circulating T cells are present in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with implantation failures after IVF // Human Reproduction-2003.-18-P.767-773]. Цитокіни, хемокіни та хемокінові рецептори, які асоційовані з Th1 і Th2 типами імунної відповіді, приймають участь у різних фізіологічних і патологічних процесах і в значній мірі відображають актуальний статус організму. Т-хелпери, які належать до Th1, селективно експресують хемокіновий рецептор CXCR3, тоді як Th2-хелпери селективно експресують другий хемокіновий рецептор CCR4 [Кіm С, Rott L., Kunkel E.J., Genovese M.C., Anrew D.P., Wu L., Butcher E.C. Rules of chemokine receptor association with T cell polarization in vivo // J. Clin. Invest.-2001.-108-13311339]. Раніше нами показано, що експресія CXCR3 та CCR4 на Т-лімфоцитах хелперах відображає активність внутрішньоклітинних цитокінів - інтерферону-гамма (Th1) та інтерлейкіну 4 (Th2) при вагітності [Чернышев В.П., Туманова Л.Е., Судома И.А., Банников В.И. Особенности иммунной регуляции при беременности с аллогенным плодом // Журн. АМН України, 2008, т. 14, № 3. - с. 541-549; Chernyshov V.P., Tumanova L.E., Sudoma I.A., Bannikov V.I. Th1 and Th2 in Human IVF Pregnancy with Allogenic Fetus // Am. J. Reprod. Immunol. -2008.-59-P.352-358]. Особливу увагу у проблемі невдач екстракорпорального запліднення приділяється ролі природних кілерів [Coulam C.B., Roussev R.G. Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytotoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embrio transfer // J. Assist. Reprod.Genet.-2003.-20-P.58-62]. Рецептори природних кілерів контролюють активність природних кілерів шляхом балансу сігналінга між активуючими і інгібуючими рецепторами, так званими KIR рецепторами. Цей баланс порушується при відторгненні плоду організмом матері, спонтанних абортах та неплідді [Ntrivals E.I., Bowser C.R., Kwak-Kim J., Beaman K.D., Gilman-Sachs A.: Expression of killer immunoglobulinlike receptors on peripheral blood NK cell subsets of women with recurrent spontaneous abortions or implantation failures // Am. J. Reprod. Immunol. -2005.-53-P.215-221]. Підвищення цитотоксичності природних кілерів є незалежним фактором ризику при неплідді і не асоціюється з віком, тривалістю непліддя, депресією, лікуванням гіперпролактинемії або ендометріозу [Matsubayashi К, Hosaka Т., Sugiyama Y., Suzuki Т., Arai Т., Kondo A., Sugi Т., Izumi S…, Makino T. Increased natural killer-cell activity is associated with infertile women // Am. J. Reprod. Immunol.-2001.-46-P. 318-322]. Надлишок продукції інтерферону-гамма (IFN-) природними кілерами периферичної крові відмічено у невагітних жінок зі спонтанними абортами та невдачами екстракорпорального запліднення [Fukui F., Kwak-Kim J., Ntrivalas E., Gilman-Sachs A., Lee S.K., Beaman K. Intracellular cytokine expression of peripheral blood natural killer cell subsets in women with recurrent spontaneous abortions and implantation failures // Fertility and Sterility-2008. -89-P.157-165]. Серед KIR рецепторів CD158a є найбільш адекватним для оцінки стану природних кілерів, так як його експресія не асоціюється з індивідуальним HLA фенотипом. Тобто, знайдено кілька факторів, включаючи активність природних кілерів і активацію Т-лімфоцитів, які асоціюються з ЕКЗ невдачами. Однак для окремої пацієнтки, у котрої можуть бути різні варіанти порушень, а також значення комплексу порушень у конкретному випадку ще не є сформульованими і доведеними до практичного використання. Відомий спосіб прогнозування результатів лікування непліддя методом екстракорпорального запліднення [RU 2357673 С1, 01.10.2007, Потехина Ю.П., Щербатюк Т.Г., Хрулева Н.В. "Способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения"], при якому проводять трансвагінальну пункцію фолікулів під контролем УЗД з наступним дослідженням отриманої фолікулярної рідини. При цьому фолікулярна рідина підлягала хемілюмінесцентному аналізу для оцінки вільнорадикальної активності і по показниках загальної антиоксидантної активності дають 1 UA 101821 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 прогноз наставання вагітності. При показниках загальної антиоксидантної активності 0,05 та вище дають несприятливий прогноз, при показниках загальної антиоксидантної активності нижче 0,05 дають сприятливий прогноз - імовірність наставання вагітності більше 50 %. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється, є спосіб прогнозування результатів екстракорпорального запліднення у пацієнток з аутоімунними захворюваннями [RU 2345715 С2, 10.05.2008, Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Способ прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток с аутоиммунными заболеваниями]. У пацієнтки встановлюють присутність в анамнезі аднекситу, присутність в периферичній крові HLAантигенів В18, Cw3, Cw4 та кількість тромбоцитів у коагулограмі. Підраховують прогностичний індекс F по формулі: F=1,4X1-1,3X2-2,4X3-2,1X4+0,019X5-2,5; де X1 - наявність (або відсутність) у фенотипі жінки HLA-антигену В18 (1 чи 0); Х2 - наявність (або відсутність) у фенотипі жінки HLA-антигену Cw3 (1 або 0); Х3 - наявність (або відсутність) у фенотипі жінки HLA-антигену Cw4 (1 або 0); Х4 - наявність (або відсутність) в анамнезі аднекситу (1 або); Х5 9 кількість тромбоцитів у коагулограмі (10 /л). Якщо F більше 0, прогнозують вдалий наслідок проведення ЕКЗ та переносу ембріону; при значеннях F менше 0, прогнозують невдалий випадок ЕКЗ і не рекомендують проведення ЕКЗ на даному етапі у зв'язку з передбаченою відсутністю позитивного результату ЕКЗ. Недоліком способу є те, що даний спосіб можна використовувати тільки у пацієнток з виразними аутоімунними захворюваннями, які складають дуже невеличку групу серед пацієнток, які потребують ЕКЗ. Основна більшість пацієнток, які потребують ЕКЗ, не мають виразних ознак аутоімунних захворювань. Крім того даний спосіб не враховує суттєвих імунологічних змін, які притаманні жінкам з багаторазовими невдачами ЕКЗ - це і підвищення експресії активаційних маркерів на Т-лімфоцитах, підвищення експресії KIR рецепторів на природних кілерах та їх цитотоксичності тощо. Тобто не враховує актуальний імунний статус пацієнтки. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу створення способу прогнозування результату екстракорпорального запліднення, в якому враховано основні імунологічні порушення, які притаманні жінкам з багаторазовими невдачами ЕКЗ, тобто жінкам, які найбільш потребують цього прогнозування. Поставлена задача способу прогнозування результату екстракорпорального запліднення вирішується шляхом дослідження венозної крові, згідно з винаходом в венозній периферичній крові досліджують показники цитотоксичності природних кілерів, активаційних маркерів на Тлімфоцитах, Т-цитотоксичних лімфоцитах, Т-хелперах, природних кілерах, експресії CD158а та CD8 на природних кілерах (ПК), визначають їх відхилення у % від меж відповідних показників, отриманих при дослідженні жінок з успішним ЕКЗ, які формують в інтервалі з перцентилями Р5Р95 (90 % даних), з наступною оцінкою відхилень показників в балах від 0 до 2, а саме відхилення, що становить: HLA DR+CD3+ > 13 %; CD158a+CD3+ > 5 %; CD4+CD3+ 24 %; CD56+CD3+ 15 %; CD3-CD56+ (ПК) >19 %; HLA DR+CD56+CD3- > 20 %; CD158a+CD56+CD3- > 56 %; CD8+CD56+CD3- > 67 %; ПК лізис 1:10 > 30 % або ПК лізис 1:20 > 40 %, оцінюють як 1 бал, якщо відхилення становить: HLA DR+CD3+ > 16 %; HLA DR+CD8+CD3+ > 28 %; CD3-CD56+ (ПК) > 21 % або CD158a+CD56+CD3- > 65 %, його оцінюють як 2 бали, далі за сумою балів, що характеризують відхилення кожного із вказаних показників, визначають прогностичний індекс, підвищення якого понад 1 вказує на зменшення вірогідності успішності ЕКЗ. Причинно-наслідковий зв'язок полягає в тому, що з підсиленням відхилень показників від меж відповідних показників, отриманих при дослідженні жінок з успішним ЕКЗ, збільшується імовірність ЕКЗ невдачі, тому показники, зміни по яких оцінюються як 1 бал, є наступні: HLA DR+CD3+>13 %; CD158a+CD3+>5 %; CD4+CD3+ 24 %; CD56+CD3+15 %; CD3-CD56+ (природні кілери) >19 %; HLA DR+CD56+CD3->20 %; CD158a+CD56+CD3->56 %; CD8+CD56+CD3->67 %; ПК лізис 1:10 >30 %; ПК лізис 1:20>40 %, а показники, зміни по яких оцінюються як 2 бали: HLA DR+CD3+>16 %; HLA DR+CD8+CD3+>28 %; CD3-CD56+ (ПК) >21 %; CD158a+CD56+CD3->65 %, далі за сумою балів, що характеризують відхилення кожного із вказаних показників, визначають прогностичний індекс, підвищення якого понад 1 вказує на зменшення вірогідності успішності ЕКЗ. Для клінічного опробування способу в ДУ "Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України" було проведено подвійне сліпе дослідження на 88 пацієнтках у трьох ЕКЗ клініках міста Києва. 60 2 UA 101821 C2 Таблиця 1 Процент успіху екстракорпорального запліднення в залежності від прогностичного індексу № п/п 1 2 3 4 5 5 10 15 20 25 30 35 40 Число пацієнток 24 20 15 12 17 Прогностичний індекс 0-1 2 3 4-5 >5 % вагітності 58,3 % 55 % 40 % 33 % 11,7 % Проведені дослідження показали, що з підвищенням прогностичного індексу знижується процент успіху екстракорпорального запліднення. Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення виконується наступним чином: Зразки периферичної крові пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ отримують на 17-23 дні менструального циклу перед стимуляцією гонадотропіном в ЕКЗ процедурі. Субпопуляції лімфоцитів вивчають за допомогою трикольорової проточної цитометрії в цільній крові і після обробки моноклональними антитілами, які кон'юговані з флуорохромами FITC, РЕ, РЕ-Су5, еритроцити підлягають лізису за допомогою лізуючого розчину фірми BD Biosciences, США. Використовують наступні комбінації моноклональних антитіл (BD Biosciences): CD3/CD4/CD8, HLA DR/CD56/CD3, CD8/CD56/CD3, CD158a/CD56/CD3, HLA DR/CD8/CD3, HLA DR/CD4/CD3. Зразки аналізують за допомогою проточного цитометру FACScan (BD Biosciences). Для підрахування та відокремлення лімфоцитів від гранулоцитів, моноцитів та побічних частинок зразки цільної крові інкубують з моноклональними антитілами набору LeucoGATE (CD45-FITC /CD14-PE, BD Biosciences). Для контролю використовують IgG1FITC+IgG2-PE тієї ж фірми. Цитотоксичність природних кілерів (ПКц) оцінюють за допомогою лантаноїдного цитотоксичного тесту [Blomberg К, Granberg С, Hemmila I, Lovren T: Europium-labeled target cells in assay of natural killer cell activity. I. A novel non-radioactive method based on time-resolved 6 fluorescence. J Immunol Meth 1986, 86:225-229]. 210 лімфоцитів, виділяють з периферичної крові пацієнток за допомогою градієнту Hystopaque 1077 (Sigma-Aldrich, Німеччина) в середовищі RPMI. Клітини-мішені К-562 в середовищі RPMI 1640 з добавленням 10 % бичачої 6 сироватки у концентрації 110 клітин/мл мітять за допомогою 5 BATDA реагенту (DELFIA BATDA Reagent (bis (acetooxymethyl) 2,2':6',2"-terpyridine-6,6"-dicarboxylate), Perkin Elmer Wallac, Німеччина) протягом 20 хв. при 37 °C. Мічені клітини відмивають три рази в RPMI з 10 % бичачої сироватки. Цитотоксичну активність природних кілерів оцінюють у 4-годинному тесті з 4 вивільненням TDA (гідрофільний ліганд), в якому ефекторні клітини змішують з 110 клітинмішеней, мічених BATDA та відмитих. Співвідношення ефекторних клітин та клітин-мішеней є 20:1 і 10:1 в загальному об'ємі 200 мкл. Після інкубації ефекторних клітин та клітин-мішеней 4 години при 37 °C в СО2-інкубаторі з насиченням 5 % СО2 клітини перемішують, центрифугують і 20 мкл супернатанту змішують з 180 мкл розчину європію (Perkin Elmer Wallac, Німеччина), інкубують в 96-ямковому планшеті (Nunc, Roskide, Данія) 15 хв. при кімнатній температурі на шейкері. Флуорометрію проводять на приборі ARCUS (Wallac Oy, Turku, Finland). Процент специфічного лізису розраховують як співвідношення (вивільнення в досліді - спонтанне вивільнення)/(максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення) 100 %. Максимальне вивільнення визначають додаванням тритону X100 в кінцевої концентрації 0,25 %. Методику ставлять в триплеті. Реєстрація цитолітичної активності природних кілерів за допомогою проточної цитометрії [Piriou L., Chilmonczyk S, Genetet N, Albina E Design of flow cytometric assay for the determination of natural killer and cytotoxic T-lymphocyte activity in human and in different animal species // Cytometry 2000; 41:289-297] виявляє аналогічні результати. Клінічні приклади. Приклади підрахунку прогностичного індексу у пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ наведено у таблиці 2. 3 UA 101821 C2 Таблиця 2 Підрахунок прогностичного індексу (ПІ) у пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ Бали Пацієнтка П. після корекції 7.12.2009 Бали 27,3 2 7,85 0 0 0 0,48 38,5 0 1 0,81 45,8 0 0 33 2 43,2 2 7,7 0 6 7,6 0 0 6 14,5 0 1 3,5 7,58 1 0 13 0 15,9 0 9,7 0 11 0 33,9 1 3,7 0 13 0 26,1 0 26,8 0 41 45 60 0 46,6 37 55 0 59,3 28 39 0 Бали Пацієнтка П., 20.10.2009 17,3 2 1,65 45,5 CD158a+CD56+CD3 >5 % 24 % >28 % 15 % >19 % >21 % >20 % >56 % >65 % CD8+CD56+CD3ПК лізис 1:10 ПК лізис 1:20 ПІ >67 % >30 % >40 % >1 Параметри HLA DR+CD3+ CD158a+CD3+ CD4+CD3+ HLADR+CD8+CD3+ CD56+CD3+ HLA DR+CD4+CD3+ CD3-CD56+ HLADR+CD56+CD3 5 10 15 Негативні значення >13 % >16 % Пацієнтка Л., 20.10.2009 2 6 1 8 0 1 Приклад 1 Пацієнтка Л. 35 років. Трубний фактор непліддя. В анамнезі 3 невдалі ЕКЗ процедури. Результати імунологічного дослідження наведено в таблиці 2. Прогностичний індекс 6. В результаті ЕКЗ циклу була невдача. Приклад 2 Пацієнтка П., 34 роки. Непліддя нез'ясованого походження. В анамнезі чотири невдачі в ЕКЗ циклі. Результати двох імунологічних обстежень пацієнтки наведено в таблиці 2. При першому обстеженні прогностичний індекс був 8 і результат в ЕКЗ циклі - чергова невдача. При другому обстеженні після лікування прогностичний індекс був 1 і клінічний результат - успішна вагітність. Таким чином, вищевикладені дані свідчать про застосування даного способу з найбільшою серед існуючих способів об'єктивністю, що може використовуватися для клінічного обстеження пацієнток з багаторазовими невдачами екстракорпорального запліднення з метою прогнозування результату екстракорпорального запліднення, що значно підвищує ефективність такої медичної допомоги як екстракорпоральне запліднення. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення (ЕКЗ) шляхом імунологічного дослідження венозної периферичної крові, який відрізняється тим, що досліджують показники цитотоксичності природних кілерів, активаційних маркерів на Тлімфоцитах, Т-цитотоксичних лімфоцитах, Т-хелперах, природних кілерах, експресії CD158а та CD8 на природних кілерах (ПК), визначають їх відхилення у % від меж відповідних показників, отриманих при дослідженні жінок з успішним ЕКЗ, які формують в інтервалі з перцентилями Р5Р95 (90 % даних), з наступною оцінкою відхилень показників в балах від 0 до 2, а саме відхилення, що становить: HLA DR+CD3+ > 13 %; CD158a+CD3+ > 5 %; CD4+CD3+ 24 %; CD56+CD3+ 15 %; CD3-CD56+ (ПК) >19 %; HLA DR+CD56+CD3- > 20 %; CD158a+CD56+CD3- > 56 %; CD8+CD56+CD3- > 67 %; ПК лізис 1:10 > 30 % або ПК лізис 1:20 > 40 %, оцінюють як 1 бал, якщо відхилення становить: HLA DR+CD3+ > 16 %; HLA DR+CD8+CD3+ > 28 %; CD3-CD56+ (ПК) > 21 % або CD158a+CD56+CD3- > 65 %, його оцінюють як 2 бали, далі за сумою балів, що характеризують відхилення кожного із 4 UA 101821 C2 вказаних показників, визначають прогностичний індекс, підвищення якого понад 1 вказує на зменшення вірогідності успішності ЕКЗ. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5