Спосіб іммобілізації на вуглецевмісний носій аміновмісних біологічно активних сполук

УКРАЇНА (19) UA«.u 10481 „з, С1 (5і)б С 12 N 11/00, 11/02 ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО ОПИС ДО ПАТЕНТУ * '• % НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ІММОБІЛІЗАЦІЇ НА ВУГЛЕЦЕВМІСНИИ НОСІЙ АМІНОВМІСНИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ СПОЛУК 1 2 (21) 93101013 (22) 16.04 93 (24) 12.11.99 (31)5033447 , (32) 20 03.92 J (33) RU (46) 12.11.99. Бюл. № 7 (56) Патент GB № 1193918, кл. С 12 N 11/08, 1969. (72) Коваль Нінель Михайлівна, Бакалінська Ольга Миколаївна, Картель Микола Тимофійович, Стрєлко Володимир Васильович (73) Інститут сорбції та проблем ендоеколопї Національно» академії наук України (57) 1. Способ иммобилизации на углеродсодержащий носитель аминсодержащих биологически активных веществ (БАВ), включающий последовательную об работку носителя хлористым тионилом и раствором аминсодержащего БАВ, о т- л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве углеродсодержащего носителя используют окисленный углеродный материал, а полученный после обработки хлористым тионилом продукт обрабатывают раствором амина или аминсодержащего БАВ при мольном соотношении количества карбоксильных групп углеродного материала, хлористого тионила и амина или аминсодержащего БАВ 1:(1,5-2,5):(1-2) соответственно, при этом рН реакционной среды 7,5-8 5 поддерживают с помощью блока автоматического титрования. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что обработку хлористым тионилом осуществляют в течение 3-5 ч при температуре 60-80°С. 00 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных углеродных носителей, которые могут быть использованы в химико-фармацевтической промышленности и к способам получения иммобилизованных биологически активных соединений, используемых в медицине, аффинной хроматографии Наиболее близким по достигаемому результату и техническому решению к заявляемому является способ получения углеродного носителя для иммобилизации БАВ. Способ заключается в том, что окисленный углеродный носитель последова тельно обрабатывают: парами хлористого тионила, горячим раствором азида натрия, раствором БАВ. Процесс многостадиен и вследствие этого - низкий выход иммобилизованного БАВ. Кроме того, проведение газофазных реакций всегда более трудоемкий и аппаратурно сложный процесс, чем обработка твердого носителя в жидкой фазе при том же выходе конечного продукта Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка эффективного способа иммобилизации на углеродный носитель аминов или аминсодержащих биологически активных веществ О 10481 Заявляемый способ, включающий последовательную жидкофазную обработку окисленного углеродного материала хлористым тионилом и амином или аминсодержащим БАВ, позволяет получить требуемый технический результат, заключающийся в повышении эффективности способа за счет увеличения количества иммобилизованного БАВ при одновременном его упрощении. Сущность этого способа заключается в следующем. В качестве исходного углеродного материала для получения носителя используют окисленные углеродные носители (типа СКНо, СКСо, КАУо и др.). К окисленным углеродным адсорбентам прибавляют хлористый тионил с бензолом в качестве разбавителя реакционной массы. Мольное соотношение количества карбоксильных групп на угле и хлористого тионила 1:(1,5-2,5). Смесь нагревают до 60~80DC в течение 3-5 ч до прекращения выделения двуокиси серы и хлористого водорода. По окончании реакции сорбент отфильтровывают и промывают бензолом до полного удаления остатков непрореагировавшего хлористого тионила. Далее, к раствору амина или аминсодержащего БАВ (рН 7,5-8,5) при постоянном контроле и поддержании рН среды при помощи блока автоматического титрования, порционно, при постоянном перемешивании прибавляют активированный хлористым тионилом углеродный носитель при мольном соотношении количества карбоксильных групп к амину или аминсодержащему БАВ 1;(1-2). 5 10 15 20 Необходимость и оптимальность вышеприведенных конкретных условий получения иммобилизованного углеродного носителя обусловлена следующими факторами. Необходимость проведения реакции взаимодействия карбоксильных групп углеродного сорбента с хлористым тионилом в абсолютном бензоле обусловлена тем, что проведение этой реакции в газовой фазе более трудоемко и аппаратурно сложно при том же выходе конечного продукта. Проводя реакцию в абсолютном бензоле, нам необходимо меньшее, чем в случае обработки в газовой Фазе, количество хлористого тионила. Кроме того, удаление непрореагировавшего хлористого тионила с угля раствором бензола более эффективно, чем удаление продувкой Сухим воздухом. При обработке окисленного носителя раствором хлористого тионила в бензоле происходит превращение карбоксильных групп 25 Ь- СООН .уголь S - ОН + S0C1, уголь -С 01 30 е хлорангидридные (хлорацильные) с высоким выходом (до 85%) последних. В дальнейшем, при получении иммобилизованных БА8 на углеродном носи35 теле поверхностные хлорацильные группы на углеродном носителе реагируют при рН 7,5-8,5 с аминогруппами БАВ (амины, диамины, аминокислоты, белки), образуя Существенными отличительными призпрочные пептидные связи. Поддержание наками заявляемого изобретения от про- 40 рН реакции на величине 7,5-8,5 необхототипа являются: обработка углеродного димо вследствие того, что при этом равносителя хлористым тионилом в абсолютновесие реакции смещено в сторону обном бензоле и взаимодействие активироразования пептидной связи, в отличие от ванного хлористым тионилом углеродного реакции при рН среды больше или меньносителя с раствором амина или амин- 45 ше заявляемого интервала. содержащего БАВ при рН среды 7,5-8,5. Эти признаки достаточны во всех случаях для достижения требуемого технического •V результата. Отличием способа является ss УГОЛЬ + НИ уголь -о также то, что обработку раствором хло- 50 С1 NH-EAB ристого тионила осуществляют в течение 3-5 ч при температуре 60-80°С и мольном соотношении карбоксилов окисленного углеродного носителя и хлористого Для проведения реакции не требуюттионила 1:< 1,5-2,5), а также то, что обра- 55 ся дополнительные реагенты, кроме как ботку амином или аминсодержащим БАВ для поддержания постоянного рН среды проводят при мольном соотношении коли(раствор щелочи). После получения хлочества карбоксильных групп угля к колирацильных групп на поверхности угля реакчеству амина или амиисодержащего БАВ ция иммобилизации БАВ одностадийна, 1:0-2). следовательно, проходит с большим вы 10481 ходом, чем многостадийный процесс иммобилизации (по прототипу). При обработке окисленного углеродного носителя раствором хлористого тионила менее 3 ч, при мольном соотношении количества хлористого тионала к количеству карбоксилов на носителе менее 1,5 и температуре ниже 60°С превращение карбоксильных групп в хлорацильные происходит медленно и с низким БЫХОдом. Обработка углеродного носителя раствором хлористого тионила в течение более 5 ч при мольном соотношении количества хлористого тионила к количеству карбоксилов угля более 2,5 и температуре выше 80°С не приводит к увеличению выхода хлорангидридных групп на угле по сравнению с оптимальным, составляющим 75-85%, и сопряжена с затратами времени и реактивов, не приводящими к улучшению свойств целевого материала. Обработка хлорангидридсодержащего угля при мольном соотношении количества амина или аминсодержащего БАВ к карбоксильным группам носителя менее. 1,0 не обеспечивает высокого выхода иммобилизации вследствие недостаточности количества иммобилизуемого амина или аминсодержащего БАВ. Обработка хлорангидридсодержащего углеродного носителя при мольном соотношении амина или аминсодержащего БАВ к количеству карбоксильных групп носителя более 2,0 не дает увеличения выхода иммобилизованных БАВ по сравнению с оптимальными условиями, составляя 4 0 - 5 0 % от количества хлорацильных групп на угле, и сопряжена с затратами реактивов, не приводящими к улучшению свойств целевого материала. Эффективность способа иллюстрируется следующими примерами. П р и м е р 1. Навеску 6 г окислен. ного углеродного сорбента с СОЕ 2,0 мэкв/г помещают в круглодонный реактор с обратным холодильником. Прибавляют 30 мл бензола. В реактор, помещенный на водяную баню, находящуюся на электрической плитке, прибавляют 1,74 Мл хлористого тионила (мольное соотношение количества карбоксильных групп угля и хлористого тионила 1:2). После перемешивания греют 4 ч при температуре 70°С. После этого углеродный материал отфильтровывают и промывают бензолом для удаления остатков непрореагировавшего хлористого тионила. Промытый активированный хлористым тионилом уголь переносят в бюкс. Концентрацию хлорациль ных групп на угле определяют титрованием и аргентометрией. Навеску 0,4 г полученного угля с содержанием хлорацильных групп 1,7 мэкв/г углеродного но5 сителя постепенно вносят в раствор с содержанием амина или аминсодержащего БАВ 1,2 ммоль (соотношение -СООН групп угля к амину или аминсодержащему БАВ 1:1,5). рН среды постоянно конт10 ролируют в процессе добавления активированного носителя и поддерживают при помощи блока автоматического титрования. После добавления последней порции угля к раствору рН контролируют еще в 15 течение 2-3 ч. Процесс иммобилизации ведут в течение 2 0 - 2 4 ч. Количество иммобилизованного амина определяли титрованием аминогрупп на угле, количество иммобилизованного белка определяли по 20 разности содержания белка в растворе до и после иммобилизации. Варьируя рН реакционной среды иммобилизации, получают образцы целевых сорбентов, приведенных в табл. 1. 25 Таким образом, из приведенных в табл. 1 данных видно, что предлагаемый способ иммобилизации аминов (этилен-, диамин, фенилаланин) и аминсодержащих ЗО БАВ {бычий сывороточный альбумин, БСА) эффективен только в предлагаемом интервале рН иммобилизации 7,5-8,5. При выходе рН за указанные пределы эффективность способа существенно снижается 35 и требуемого технического решения не удается достичь. П р и м е р 2. Навеску окисленного углеродного сорбента с СОЕ 2,0 мэкв/г обрабатывают как приведено в примере 40 1, т.е. помещают в круглодонный реактор с обратным холодильником. Заливают бензолом. В реактор, помещенный на водяную баню, находящуюся на электрической плитке, прибавляют хлористый тио45 нил. После перемешивании греют необходимое время при нужной температуре. После этого углеродный материал отфильтровывают и промывают бензолом до удаления остатков непрореагировавшего 50 хлористого тионила. Промытый активированный хлористым тионилом уголь переносят в бюкс. Навеску полученного сорбента постепенно переносят в раствор амина или аминсодержащего БАВ. рН 55 среды постоянно контролируют и поддерживают его величину равную 8,0 при помощи блока автоматического титрования. Режимы обработки (мольное соотношение количества карбоксильных групп угля к хлористому тионилу, время и темпера 10481 туру обработки хлористым тионилом, мольное соотношение количества карбоксильных групп к количеству амина или аминсодержащего БАВ) изменяют, как описано в табл. 2. В ней же приведены данные по результатам иммобилизации амина или аминсо'держащего БАВ на полученных образцах целевого сорбента. Как видно из табл. 2, обработка угля хлористым тионилом в заявляемых интервалах: мольного соотношения карбоксилов к хлористому тионилу 1:( 1,5-2,5), времени обработки 3~5 чг температуре обработки 60-80°С приводит к достижению обеспечиваемого изобретением технического результата (повышение эффективности иммобилизации): этилендиамина (образцы № 4-12) по сравнению с прототипом (образец № 35), фенилаланина (образцы № 21, 24) по сравнению с прототипом (образец № 36), БСА (образцы № 31, 33) по сравнению с прототипом (образец № 37). Уменьшение мольного соотношения количества хлористого тионила к карбоксильным группам носителя до 1:1 (меньше заявляемого интервала) приводит к значительному снижению количества иммобилизованного амина (образцы № 13-15) даже при том, что остальные параметры обработки находятся в заявляемых интервалах. Увеличение мольного соотношения количества хлористого тионила к карбоксильным группам носителя до 1:3 (больше заявляемого интервала) не приводит к улучшению уже достигнутого результата даже при том, что остальные параметры обработки угля находятся в заявляемых интервалах (образцы № 16-18). Обработка носителя хлористым тионилом в течение времени меньшего, чем заявляемый интервал (2 ч) при том, что остальные параметры обработки находятся в заявляемом интервале, не приводит к достижению требуемого результата (образцы № 30, 32). Увеличение времени обработки больше заявляемого интервала (6 ч) не приводит к улучшению достигнутого (образцы № 22, 25). При уменьшении температуры обработки носителя хлористым тионилом меньше, чем заявляемый интервал (50°С, при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 8 том, что остальные параметры обработки находятся в заявляемых интервалах, не достигается требуемая эффективность иммобилизации (образцы № 23, 29). Увеличение температуры обработки выше заявляемого интервала (90°С) не приводит к улучшению уже достигнутого результата (образцы № 26, 34). При выходе соотношения карбоксилов угля к амину или аминсодержащему БАВ за пределы заявляемого интервала не удается достичь обеспечиваемого изобретением технического результата (образцы № 1-3, 19, 20, 27, 28). Таким образом, проведение иммобилизации аминов или аминсодержащих БАВ на углеродном носителе при обработке угля хлористым тионилом в абсолютном бензоле с мольным соотношением карбоксильных групп носителя к хлористому тионилу 1:(1,5-2,5) в течение 3-5 ч при 60-80°С с последующей обработкой раствором амина или аминсодержащего БАВ при рН реакционной среды 7,5-8,5 и мольном соотношении карбоксилов угля к амину или аминсодержащему БАВ 1:(1-2) позволяет достичь обеспечиваемого изобретением технического результата - повышения эффективности способа за счет увеличения количества иммобилизованного амина или аминсодержащего БАВ при одновременном его упрощении. Действительно, согласно заявляемому способу удается иммобилизовать в 3,7 раза больше этилендиамина, в 2,9 раза больше фенилаланина и в 1,7 раза больше БСА по сравнению с прототипом. Этого удается достичь при одновременном упрощении способа: обработке углеродного носителя хлористым тионилом в абсолютном бензоле, т.е. в жидкой среде, а не в газовой фазе, минуя стадии обработки активированного хлористым тионилом угля раствором азида натрия и термической перегруппировки в иэоцианатные группы. Перечисленные выше достоинства способа иммобилизации позволяют получить высокоэффективные биоспецифические углеродные носители для нужд биотехнологии, аффинной хроматографии и медицины с большей эффективностью и меньшими затратами реактивов и ресурсов. 10481 10 Т а б л и ц № образца рН среды Этилендиамин, мг/г Фениланин, мг/г БСА, мг/г 1 2 3 4 5 7,0 7,5 8.0 8,5 9,0 6,0 30,6 40,8 32,4 7.2 11,1 55.1 75.9 59,4 13,2 а 1 40 70 75 65 45 Т а б л и ц а 2 № образца 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 (прототип) 36 (прототип) 37 (прототип) 1:2,0 _** —'•1:1,5 в _ _ 1:2,0 1:2,5 и 1:1,0 1:3.0 1:1,6 ч 1:2,0 1:2,5 1:2.0 1:2.5 1:1,5 1:2,5 ft 1:10 1:10 1:10 3 4 5 3 4 5 3 4 5 3 4 . 5 3 4 5 3 4 5 4 6 4 6 5 .4 6 3 5 2 4 2 4 3 1,5 tf — • * — Температура, Иммобилизованное вещество Мольное соотношение - СООН: - NH2 80 ' Мольное соотноВрешение мя, ч - СООН: - CI Этилендиамин 0,8:2,5 —— * ' • • 1:1,0 Of* _••_ \ш n _ " _ —п— • • н _ « _ n _ " _ ft _ " _ " _ _ .—" — ч *• _ " _ _ " _ _ " _ _ " _ _ " n — _ " _ — _ " — И - " -" — _ " _ n It - " _ - " « _ " _ 60 _ • * _ - " Фенилаланин 0,8:2,5 _ * • _ _ • • _ _ 1:2 ••_ _ « „ •t 50 60 _••_ 90 50 БСА 70 50 70 70 70 * « 70 90 _"_ 100 Этилендиамин п **_ «I м 100 Фенил ал анин 100 0,8:2,5 1:1,5 я_ „'•- " я__ БСА • . Кол-во иммобилизованного вещества, мг/г 28,6 29,1 29.5 31,6 33.7 35,7 35.7 37,7 39,8 39,8 41,8 43,9 19,4 20,4 24,4 39,8 40,8 38.8 57,2 58,4 62,7 66,0 30,2 69.3 72,6 65.2 43 45 42 40 65 50 75 70 12,0 24,8 45 Упорадник Техред М. Келемеш Коректор Л.Пчолинська Замовлення 522 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Ки»в-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101