Штам бактерій rhizobium galegae для підвищення урожаю козлятника східного та поліпшення якості рослинної сировини

Реферат: Штам бактерій Rhizobium galegae призначений для підвищення урожаю козлятника східного та поліпшення якості рослинної сировини. UA 105942 U (12) UA 105942 U UA 105942 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробіологічних засобів підвищення урожаю бобових культур, призначена для виробництва бактеріального добрива під козлятник східний. Козлятник східний є перспективним для використання в сільськогосподарському виробництві країни: він має високу зимостійкість, відзначається раннєстиглістю, інтенсивним ростом, здатністю до формування високого врожаю надземної маси та насіння. Рослинна сировина багата на аскорбінову кислоту, каротин, містить високу кількість протеїну [1]. Проте широке застосування козлятника східного в агровиробництві України обмежене відсутністю районованих сортів та гібридів, а також розроблених біопрепаратів на основі активних штамів бактерій R. galegae для поліпшення азотного живлення та підвищення продуктивності культури [2]. За літературними джерелами відомо, що бактерії R. galegae характеризуються високою специфічністю до рослини-господаря, тобто формують активний симбіоз лише з певним видом козлятника. [3]. Для підвищення продуктивності культури і інтенсивності біологічної азотфіксації насіння обробляють селекційними штамами бульбочкових бактерій R. galegae [4, 5]. Однак у сільськогосподарському виробництві для передпосівної інокуляції є лише незначна кількість активних штамів. Таким чином, актуальною є селекційна робота над пошуком активних штамів R. galegae [6, 7]. Задачею корисної моделі є одержання нового ефективного штаму бульбочкових бактерій козлятника, який би мав високу специфічність до козлятника східного, посилював процес симбіотичної азотфіксації і забезпечував підвищення продуктивності даної культури. Поставлена задача вирішується тим, що отримано новий штам бактерій R. galegae, який в симбіозі з козлятником східним активно фіксує атмосферний азот, покращує розвиток рослин, підвищує продуктивність даної культури і може бути біоагентом мікробного препарату. Запропонований штам R. galegae виділений з бульбочок козлятника східного сорту Кавказький бранець, який вирощувався на дослідних ділянках Національного ботанічного саду ім. М.М. Гришка HAH України. Тип ґрунту - темно-сірий, опідзолений. Штам Rhizobium galegae ідентифікований за визначником Берджі [8] і йому привласнений номер К-3. Штам бактерій R. galegae К-3 депонований 27 травня 2015 р. у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України (03143 Київ, вул. Заболотного, 154) за реєстраційним номером Rhizobium galegae ІMB В-7520, а також зберігається в Колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва Національної академії аграрних наук України за реєстраційним номером Rhizobium galegae B216, призначений для виготовлення бактеріального добрива під козлятник східний. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам R. galegae К-3 добре росте на рідкому та твердому поживному середовищі такого складу (г/л): цукроза - 10,0; гороховий відвар - 100,0; агар-агар - 20,0; рН - 6,5-7,0. Стерилізація середовища 1,0 атм 30 хв. У рідкому середовищі культура вирощується на качалках при 220 об/хв. Оптимальна температура росту - 28 °C, рН - 6,5-6,8. На агаризованому гороховому середовищі колонії на 3-4 добу росту помірно опуклі, слизисті, напівпрозорі, округлої форми, діаметром 2-4 мм. Штрих на зазначеному середовищі слизистий, напівпрозорий, помірно опуклий. Клітини мають форму злегка зігнутих паличок, рухливі. Бактерії не утворюють спор, за Грамом не забарвлюються. Культура швидкоросла. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, підвищує рН середовища до лужного. На м'ясопептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Здатний до дисоціації. Відношення до джерел вуглецю. Штам активно асимілює глюкозу, арабінозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маніт, дульцит, сорбіт з підкисленням середовища. Відношення до джерел азоту. Штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм та натрієм. Переважно використовує відновлені форми азоту. Пригнічення росту бактерій спостерігається при культивуванні на синтетичному середовищі в присутності органічних сполук азоту (сечовини та аспарагіну). Штам чутливий до більшості досліджених антибіотиків: норфлоксацину, еритроміцину, поліміксину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левоміцетину, канаміцину, гентаміцину, ампіциліну, фурадоніну, не чутливий до оксациліну. Штам належить до швидкорослих бульбочкових бактерій. В симбіозі з козлятником східним штам здатний до активної фіксації молекулярного азоту, формуючи на коренях рослин рожеві бульбочки. 1 UA 105942 U 5 10 15 Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Ознаки штаму стійкі. Штам зберігається на агаризованому гороховому середовищі при 45 °C. Пересів проводиться один раз в 6 місяців. Ефективність штаму R. galegae К-3 перевіряли у польових дослідах. Аналогом штаму бактерій R. galegae К-3 можна вважати стандартний штам R. galegae 0703. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. У польовому досліді на базі ІСМАВ НААН (ґрунт - дерново-підзолистий супіщаний, рН сольове - 6,5; вміст гумусу - 0,8-1,1 %; азоту, що легко гідролізується - 56-57 мг; Р2О5 - 160-170 мг і К2О - 100-110 мг на 1 кг Ґрунту) вивчали ефективність штаму R. galegae K-3 щодо урожайності та вмісту азоту у сировині козлятника східного. Перед посівом насіння козлятника скарифікували та інокулювали досліджуваним штамом із розрахунку 200-300 тис. бактеріальних клітин на насінину. В контрольному варіанті насіння змочували водою. Аналізуючи урожайність рослин, як один з головних показників ефективності застосування інокуляції активними штамами, встановлено, що штам R. galegae K-3 забезпечив достовірне збільшення урожаю сухої надземної маси відповідно на 0,95 т/га в порівнянні з рослинами контрольного варіанту та на 0,70 т/га в порівнянні з рослинами, інфікованими штамом R. galegae 0703 (табл. 1). Таблиця 1 Ефективність застосування штаму R. galegae K-3 для передпосівної обробки насіння козлятника східного Суха надземна маса, Приріст до стандарту, Приріст до контролю, % т/га % Контроль (без інокуляції) 2,83 Інокуляція штамом R. 3,08 8,83 galegae 0703 Інокуляція штамом R. 3,78 33,57 22,73 galegae K-3 НІР05 0,20 Варіанти досліду 20 25 Разом з підвищенням продуктивності, інокуляція козлятника східного досліджуваними штамами сприяла збільшенню вмісту азоту в надземній масі. Зростання частки азоту в рослинній сировині покращує її якість та підвищує кормову цінність. Так, передпосівна обробка насіння козлятника східного штамом R. galegae K-3 сприяла збільшенню вмісту азоту в надземній масі рослин відносно контролю на 28 %, відносно рослин, оброблених стандартним штамом R. galegae 0703 - на 12 % (табл. 2). Таблиця 2 Вміст азоту в листках козлятника східного першого року вегетації залежно від інокуляції штамами R. galegae Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція штамом R. galegae 0703 Інокуляція штамом R. galegae K-3 НІР05 30 Вміст азоту у повітряно-сухій речовині, 2,72 Приріст до контролю, % Приріст до стандарту, % 3,11 14,34 3,48 27,94 11,90 0,24 Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що штам R. galegae K-3 формує активний симбіоз з козлятником східним першого року вирощування, забезпечуючи зростання його урожайності та покращення якості рослинної сировини. Приклад 2. Протягом двох років вирощування козлятника східного вивчали ефективність штаму R. galegae K-3 щодо даної культури в польовому досліді на базі ІСМАВ НААН. Активність 2 UA 105942 U 5 симбіотичної азотфіксації визначали ацетилен-етиленовим методом [9] на газовому хроматографі "Chrom-4". Встановлено, що штам R. galegae K-3 є активним симбіонтом козлятника східного. За інокуляції рослин цим штамом на коренях рослин формуються чисельні бульбочки, які характеризуються високою здатністю до фіксації атмосферного азоту (табл. 3). Штам R. galegae K-3 підвищує також інтенсивність процесу фотосинтезу протягом двох років вирощування козлятника східного, про що свідчить зростання вмісту хлорофілу а і b в листках інокульованих рослин. Досліджуваний штам збільшує загальний вміст хлорофілів відносно контролю на другий рік вирощування на 40,5 % (табл. 4). 10 Таблиця 3 Вплив бактеризації козлятника східного штамом R. galegae K-3 на формування кореневих бульбочок та їх активність протягом першого та другого років вирощування. Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція штамом R. galegae 0703 Інокуляція штамом R. galegae K-3 НІР05 Середня кількість бульбочок, од. на рослину 1-й рік 2-й рік вирощування вирощування Азотфіксувальна активність, мкг N /рослину за годину 1-й рік 2-й рік вирощування вирощування 26,8 127,8 10,3 24,7 300,3 479,8 42,7 48,6 710,5 637,8 60,4 65,0 60,74 47,45 7,60 10,39 Таблиця 4 Вміст хлорофілу в біомасі листя козлятника східного (другий рік вирощування). Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція штамом R. galegae 0703 Інокуляція штамом R. galegae K-3 НІР05 15 20 сума Приріст Приріст хлорофілів хлорофілів а і b хлорофілів а і b а і b, мг/100 до контролю, % до стандарту, % г хлорофіл а, мг/100 г хлорофіл a, мг/100 г 165,04 25,40 190,44 193,97 33,61 227,58 19,50 218,53 48,94 267,47 40,49 17,53 27,85 15,07 У другий рік вирощування козлятника східного у фазах першого та другого цвітіння проводили скошування зеленої маси. Інокуляція рослин досліджуваним штамом сприяла значному зростанню продуктивності козлятника східного (табл. 5). Штам R. galegae K-3 забезпечив приріст урожаю сухої надземної маси рослин відносно контролю на другий рік на 15,47 %, відносно стандарту - на 10,46 %. В цілому зростання продуктивності культури у сумі за два роки вирощування порівняно до контролю становить 24,5 %. Отже, штам R. galegae K-3 є активним симбіонтом козлятника східного. За інокуляції культури даним штамом зростає чисельність кореневих бульбочок, їх нітрогеназна активність, що забезпечує рослини необхідним для росту та розвитку зв'язаним азотом. Це сприяє зростанню вмісту хлорофілів в листках рослин, підвищенню урожайності надземної маси та її якості. 3 UA 105942 U Таблиця 5 Продуктивність козлятника східного другого року вирощування за інокуляції R. galegae K-3 Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція R. galegae 0703 Інокуляція R. galegae K-3 5 10 15 20 25 Урожайність за вегетаційний період, т/га 8,60 8,99 9,93 Приріст до контролю, % 4,53 15,47 Приріст до стандарту, % 10,46 Джерела інформації:: 1. Утеуш Ю.А., Лобас М.Г. Кормові ресурси флори України. - К.: Наук, думка, 1996. - 222 с. 2. Нові кормові, пряно смакові та овочеві інтродуценти в Лісостепу і Поліссі України /Рахметов Д.Б., Стаднічук Н.О., Корабльова О.А., Смілянець Н.М. та інші. - К.: Фітосоціоцентр, 2004. - 263 с. 3. Andronov E.E., Terefework Z., Roumiantseva M.L. et al. Symbiotic and genetic diversity of Rhizobium galegae isolates collected from the Galega orientalis gene center in the Caucasus. // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - Vol. 69, № 2. - P. 1067-1074. 4. Абрамов О.О. Вплив інокуляції насіння козлятнику східного на ріст і розвиток рослин в Лісостепу України // Бюл. Ін-ту с.-г. мікробіології УААН. - 1999. - № 4. - С. 35-37. 5. Ванькова А.А., Ледовская Ю.А. Эффективность инокуляции козлятника восточного штаммами клубеньковых бактерий рода Rhizobium II Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках. Всероссийская конференция. Тезисы докладов. - С.Петербург, 2001. - С. 45-46. 6. Заболотна В.П., Бутницький І.М., Коць С.Я. Значення козлятнику східного у симбіотичній фіксації азоту та підвищенні збору білка // Физиология и биохимия культ, растений. - 2004. - 36, № 4. - С. 291-300. 7 7. Пат. 65227 Україна, МПК C05F11/08, C12N1/20. Штам Sinorhizobium meliloty 425A для інокуляції козлятника східного /С.Я. Коць, С.Я. Маліченко, В.К. Даценко та ін. - № 2003065693; заявл. 19.06.2003; опубл. 15.03.2004, Бюл. № 3. - 3 с. 8. Определитель бактерий Берджи: В 2 т.: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, И. Крига, П. Снита и др. - М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 432 с. 9. Волкогон В.В. Методичні рекомендації по визначенню азотфіксації в ґрунті та кореневій зоні рослин ацетиленовим методом. - Чернігів, 1997. - 14 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Штам бактерій Rhizobium galegae депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером ІMB В-7520 для підвищення урожаю козлятника східного та поліпшення якості рослинної сировини. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4