Штам бактерій rhizobium galegae л2 (колекція імів нау україни) для одержання бактеріального добрива під козлятник східний

Реферат: Штам Rhizobium galegae Л2 для одержання бактеріального добрива під козлятник східний. UA 95714 U (12) UA 95714 U UA 95714 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до мікробіологічних засобів підвищення урожайності бобових культур, і стосується нового штаму бактерій Rhizobium galegae № Л2 для виготовлення бактеріальних добрив під козлятник. Негативні наслідки інтенсифікації землеробства сприяли розвитку за кордоном на початку 60-х років минулого століття, а останнім часом і в Україні, так званого альтернативного землеробства, яке називають також органічним, біологічним, біолого-органічним, біодинамічним тощо. Метою його є одержання продукції, що не містить залишків хімікатів, збереження ґрунтової родючості і, врешті-решт, охорона навколишнього середовища. Серед вищезазначених пріоритетів альтернативного землеробства є застосування нових високобілкових і малозатратних в процесі вирощування видів бобових рослин. Такою стратегічною культурою для розвитку цього напрямку є козлятник східний (Galega orientalis L). Це багаторічна бобова культура, яка росте в чистих посівах 10 років і більше, відрізняється холодо- і морозостійкістю, високим вмістом білка (до 30 %), вітамінів, каротину, здатністю забезпечувати отримання раннього корму (кінець травня-середина червня), високою врожайністю зеленої маси без застосування мінеральних азотних добрив (за рахунок біологічної азотфіксації), надійною і стабільною врожайністю насіння (до 6 ц/га) і, як наслідок, невисокими матеріально-трудовими витратами на його обробіток. Використовуючи козлятник, можна отримати ранній корм навесні та косити його одночасно із озимими на зелену масу. Максимальна продуктивність забезпечується на третій рік вегетації [2]. Відзначаючись високим вмістом протеїну, молода трава козлятнику може замінити концентровані корми для відгодівлі тварин навесні. Білок цієї культури містить повний набір незамінних амінокислот, у тому числі і лімітуючих. У корені достатньо вітамінів і мікроелементів. Завдяки добре розвиненій кореневій системі має ґрунтозахисне значення. Формує велику кількість бульбочок (до 1500 шт. на одну рослину). Добрий попередник для польових культур. За врожайністю козлятник переважає конюшину, люцерну та інші культури. Урожайність зеленої маси - 30-40 т/га і більше, сіна - 8-15 т/га і більше, насіння - 0,2-0,6 т/га. Порівнюючи біологічну цінність білка і надземної маси козлятнику східного і люцерни посівної у фазі цвітіння з еталоном ФАО (для кормових культур), встановлено, що за вмістом білка козлятник значно перевищує люцерну й еталон ФАО. Мікросимбіонтом козлятнику є маловивчена група швидкорослих бульбочкових бактерій Rhizobium galegae. Передпосівний обробіток насіння козлятнику ризобофітом (мікробним препаратом на основі високоефективного штаму Rhizobium galegae) є обов'язковим агротехнічним заходом. Такий обробіток стимулює ріст рослин у фазу цвітіння, збільшення маси квіткових китиць, а також кількість розвинутих і плодоносних пагонів, що призводить до збільшення зеленої маси рослин (до 65 %), рівня азотфіксації і азотонакопичення в них, врожайності та якості насіння. Оскільки культура козлятнику східного ще не набула так необхідного посівного ареалу і є відносно новою культурою для України, тому в ґрунті відсутні активні "аборигенні" штами бульбочкових бактерій, здатних формувати високопродуктивний симбіоз з цією рослиною. Протягом багатьох років під козлятник використовували еталонний виробничий штам Rhizobium galegae СІАМ 0703 (зберігається у Колекції культур бульбочкових бактерій Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології Російської Академії Наук (ВНДІСГМ РАН), С.-Петербург-Пушкін). З 2001 р. став використовуватись еталонний штам Rhizobium galegae MC-1 № 159 української селекції (зберігається у колекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (ІФРГ НАНУ). Недоліком штаму Rhizobium galegae СІАМ 0703 є те, що при бактеризації ним насіння козлятнику спостерігається не досить висока азотфіксуюча активність симбіотичного апарату і урожайність цієї кормової культури. Штам Rhizobium galegae MC-1 № 159 [4], має дещо вищий азотфіксуючий потенціал, але має низьку конкурентоздатність, 9 при культивуванні набирає невисокий титр - 0,8·10 КУО/мл препарату. В основу корисної моделі поставлена задача одержання нового штаму бульбочкових бактерій козлятнику з вищою азотфіксуючою, конкурентною здатністю, титром препарату, який дозволяв би підсилити процес симбіотичної азотфіксації, підвищити продуктивність і покращити якість фітомаси цієї культури. Поставлена задача вирішується завдяки запропонованому штаму Rhizobium galegae № Л2. Штам Л2 був виділений з бульбочок рослин козлятнику, вирощуваного на сірому лісовому середньо суглинковому ґрунті Вінницької державної сільськогосподарської дослідної станції Інституту кормів та сільського господарства НААНУ у селі Агрономічне Вінницького району за 7 км на південь від обласного центра міста Вінниці. Штам ідентифіковано за визначником бактерій Бергі [3]. 1 UA 95714 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Штам Rhizobium galegae № Л2 зберігається в колекції Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (м. Київ). Морфолого-культуральні властивості. Штам характеризується наступними культурально-морфологічними властивостями: культура бактерій не спороносна, грам-негативна, клітини мають форму дрібних паличок, розміром 1-2 мкм, палички рухливі. Бактерії пігмент не продукують. Культура швидкоросла. Поживні середовища для вирощування і зберігання бульбочкових бактерій, зокрема Rhizobium galegae № Л2: 3 3 1. Бобовий агар І, г/дм : бобовий відвар - 1 дм ; цукроза - 2,0 г; агар-агар - 20 г; рН - 7,0; стерилізація при 120 °C (1 атм.) 20 хв. 3 3 2. Бобовий агар II, г/дм : бобовий відвар - 1 дм ; цукроза - 2,0 г; КН2РО4-1,0 г; MgSO4·7Н2О 0,3 г; агар-агар - 15-20 г; рН - 7,0; стерилізація при 120 °C (1 атм.) 20 хв. 3 Бобовий відвар: 50 г бобів (горох, біла квасоля) заливають 1 дм водогінної води і варять 3040 хв. до набухання і розтріскування оболонки насіння (але боби не повинні розваритись). 3 Відвар фільтрують через ватно-марлевий фільтр і доводять водою до 1 дм . 3. Манітно-дріжджовий агар (МДА), г/л: маніт - 10,0; КН2РО4-0,5; MgSO4·7Н2О - 0,2; агар-агар - 16,0; рН - 6,6-7,2; стерилізація при 120 °C (1 атм.) 20 хв. При розсіві штрихом на МДА колонії з'являються на 3-4 добу, мають округлу форму, випуклі, білі, однотипні, слизисті, 1-2 мм в діаметрі. Фізіолого-біохімічні властивості. Симбіонт. Макросимбіонт - бобова рослина козлятник (Galega orientalis Lам.). Відношення до кисню - аероб, але здатний рости при зниженому вмісті кисню. Температурний діапазон росту: 25-35 °C. Оптимальна температура росту: 28 °C. При 40 °C ріст відсутній. Діапазон рН 5,5-8,5. Оптимальна рН 7,0. Як джерело вуглецю штам Л2 може використовувати глюкозу, сахарозу, маніт, ксилозу, мальтозу, рамнозу, сорбіт, лактозу, галактозу, а також ацетати, N-ацетиглюкозоамін, пірувати. Поряд із засвоєнням азоту атмосфери може використовувати амонійний та нітратний азот. Відновлює нітрати до нітритів. Крохмаль не гідролізує. Не розкладає целюлозу. Желатину не розріджує. Молоко з лакмусом не пептонізує, слабо підлуговує. Штам Л2 зберігається на МДА (рН 7,0) або бобовому (гороховому) агарі при 6-8 °C і пересівається 1 раз на 4-5 місяці. Оцінку симбіотичних властивостей штаму Л2 - азотфіксуючої активності, ефективності симбіозу та якості (амінокислотний склад) білка надземної маси козлятнику проводили в умовах вегетаційних та польових дослідів. Приклад. Ефективність штаму Л2 перевіряли у вегетаційних дослідах на стерильному вермикуліті (суміш Гельрігеля з 0,5 нормами азоту) та у польових дослідах на сірому лісовому середньосуглинковому ґрунті Вінницької державної сільськогосподарської дослідної станції Інституту кормів та сільського господарства НААНУ у селі Агрономічне Вінницького району (2012-2013 pp.). Ґрунт на дослідній ділянці - сірий лісовий середньосуглинковий. За даними агрохімічного обстеження вміст гумусу в орному шарі низький - 3 %. Вміст легкогідролізованого азоту (за Корнфілдом) низький - 7,0-8,0, рухомого фосфору (за Чіріковим) високий -16,0-19,4, обмінного калію (за Чіріковим) підвищений - 9,5 мг/100 г ґрунту. Перед посівом у вегетаційних дослідах насіння скарифікували шляхом перетирання з чистим промитим річковим піском, після чого стерилізували 70 %-ним етанолом, промивали стерильною дистильованою водою та інокулювали бульбочковими бактеріями. Досліджувані штами Rhizobium galegae вирощували при 27 °C протягом 3-4 діб у пробірках на агаризованому середовищі, потім змивали стерильною водою і готували суспензію. Інокуляційне навантаження 5 складало 10 КУО/насінину. Посів козлятнику у польових дослідах проводили у рекомендовані для цієї зони терміни (рано навесні) з шириною міжрядь 45 см й глибиною загортання насіння 1,5-2 см. Норма висіву насіння 14 кг/га або до 2 млн/га при масі 1000 насінин 7 г. Нітрогеназну активність штаму визначали в інтактних бульбочках рослин ацетиленовим методом на газовому хроматографі "CHROM-5" [1]. У вегетаційних дослідах для аналізу брали бульбочки рослин першого року вегетації, а у польових дослідах - другого року. Як видно з табл. 1, штам Л2 вступав в ефективний симбіоз з козлятником сорту Кавказький бранець, активно фіксував атмосферний азот і за азотфіксуючою активністю в умовах вегетаційного досліду перевищував штам еталон виробничий СІАМ 0703 у 2,8, а еталонний № 159-1,7 рази. Урожай зеленої маси козлятнику зростав при цьому на 55,0-67,5 % у порівняні з 2 UA 95714 U контролем і на 14,2 й 27,8 - порівняно зі штамом еталоном виробничим СІАМ 0703 та № 159 відповідно. Таблиця 1 Урожай зеленої маси козлятнику сорту Кавказький бранець у вегетаційному досліді, 2011 р. Варіант Прибавка до Середній контролю урожай, г/посудину г/посудину % Контроль, без інокуляції Штам еталон виробничий СІАМ 0703 Штам еталон № 159 Запропонований штам Л2 НІР05, г/посудину 5 10 Прибавка до СІАМ 0703 Прибавка до № 159 г/посудину % г/посудину % Азотфіксуюча активність, мкмоль С2Н4·росл 1 -1 ·год. 26,8±2,0 0 0 0 0 0 0 0 59,5+2,3 32,7 55,0 0 0 -11,2 1,08±0,08 70,7±3,1 43,9 62,1 11,2 15,8 0 0 1,83±0,20 82,4±2,8 55,6 67,5 22,9 27,8 11,7 14,2 3,07±0,29 6,77 Результати ефективності запропонованого штаму Л2 в польових дослідах наведені в табл. 2. Як видно з результатів даної таблиці, використання як мікросимбіонтів для сорту козлятнику східного Кавказький бранець штамів Rhizobium galegae 0703, 159 і Л2 призводило до суттєвого достовірного збільшення врожаю зеленої маси рослин, а також вмісту у ній сирого протеїну і азоту. Обробка зазначеними штамами забезпечила урожай зеленої маси у межах 5,39-6,54 т/га, вміст сирого протеїну - 26,87-29,79 % і азоту - 2,68-3,00 %. Таблиця 2 Врожай зеленої маси козлятнику східного Кавказький бранець та вміст сирого протеїну і азоту Варіант, штами Показники Вміст сирого протеїну, % 20,32 26,87 27,80 29,79 Врожай, т/га 4,10 5,39 5,67 6,54 1,25 Без інокуляції 0703 159 Л2 НІР05 Вміст азоту, % 1,95 2,68 2,87 3,00 Таблиця 3 Амінокислотний склад білка зеленої маси козлятнику східного, (ммоль/г зерна) Амінокислоти Валін Глютамінова кислота Ізолейцин Лейцин Лізин Метіонін + цистин Треонін Фенілаланін + тирозин Контроль, без інокуляції 4,3 Штам 0703 Штам 159 Штам Л2 7,2 8,1 9,5 8,8 67,3 80,5 112,4 3,3 3,5 5,6 3,0 4,8 5,9 6,9 8,4 5,1 8,8 6,4 7,3 9,5 5,9 10,3 7,9 8,7 11,3 6,7 15,5 7,6 15,4 19,5 24,9 3 UA 95714 U 5 10 15 Дослідження з визначення біологічної цінності білків, зокрема з амінокислотного складу, показали (табл. 3), що при передпосівний обробіток насіння козлятнику досліджуваними штамами Rhizobium galegae 0703, 159 і Л2 призводило до різкого збільшення глютамінової кислоти у зеленій масі та деяких інших амінокислот. Різниця між амінокислотними гідролізатами проб, отриманих при інокуляції насіння козлятнику, і контролем без інокуляції був особливо відчутним. Новий штам значно підвищував не лише урожай зеленої маси козлятнику східного, але і його якість. Джерела інформації: 1. Методические указания по использованию ацетиленового метода при селекции бобовых культур на повышение симбиотической азотфиксации. - Л., 1982. - 12 с. 2. Лихочвор В.В., Петриченко В.Ф., Іващук П.В., Корнійчук О.В. Рослинництво. Технології вирощування сільськогосподарських культур / за ред. В.В. Лихочвора, В.Ф. Петриченка. - 3-є вид., випр. - Львів: НВФ "Українські технології", 2010. - 1088 с. 3. Bergey's manual of systematic bacteriology / Boore D.R., Castenholz R.W. editors, Vol. 2: Garrity G.M., editor-in-chief. - 2nd ed. - New York, Berlin, Heidelberg: Springer, 2005. - 2, Part С. 1388 p.). 4. Патент Штам Rhizobium galegae MC-1 №159 (патент України UA (11)51890 (13)A, бюл. № 12, 2002 р. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам Rhizobium galegae Л2 для одержання бактеріального добрива під козлятник східний. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4