Штам бактерій rhizobium phaseoli для підвищення урожайності квасолі звичайної

Реферат: Штам бактерій Rhizobium phaseoli для підвищення урожайності квасолі звичайної та захисту рослин від збудників кореневих гнилей. UA 72367 U (12) UA 72367 U UA 72367 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробних засобів підвищення врожайності бобових культур. Це активний штам бульбочкових бактерій Rhizobium phaseoli B-7319, призначений для виробництва бактеріальних препаратів під квасолю звичайну. Надійним шляхом одержання високоякісних продуктів переробки квасолі є впровадження у виробництво екологічно безпечної технології, яка передбачає підсилення функціонування симбіотичної системи за рахунок використання біопрепаратів на основі високоефективних штамів бульбочкових бактерій виду Rhizobium phaseoli [1-3]. Відомі штами Rhizobium phaseoli 2624, Rhizobium phaseoli 2625, Rhizobium phaseoli 2631, застосування яких для передпосівної обробки насіння квасолі забезпечувало підвищення урожайності культури на 0,13-0,20 т/га порівняно до контролю (без інокуляції). Штами Rhizobium phaseoli ФК 6, Rhizobium phaseoli Φ 13 також підвищували урожайність квасолі на 0,18-0,19 т/га у порівнянні зі штамом-еталоном Rhizobium phaseoli 2627. Ефективність цих штамів перевірялася в зоні Лісостепу України [3]. Однак азотфіксувальна активність зазначених штамів не визначалася за умов високої щільності ґрунтових популяцій ризобій квасолі. Не виявлено також даних щодо впливу цих штамів на продуктивність квасолі в інших регіонах України. Найбільш близьким аналогом до корисної моделі є штам Rhizobium phaseoli 700 (ВКМ 2624). Він активно фіксує молекулярний азот у симбіозі з квасолею, сприяє підвищенню її урожайності, використовується як стандартний штам у наукових дослідженнях [4]. Проте цей штам поступається пропонованому штаму за активністю азотфіксації, здатністю конкурувати з представниками численних місцевих популяцій бульбочкових бактерій Rhizobium phaseoli (конкурентоспроможністю) та здатністю підвищувати урожайність надземної маси та зерна квасолі. В основу корисної моделі поставлена задача отримати новий високоефективний штам бульбочкових бактерій квасолі, який характеризувався би комплексом господарсько-цінних ознак і як біоагент бактеріальних препаратів, забезпечував стабільно високий врожай зерна квасолі звичайної. Поставлена задача вирішується шляхом отримання нового штаму Rhizobium phaseoli B-7319 методом аналітичної селекції. Новий штам вступає в активний симбіоз з квасолею звичайною, посилює фіксацію молекулярного азоту повітря, проявляє високу захисну дію проти кореневих гнилей та суттєво підвищує зернову продуктивність цієї культури. Новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 виділений з численної популяції ризобій квасолі, пристосований до ґрунтово-кліматичних умов України та спроможний витримувати конкуренцію з представниками місцевих популяцій Rhizobium phaseoli. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 виділений з бульбочок квасолі сорту Мавка, яку вирощували на дерново-підзолистому ґрунті в зоні Полісся України (м. Чернігів). рН водне ґрунту - 6,0; вміст гумусу 1,2 %; азоту, що легко гідролізується (за Тюріним і Кононовою) – 57,058,0 мг; Р2О5 – 160,0-165,0 мг і Κ2Ο (за Кірсановим) – 100,0-112,0 мг на 1 кг ґрунту. Пропонований штам ідентифікований за визначником Берджі [5] та депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України (вул. Академіка Заболотного 154, м. Київ) 26 травня 2010 року за реєстраційним номером Rhizobium phaseoli B-7319. Він також зберігається в колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 добре росте на твердому поживному середовищі (гороховий агар) такого складу, г/л: K2НРО4 – 0,5; KН2РО4 - 0,5; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; CaSO4 0,1; (NH4)2MoO4 - сліди; сахароза (цукор) -20,0; відвар гороху - 1л (100г гороху на 1 л води, прокип’ятити 40 хв., профільтрувати), агар-агар - 20,0 г, рН=6,8-7,0. Стерилізація середовища 1,0 атм 30 хв. Культура бактерій швидкоросла (на твердому середовищі колонії з’являються на 2 добу), аеробна. Спор не утворює. Клітини рухомі, мають форму злегка зігнутих паличок, грамнегативні. Штрих на гороховому середовищі слизистий, напівпрозорий, стікає. На чашках Петрі колонії на 3-4 добу росту округлої форми, великі, слизисті, напівпрозорі, діаметр колоній перевищує 2-3 мм. Оптимальна температура росту - 28 °С, рН = 6,8-7,0. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, знижує рН середовища до кислого. На поверхні молока утворює прозору слизисту зону. Желатину не розріджує. Відношення до джерел вуглецю. Штам добре росте на середовищах з сахарозою, глюкозою, лактозою, мальтозою, фруктозою та маннітом, помірно використовує сорбіт. На рідкому середовищі Нориса рН змінюється до 6,0. 1 UA 72367 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відношення до джерел азоту. Штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм. Переважно використовує відновлені форми азоту. На м’ясо-пептонному агарі та м’ясо-пептонному бульйоні не росте. Штам чутливий до більшості досліджених антибіотиків (левоміцетину, амоксициліну, ампіциліну, цефотаксиму, цефтриаксону, цефалексину, цефазоліну, гентаміцину, амікацину, канаміцину, еритроміцину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, поліміксину). Зони затримки росту нового штаму на твердому живильному середовищі відсутні при застосуванні оксациліну та фурадоніну. Ознаки штаму стійкі. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Штам пересівається один раз в 6 місяців і зберігається в лабораторних умовах на твердому бобовому середовищі за температури 4-5 °С. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 забезпечує підвищення урожайності зерна квасолі на 13,6 % порівняно до штаму-прототипу Rhizobium phaseoli 700 і на 35,5 % порівняно до варіанта без бактеризації. Ефективність штаму Rhizobium phaseoli B-7319 перевіряли у вегетаційному та польових дослідах. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. У вегетаційному досліді вивчали вплив бактеризації насіння квасолі сорту Мавка новим штамом Rhizobium phaseoli B-7319 на симбіотичні показники рослинно-мікробної системи. Насіння квасолі інокулювали штамом-прототипом Rhizobium phaseoli 700 та новим штамом ризобій квасолі у розрахунку 200-300 клітин на насінину. Абсолютним контролем слугували рослини не інокульовані бульбочковими бактеріями. Рослини вирощували до фази цвітіння і визначали масу бульбочок, їхню нітрогеназну активність та вміст сухої речовини в надземній масі рослин. Наведені в таблиці 1 дані свідчать, що новий штам Rhizobium phaseoli В-7319 за впливом на показники активності симбіозу переважає штам найближчий аналог Rhizobium phaseoli 700. Інокуляція насіння квасолі штамом Rhizobium phaseoli В-7319 активізує процеси бульбочкоутворення та фіксації молекулярного азоту. Так, у варіанті з бактеризацією цим штамом маса сформованих бульбочок була на 16,2 % вищою, ніж у варіанті із референтним штамом Rhizobium phaseoli 700. За використання штаму Rhizobium phaseoli В-7319 істотно підвищувалася нітрогеназна активність бульбочок порівняно до штаму найближчого аналогу (в 1,4 разу). Вміст сухої речовини в надземній масі рослин зростав відповідно на 37,2 % і 16,5 % порівняно до контролю та штаму-прототипу. Приклад 2. Польові досліди було проведено у 2007-2009 роках на дерново-підзолистому супіщаному ґрунті на фоні численної популяції бульбочкових бактерій квасолі (дослідна ділянка Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН, м. Чернігів). В досліді використовували квасолю сорту Мавка. Насіння квасолі інокулювали штамом найближчого аналогу Rhizobium phaseoli 700 та пропонованим штамом Rhizobium phaseoli В-7319 у розрахунку 200-300 клітин на насінину. Абсолютним контролем слугували рослини не інокульовані бульбочковими бактеріями. Протягом вегетації визначали масу бульбочок, їхню нітрогеназну активність та урожай зерна. У таблиці 2 наведені трирічні дані щодо утворення бульбочок на коренях квасолі у фазі цвітіння за інокуляції насіння штамом найближчого аналогу Rhizobium phaseoli 700 та пропонованим штамом Rhizobium phaseoli В-7319. Незважаючи на спонтанне інфікування рослин представниками місцевої популяції Rhizobium phaseoli, штучна передпосівна інокуляція насіння досліджуваними штамами сприяла інтенсивній нодуляції. Аналіз динаміки бульбочкоутворення показав, що в середньому за три роки кращим мікросимбіонтом для квасолі сорту Мавка виявився новий штам Rhizobium phaseoli В-7319, який сприяв достовірному збільшенню кількості бульбочок порівняно із референтним штамом Rhizobium phaseoli 700 у 1,31,9 разу. Важливим критерієм бобово-ризобіальних взаємовідносин є активність симбіотичної азотфіксації. Як видно з даних таблиці 3, новий штам Rhizobium phaseoli В-7319 активно фіксує азот з повітря при взаємодії з рослинами квасолі. Так, у фазі цвітіння протягом трьох років нітрогеназна активність бульбочок у варіанті з інокуляцією пропонованим штамом була достовірно більшою у 1,3-2,7 разу порівняно до штаму найближчого аналогу Rhizobium phaseoli 700 і в 2,1-3,9 рази порівняно до контролю. Штам Rhizobium phaseoli В-7319 добре проявив себе за умов наявності в ґрунті численних місцевих популяцій бульбочкових бактерій квасолі, що доводить його високу конкурентоспроможність. Як видно з даних таблиці 4, використання нового штаму забезпечує 2 UA 72367 U 5 10 15 20 стабільні прибавки врожайності квасолі в середньому за три роки на 13,6 % порівняно до референтного штаму Rhizobium phaseoli 700 і на 35,5 % порівняно до варіанта без бактеризації. Приклад 3. Здатність штаму Rhizobium phaseoli B-7319 обмежувати розвиток кореневих гнилей квасолі досліджували у польовому досліді в ґрунтово-кліматичних умовах Полісся (2008 p., дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН, м. Чернігів). Тип ґрунту-дерновопідзолистий супіщаний. Сорт квасолі – Мавка. Результати досліду наведені в таблиці 5. Встановлено, що штам Rhizobium phaseoli B-7319 проявляє високу захисну дію проти збудників кореневих гнилей. За інокуляції насіння квасолі сорту Мавка новим пропонованим штамом кількість уражених рослин на початкових етапах онтогенезу (фаза стеблування) зменшувалася на 33,3 %, тоді як за інокуляції штамом прототипом вона була меншою на 13,3 % при 100,0 % ураженні рослин у контрольному варіанті. Захисна дія нового штаму проявлялася ще і у фазі цвітіння (поширення хвороби 93,3 %), коли поширення кореневих гнилей у небактеризованих рослин і за інокуляції штамом Rhizobium phaseoli 700 сягало 100,0 %. Пропонований штам значно стримує розвиток кореневих гнилей, ефективність дії його становить 32,4-40,7 %, що в середньому за вегетаційний період у 2,3 разу перевищує біологічну ефективність штаму-прототипу Rhizobium phaseoli 700 - 11,8-25,9 %. Таким чином, штам Rhizobium phaseoli B-7319 є активним симбіотичним азотфіксатором, спроможним активно колонізувати кореневу систему квасолі за умов наявності у ґрунті численних популяцій ризобій квасолі. Він здатний інтенсифікувати процеси біологічної азотфіксації, формувати системну стійкість рослин щодо збудників кореневих гнилей і відрізняється більш високою ефективністю у порівнянні зі штамом-прототипом. Таблиця 1 Вплив інокуляції новими штамами Rhizobium phaseoli на активність симбіотичної азотфіксації та продуктивність квасолі сорту Мавка (вегетаційний дослід, 2006 р.) Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам найближчий аналог Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B7319 НІР05 Маса бульбочок, г/рослину Нітрогеназна активність, мкг N/рослину/год 0,63 4,50 Вміст сухої речовини в надземній масі рослин, г/рослину 1,13 0,74 8,52 1,33 0,86 11,87 1,55 0,06 2,67 0,13 Таблиця 2 Вплив штамів Rhizobium phaseoli на формування бульбочок на коренях квасолі сорту Мавка (польові досліди, 2007-2009 pp.) Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам найближчий аналог Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 НІР05 25 3 Кількість бульбочок, од./рослину 2007 2008 2009 19,17 44,25 62,25 22,83 53,13 75,00 44,17 99,38 100,63 3,40 8,58 6,73 UA 72367 U Таблиця 3 Вплив інокуляції квасолі штамами Rhizobium phaseoli на активність симбіотичної азотфіксації (польові досліди, 2007-2009 pp., дерново-підзолистий ґрунт) Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам найближчий аналог Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 НІР05 Активність азотфіксації, мкг N/рослину/год. 2007 2008 2009 3,97 26,83 31,65 5,75 43,38 49,79 15,75 57,32 83,42 1,51 7,62 10,83 Таблиця 4 Вплив інокуляції Rhizobium phaseoli на насіннєву продуктивність квасолі сорту Мавка (польові досліди, 2007-2009 pp., дерново-підзолистий ґрунт) Приріст урожаю, % Урожайність, т/га Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам найближчий аналог Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B7319 HIP05 2007 2,81 2008 2,37 2009 1,83 Середнє 2,34 3,66 2,62 2,09 2,79 100,0 4,01 3,08 2,42 3,17 113,6 0,28 0,45 0,30 Таблиця 5 Вплив інокуляції на ураженість квасолі сорту Мавка кореневими гнилями (польовий дослід, 2008 p., дерново-підзолистий ґрунт) Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам найближчий аналог Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 НІР05 Стеблування 1 2 3 100,0 39,2 1 100,0 Цвітіння 2 56,7 3 86,7 34,2 12,8 100,0 50,0 11,8 100,0 50,0 25,9 66,7 23,3 40,4 93,3 38,3 32,4 100,0 40,0 40,7 9,4 4,7 Fф