Спосіб одержання біологічно активних мукополісахарідів

Ш СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (51)5 С 08 В 37/ і 0 // А 61 К 37/18 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР 1 (21) 3965564/23-05 (22) 17.05,85 ( 3 1 ) 8415978 (32) 18.10.84 (33) FR 21 (46) 07.06.40. Бюл. (71) Хоай С .A. (FP) (72) Жан-Клод Лормо и Жан Жоай (FR) (53) 5 4 7 . 9 9 5 . 1 7 Ґ 0 8 8 . 8 ) (56) Патент СССР N 1209033, > к л . С 08 В 37/10, Ї 979. ( 5 4 ) СПОСОБ ПОТУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МУКОРОЛИСАХАРИДОВ ( 5 7 ) Изобретение о т н о с и т с я к способу получения биологически активных м у к е полисахаридов» применяемых в м е д и ц и не,, Целью изобретения является варьи рование терапевтического профиля мукополисахаридов. Эта цель достигается способом^ заключающимся в деползімернзации гепарина под действием нитрата натрия в водном растворе при концентрации гепарина 5 мас.% и нитрита натрия - 0,0435 М при рН 2,5 до полного отсутствия ионов N0 2 перед выделением целевого продукта доводят рН до 7 t вводят этанол и ввдєпивінийся осадок растворяют в водном рас творе хлористого натрия при рН Э,8, а вьщелением целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси 1 : 1 . 4 и л . , 1 табл. Изобретение относится к способу получения мукополисахяридов (МПС )» обладающих анти громболиіической а к тивностью, И МОЖеТ ЇЇЬПЬ ИСПОЛЬЗОВсіКО в медшшне для предупреждения и л е чения тромбозов и старения тканей, а также в лабора горных исследованиях» Целью изобретения является варьирование те pan ев тиче ског о п рофиля биопогичегкн активных кукополисахаридов. П р и м е р I„ 500 г годного для инъекции і еп.трмна в віще соли натрия растворяют в 4500 мл деминерализованной воды при 18 С. Соотношение титров T = і 3V испольяуемого гепариWV на близко і , эти титры имеют значение порядка 160-170. Полученный раствор энергично п е ремешивают, а его величину рН снижают до 2,5 путем добавления концеггтрированной хлористо-подородной кислоты. Затем добавляют 15 г нитрита нат* рия, растворєнноїо в 300 г воды. Величину рН регулируют до 2,5 путем добавлення хлористо-водородной к и с лоты, и общий объем доводится до 5000 мл. Дают реакции проходить в течение 45 мин, затем проверяют отсутствие остаточных азотистых ионов в реакционном растворе с помощью индикаторной бумаги, пропитанной йодистым калием і„ крахмалом (появление сине-фиолетовой окраски в присутствии ионов N 0 2 ) , Продолжают реакцию до полного исчезновения піп рита и до отсутствия ел 57065Г р е а к ц и и на по^крагімаліНуі^ ПРОВОДЯТ ПрОЕерК" Ч е р е з „->o.rys wpv-rt^e 3~ 4 мин. Когда эти проверки с'ч-^ут ачридательными, реакцию считают законченной,, Затем устанавливают величину рН до .10 путем добавтечиз концентрированного едкого натра v добавляют 5 г тегратидридборатэ Ч?ТРИЯ„ Раствор перемешивают в течение, 1 5ч„ Не вступивший в реакцию те^рагидроборат натрия уничтожается путем уменьшения величины рП до 3 s 0 с помо-' щью концентрированной хлорчето-водородчой кислоты» Раствор перемешивают в течение 15 мин, затем регулируют величину рН до 7 в 0 посредством концентрированного едкого яатра в Продукты реакции извлекают путем д о бавления 10 л этанола» Объемное соотношение этанол : реакционная смесь 2sK Через 48 ч отставания продукт сцеживают и уд an тот всплывшую часть, Осадок вновь растворяют Б 9 л деминерализованной воды» Добавляют 3 00 г хлористого натрия и повышают величину рН расівора до 3 9 8 с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты0 Объем доводят .точно до 10 ns добавляя деминерализованную воду^ и при энергичном церемешкв-ании добавляют 10 я этанола» Оставляют отстаиваться в течение 48 ч о Всплывшую часть сифонируют и удаляют. Осадок извлекают^ "промыва"ют этаноломг измельчают и сушат в вакууме о Получают 23и продукта со сле40 дуюд^ими характеристиками % титр VSP'52 Е/мг; титр йин и Весслер (IW) 225 Е/мг; средняя молекулярная мае™ са-4000-5000 дапыон; IW/VSP 4 S 3 , Пример 2 4 Способ получения фракций, имеющих титр IW к VGP в с о отношении A s 3 n 5000 г годного для инъекции гепарина растворяют в 45 л деминерализованной воды при 18°С» Действуют подобным примеру 1 образом, умножая количество реактивов на 105 т . е . добавляют 150 г азотистого натрия в 3 л воды£ .доводят объем реакционной смеси до 50 л; добавляют 50 г гетрагидридбората;осаждают с помощью I00 л этанола^ вновь растворяют в 90 л воцы'| добавляют 1000 г хлорчетого натрия; доводят окончательный до I0U л ; добавляют в конечном итоге 100 л зтанола. Таким образом получают 2230 г продуктов со следующими характеристиками: титр VSP 54 Е/мг; титр Йин и Весслер (IW) 232 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон. Продукты реакции извлекаются путем добавления 10 л этанола, отстаиваются в течение 48 ч , сцеживаются и всплывшая часть удаляется, Осадок вновь растворяют в 9-л воды. Добавляют 100 г хлористого нагрия и понижают величину рН раствора до 3,8 с помощью концентрированной хлористо-водородной кислоты. Объем доводится точно до 10 л с поМОЇЦЬЮ деминерализованной воды и при энергичном перемешивании добавляют 10 п этанола. Оставляют отстаиваться в течение 48 ч . Всплывшую часть сифонируют и удаляют. Осадок извлекают, промывают этанолом, измельчают и сушат в взкууме. Получают 230 г продукта со следующими характеристиками: титр VSP 52 Е/мг; титр Йин и Весслер (IW) 225 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон. Б примере і приведены результаты фармакологических испытаний, проведенных с продуктом примера 1. На фиг. І-4 приведены кривые, полученные при изучении в лабораторtibix условиях изменении времени свертывания, вызванных в плазме крови человека возрастающими дозами стандартного гепарина и продукта из при~ мера. 1 . Б испытаниях, соответствующих результатам данных нз фиг. 3 и 4, использовали плазму без тромбоцитов и обедненную фактором XI. На фиг,. 1 - 4 показаны изменения в иєкундазї у тромбина (фиг, I ) , кефадин-каолш'а (фиг , 2 ) , свертывания в присутствии концентрированного тромбопластина (фиг. 3) и разбавленчого тромбопластина (фиг. 4 ) , вызванные испытуемыми продуктами, т„е в продуктом '-л примера і (кривые a f l , ' - ? s а ч и с + ) л гепарином кривые Ъл , Ьґ э "Ь^и о " я зависимости от соотІ ветственно использованных д о з . &ремк тромбина и кефалин-каолина собой типы измерения, действие исследуемых препаратов соответственно на ингибиро вание усиленного фактора I I и обшее свертывание. Кривые на фиг, 1 и 2 показывают, что ЇШС в соответствии с изобретением оказывают значительно меньшее действие, чем действие гепарина, на ингибирование активации протромбина и на уровне общего свертывания. Фиг. 3 и 4, представля' ющие явления, более непосредственно связанные с последовательностью энзиматических реакции, характеристиками наружного свертывания (а именно при относительном отсутствии фак' тора Х1а), показывают эффективность М С по изобретению по сравнению с П гепарином. П р и м е р 4. Исследование а н титромболитичєскои активности продукта из примера 1 на кролике. Назначение 500 и IW кролику вызы вает значительную активность против Ха, а общая противосвертывающая активность остается относительно незначительной, Через 2 ч после назначения активность составляет порядка 0,88 Е/мл, а время кефалин-каолина 0,09 Е/мл. Испытания в стеклянной колбе и на живом организме показывают более селективную активность М С по изобП ретению, а именно, на уровне ингибирования Фактора Ха по сравнению с активностью гепарина. Сравнительные данные по актикоагулирующей активности мукополисахаридов, полученных по предлагаемому Соединения 1570651 * и известному способам, приведены в таблице, Анализ представленных в таблице данных свидетельствует о различном терапевтическом профиле известных соединений и полученных по изобретению. JQ Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я 1 15 20 25 30 35 Способ получения биологически а к тивных мукополисахаридов деполимеризацией гепарина в растворе деминерализованной воды в присутствии деполимеризующего агента с выделением целевого продукта осаждением этанолом, о і л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью варьирования терапевтического профиля биологически а к тивных мукополисахаридов, в качестве деполимеризующего агента используют нитрит натрия и деполимеризацию осуществляют при концентрации гепарина 5 мас.% и нитрита натрия - 0,0435 М при рН 2»5 до полного отсутствия ионов НО", перед выделением целевого продукта доводят рН реакционной смеси до 7 раствором едкого натра, в в о дят в нее этанол в объемном соотношении этанол : реакционная смесь, равном 2 : 1 , и выделившийся осадок растворяют в водном растворе NaCl при рН 3 , 8 , а выделение целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси 1 : 1 . Активность анти-Па по Tein и д р . , Е/мг Е/мг "Стандартный" гепарин 160 160 1 120-170 120-170 Предлагаемое 225 52 4,3 120 10 232 54 4,3 120 10 1500 60 25 2100 20 Известное IW/VSP Активность анти-Ха по Tein и д р . , Е/мг VSP, Е/мг 157065! Редактор А. Шандор Составитель Т, Мартинская Техред Л-Сердижова Корректор М, Кучерявая Подписное Закаэ 1461 Тираж В И П Гпсударствеиного комитета по изобретениям и открытиям при ГКІГГ СССР НИИ 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат " ї ІІатеит" > г о Ужгород9 ул. Гагарина, 101