Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення

Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення (ЕКЗ) шляхом імунологічного дослідження венозної периферичної крові, який відрізняється тим, що в венозній периферичній крові досліджують показники цитотоксичності природних кілерів, активаційні маркери на Т лім 3 among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embrio transfer // J. Assist. Reprod.Genet. - 2003. 20 - P.58-62.]. Рецептори природних кілерів контролюють активність природних кілерів шляхом балансу сігналінга між активуючими і інгібуючими рецепторами, так званими KIR рецепторами. Цей баланс порушується при відторгненні плоду організмом матері, спонтанних абортах та неплідді [Ntrivals E.I., Bowser C.R., Kwak-Kim J., Beaman K.D., Gilman-Sachs A.: Expression of killer immunoglobu-lin-like receptors on peripheral blood NK cell subsets of women with recurrent spontaneous abortions or implantation failures // Am. J. Reprod. Immunol. - 2005. - 53 - P.215-221.] Підвищення цитотоксичності природних кілерів є незалежним фактором ризику при неплідді і не асоціюється з віком, тривалістю непліддя, депресією, лікуванням гіперпролактинемії або ендометріозу [Matsubayashi H., Hosaka Т., Sugiyama Y., Suzuki Т., Arai Т., Kondo A., Sugi Т., Izumi S.., Makino T. Increased natural killer-cell activity is associated with infertile women//Am. J. Reprod. Immunol. - 2001.- 46 -P.318-322.]. Надлишок продукції інтерферонугамма (IFN- ) природними кілерами периферичної крові відмічено у невагітних жінок зі спонтанними абортами та невдачами екстракорпорального запліднення [Fukui F., Kwak-Kim J., Ntrivalas E., Gilman-Sachs A., Lee S.K., Beaman K. Intracellular cytokine expression of peripheral blood natural killer cell subsets in women with recurrent spontaneous abortions and implantation failures // Fertility and Sterility - 2008.- 89- P.157-165.]. Серед KIR рецепторів CD158a є найбільш адекватним для оцінки стану природних кілерів, так як його експресія не асоціюється з індивідуальним HLA фенотипом. Тобто, знайдено кілька факторів, включаючи активність природних кілерів і активацію Т лімфоцитів, які асоціюються з ЕКЗ невдачами. Однак для окремої пацієнтки, у котрої можуть бути різні варіанти порушень, а також значення комплексу порушень у конкретному випадку ще не є сформульованими і доведеними до практичного використання. Відомий спосіб прогнозування результатів лікування непліддя методом екстракорпорального запліднення [RU 2357673 С1, 01.10.2007, Потехина Ю.П., Щербатюк Т.Г., Хрулева Н.В. «Способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения»], при якому проводять трансвагінальну пункцію фолікулів під контролем УЗД з наступним дослідженням отриманої фолікулярної рідини. При цьому фолікулярна рідина підлягала хемілюмінесцентному аналізу для оцінки вільно- радикальної активності і по показникам загальної антиоксидантної активності дають прогноз наставання вагітності. При показниках загальної антиоксидантної активності 0,05 та вище дають несприятливий прогноз, при показниках загальної антиоксидантної активності нижче 0,05 дають сприятливий прогноз - імовірність наставання вагітності більше 50%. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється є спосіб прогнозування результатів екстракорпорального запліднення у пацієнток з аутоімунни 54560 4 ми захворюваннями [RU 2345715 С2, 10.05.2008, Федеральное государственное учреждение «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Способ прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток с аутоиммунными заболеваниями]. У пацієнтки встановлюють присутність в анамнезі аднексита, присутність в периферичній крові HLAантигенів В18, Cw3, Cw4 та кількість тромбоцитів у коагулограмі. Підраховують прогностичний індекс F по формулі: F=1,4 X1-1,3 X2-2,4 X3-2,1 X4+0,019 X5-2,5; де X1 - наявність (або відсутність ) у фенотипі жінки HLA-антигену В18 (1 чи 0); Х2 - наявність (або відсутність ) у фенотипі жінки HLA-антигену Cw3 (1 або 0); Х3 - наявність (або відсутність ) у фенотипі жінки HLA-антигену Cw4 (1 або 0); Х4- наявність (або відсутність ) в анамнезі аднексита (1 або ); Х5 - кількість тромбоцитів у коагулограмі (109/л). Якщо F більше 0, прогнозують вдалий наслідок проведення ЕКЗ та переносу ембріону; при значеннях F менше 0, прогнозують невдалий випадок ЕКЗ і не рекомендують проведення ЕКЗ на даному етапі у зв'язку з передбаченою відсутністю позитивного результату ЕКЗ. Недоліком способу є те, що даний спосіб можна використовувати тільки у пацієнток з виразними аутоімунними захворюваннями, які складають дуже невеличку групу серед пацієнток, які потребують ЕКЗ. Основна більшість пацієнток, які потребують ЕКЗ, не мають виразних ознак аутоімунних захворювань. Крім того даний спосіб не враховує суттєвих імунологічних змін, які притаманні жінкам з багаторазовими невдачами ЕКЗ - це і підвищення експресії активаційних маркерів на Т лімфоцитах, підвищення експресії KIR рецепторів на природних кілерах та іх цитотоксичності тощо. Тобто не враховує актуальний імунний статус пацієнтки. В основу корисної моделі, що заявляється покладено задачу створення способу прогнозування результату екстракорпорального запліднення, в якому враховано основні імунологічні порушення, які притаманні жінкам з багаторазовими невдачами ЕКЗ, тобто жінкам які найбільш потребують цього прогнозування. Поставлене завдання способу прогнозування результату екстракорпо-рального запліднення вирішується шляхом дослідження венозної крові, згідно корисної моделі, в венозній периферичній крові досліджуються показники цито-токсичності природних кілерів, активаційні маркери на Т лімфоцитах, Т цитотоксичних лімфоцитах, Т хелперах, природних кілерах, експресія KIR (CD 158а) та CD8 на природних кілерах і реєструється в балах відхилення їх рівня від «меж ЕКЗ фертильності», які формуються в межах з персентілями Р5-Р95 (90% данних), отриманих при дослідженні жінок з успішним екстра-корпоральним заплідненням, при цьому відхілення кожного показника за «межи ЕКЗ фертильності» оцінюється в балах, притаманних окремим показникам, сума балів окремої пацієнтки виражається як прогностичний індекс; з підвищенням прогностичного індексу більше 1,5 бали вірогідність ЕКЗ успіху зменшується. 5 54560 Причино-наслідковий зв'язок полягає в тому, що з підсиленням показників, які виходять за «межи ЕКЗ фертильності» збільшується імовірність ЕКЗ невдачі, тому показники, зміни по яким оцінюються як 1 бал є наступні: HLA DR + CD3+ 13%; CD158a+CD3+ 5%; CD4+ 40%; HLA DR+CD8+CD3+ 24%; CD56+CD3+ 4%; HLA DR+CD4+ 15%; CD3-CD56+ (природні кілери) 19%; HLA DR+CD56+CD3- 20%; CD158a+CD56+CD3- 56%; CD8+CD56+CD3- 67%; 6 ПК лізіс 1:10 30%; ПК лізіс 1:20 40%, а показники, зміни по яким оцінюються як 2 бали є більші: HLA DR+CD3+ 16%; HLA DR+ CD8+CD3+ 28%; CD3CD56+ (ПК) 21%; CD158a+CD56+CD3- 65%. Для клінічного опробування способу в ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України» було проведено подвійне сліпе дослідження на 88 пацієнтках у трьох ЕКЗ клініках міста Києва. Таблиця 1 Процент успіху екстракорпорального запліднення в залежності від прогностичного індексу № п/п 1 2 3 4 5 Число пацієнток 24 20 15 12 17 Прогностичний індекс 0-1 1,1-2 2,1-3 3,1-5 5,1 Проведені дослідження показали, що з підвищенням прогностичного індексу знижується процент успіху екстракорпорального запліднення. Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення виконується наступним чином: Зразки периферичної крові пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ отримують на 17-23 дні менструального циклу перед стимуляцією гонадотропіном в ЕКЗ процедурі. Субпопуляції лімфоцитів вивчають за допомогою трикольорової проточної цитометрії в цільній крові і після обробки моноклональними антитілами, які коньюговані з флуорохромами FITC, РЕ, РЕ-Су5, еритроцити підлягають лізису за допомогою лизуючого розчину фірми BD Biosciences, США. Використовують наступні комбінації моноклональних антитіл (BD Biosciences): CD3/CD4/CD8, HLA DR/CD56/CD3, CD8/CD56/CD3, CD158a/CD56/CD3, HLA DR/CD8/CD3, HLA DR/CD4/CD3. Зразки аналізують за допомогою проточного цитометру FACScan (BD Biosciences). Для підрахування та відокремлення лімфоцитів від гранулоцитів, моноцитів та побічних частинок зразки цільної крові инкубують з моноклональними антитілами набору LeucoGATE (CD45-FITC /CD14PE, BD Biosciences). Для контролю використовують IgGl-FITC + IgG2-PE тієї ж фірми. Цитотоксичність природних кілерів (ПКц) оцінюють за допомогою лантаноїдного цитотоксичного тесту [Blomberg К, Granberg С, Hemmila I, Lovren T: Europium-labeled target cells in assay of natural killer cell activity. I. A novel non-radioactive method based on time-resolved fluorescence. JImmunol Meth 1986, 86:225-229]. 2 106 лімфоцитів, виділяють з периферичної крові пацієнток за допомогою градиенту Hystopaque 1077 (SigmaAldrich, Німеччина) в середовищі RPMI. Клітинимішені К-562 в середовищі RPMI 1640 с добавленням 10% бичачої сироватки у концентрації 1 106 % вагітності 58,3% 55% 40% 33% 11,7% клітин/мл мітять за допомогою 5 l BATDA реагента (DELFIA BATDA Reagent ( bis (acetooxyme-thyl) 2,2':6',2" -terpyridine-6,6" -dicarboxylate), Perkin Elmer Wallac, Німеччина) протягом 20хв. при 37 С. Мічені клітини відмивають три рази в RPMI с 10% бичачої сироватки. Цитотоксична активність природних кілерів оцінюють у 4 годинному тесті з вивільненням TDA (гідрофільний ліганд), в якому 4 ефекторні клітини змішують з 1 10 клітинмішеней, мічених BATDA та відмитих. Співвідношення ефекторних клітин та клітин мішеней є 20:1 и 10:1 в загальному обьємі 200мкл. Після інкубації ефекторних клітин та клітин мішеней 4 години при 37 С в СО2-інкубаторі с насиченням 5% СО2 клітини перемішують, центрифугують і 20мкл супернатанта змішують з 180мкл розчину європія (Perkin Elmer Wallac, Німеччина), інкубують в 96-ямковому планшеті (Nunc, Roskide, Дания) 15хв. при кімнатній температурі на шейкері. Флуорометрію проводять на приборі ARCUS (Wallac Oy, Turku, Finland). Процент специфічного лізису розраховують як співвідношення (вивільнення в досліді - спонтанне вивільнення)/(максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення) 100%. Максимальне вивільнення визначають додаванням тритону X100 в кінцевої концентрації 0,25%. Методику ставлять в триплеті. Регістрація цитолітичної активності природних кілєрів за допомогою проточної цитометрії [Piriou L, Chilmonczyk S, Genetet N, Albina E Design of flow cytometric assay for the determination of natural killer and cytotoxic T-lymphocyte activity in human and in different animal species//Cytometry 2000; 41:289-297.] виявляє аналогічні результати. Клінічні приклади. Приклади підрахунку прогностичного індексу у пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ наведено у таблиці 2. 7 54560 8 Таблиця 2 Підрахунок прогностичного індексу (ПІ) у пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ. Параметри HLA DR+ CD3+ CD158a+CD3+ CD4+ CD3+ HLADR+CD8+CD3+ CD56+CD3+ HLA DR+CD4+CD3+ CD3-CD56+ HLADR+CD56+CD3CD158a+CD56+CD3CD8+CD56+CD3ПК лізіс 1:10 ПК лізіс 1:20 ПІ Негативні Пацієнтка Л., Пацієнтка П., Ба ли значення 20.10.2009 20.10.2009 13% 16 5% 40% 24% 28% 4% 15% 19% 21% 20% 56% 65% 67% 30% 40% 1,5 Пацієнтка П. після корекції 7.12.2009 Бали 17,3 2 27,3 2 7,85 0 1,65 45,5 0 0 0,48 38,5 0 1 0,81 45,8 0 0 33 2 43,2 2 7,7 0 6 7,6 0 0 6 14,5 0 1 3,5 7,58 1 0 13 0 15,9 0 9,7 0 11 0 33,9 1 3,7 0 13 0 26,1 0 26,8 0 41 45 60 0 46,6 37 55 0 59,3 28 39 0 Приклад 1. Пацієнтка Л. 35 років. Трубний фактор непліддя. В анамнезі 3 невдачних ЕКЗ процедури. Результати імунологічного дослідження наведено таблиці 2. Прогностичний індекс 6. В результаті ЕКЗ циклу була невдача. Приклад 2. Пацієнтка П., 34 роки. Непліддя нез'ясованого походження. В анамнезі чотири невдачі в ЕКЗ циклі. Результати двох імунологічних обстежень пацієнтки наведено в таблиці 2. При першому обстеженні прогностичний індекс був 6 і результат в ЕКЗ циклі - чергова невдача. При другому обстеженні після лікування прогностичний Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Бали 2 6 1 6 0 1 індекс був 1 і клінічний результат -успішна вагітність. Таким чином, вищевикладені дані свідчать про застосування даного способу з найбільшою серед існуючих способів об'єктивністю, що може використовуватися для клінічного обстеження пацієнток з багаторазовими невдачами екстракорпорального запліднення з метою прогнозування результату екстракорпорального запліднення, що значно підвищує ефективність такої медичної допомоги як екстракорпоральне запліднення. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601