Спосіб оцінки токсичного ураження печінки щурів за розвитку оксидаційного стресу

Частина 1, 2013 - С. 83-87). Заявлений спосіб і найближчий аналог мають спільні суттєві ознаки, а саме: базується на аналізі стану системи антиоксидантного захисту у тварин за активністю ферментів крові: каталази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази у крові тварин. Недоліком даного способу є недостатня його точність, оскільки він не повністю враховує механізм розвитку оксидативного стресу на організм тварин, зокрема на антиоксидантну систему організму, оскільки за показниками активності перерахованих вище ферментів можна судити лише про знешкодження перекису водню, а провідною ланкою в процесі активації вільнорадикальних реакцій, у тому числі і перекисного окиснення ліпідів, що призводить до деструкції мембран клітин, є супероксидний радикал. Він є стартовим радикалом запуску цілого ряду вільнорадикальних реакцій, у результаті яких можуть утворитись гідроксильний радикал, синглетний кисень, пероксид водню, гідропероксидний радикал, пероксирадикали жирних кислот та інші. Тому для більш точної оцінки токсичного ураження печінки за розвитку оксидативного стресу на антиоксидантну систему організму тварин доцільно додатково досліджувати і активність супероксиддисмутази, яка приймає участь у знешкодженні супероксидного радикалу, таким чином запобігаючи розвитку оксидаційного стресу. Заявлений нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога, враховує стан антиоксидантної системи крові тварин і забезпечує об'єктивну оцінку ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм тварин. В основу корисної моделі поставлена задача - розробити точний і об'єктивний спосіб оцінки токсичного ураження печінки щурів за розвитку оксидаційного стресу, зручний і доступний у застосуванні. Поставлена задача вирішується тим, що у способі оцінки токсичного ураження печінки щурів за розвитку оксидаційного стресу проводять шляхом оцінки стану системи антиоксидантного 1 UA 106773 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 захисту за активністю ферментів крові, згідно з корисною моделлю, додатково визначають ферментну активність супероксиддисмутази і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи судять про ступінь негативного впливу токсичного ураження печінки за розвитку оксидаційного стресу, при цьому: - тварин, у яких активність супероксиддисмутази, каталази та глутатіонпероксидази знаходиться у межах фізіологічних величин, вважають клінічно здоровими; - тварин, у яких активність супероксиддисмутази знаходиться у межах 1,54-1,11 ум. од., каталази - 6,76-5,10 мкмоль/хв. л та глутатіонпероксидази 0,28-0,11 ммоль/хв. г гемоглобіну, вважають частково ураженими за розвитку оксидаційного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму, застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварин, у яких активність супероксиддисмутази є меншою 1,10 ум. од., активність каталази є меншою 5,10 мкмоль/хв. л, глутатіонпероксидази - меншою 0,10 ммоль/хв. г гемоглобіну, вважають ураженими за розвитку оксидаційного стресу з явищами незворотного порушення обміну речовин. Розвитку оксидаційного стресу запобігає багатокомпонентна система антиоксидантного захисту. Велику роль відіграє каталаза, глутатіонова система (глутатіонредуктаза, глутатіонпероксидаза), супеоксиддисмутаза. Каталаза відновлює перекис водню до води, глутатіонпероксидаза - каталізує розклад гідроперекисів ліпідів нерадикальним шляхом за допомогою глутатіону відновленого, а саме каталізує розпад перекису водню і окислює глутатіон. Глутатіонпероксидаза разом з іншими антиоксидантами сприяє видаленню первинних продуктів частково редукованого кисню. При високій інтенсивності утворення перекису водню в організмі тварин знешкодження цієї сполуки припадає на каталазу, а при низьких - на глутатіонову антиоксиданту систему. Супероксиддисмутаза є ключовим ферментом антирадикального захисту. Вона дисмутує супероксидрадикал до менш токсичного перекису водню. Залежно від мікроелементу, що знаходиться в активному центрі ферменту, виділяють Fe-, Zn-Cu- та Mn-залежні супероксиддисмутази. Метали виконують каталітичну функцію. Вони послідовно відновлюються і окиснюються в активному центрі ферменту. Fe-залежна супероксиддисмутаза у більшій кількості знаходиться в еритроцитах, Zn-Cu-залежна у цитоплазмі, а Мn-залежна у мітохондріях. Супероксиддисмутаза знаходиться головним чином у внутрішньоклітинному просторі (мітохондріальному матриксі та цитозолі) та в цитоплазмі. У меншій кількості супероксиддисмутаза знаходиться у лізосомах та мітохондріальному міжмембранному просторі, а також у зовнішньоклітинній рідині. Вказані форми супероксиддисмутаз беруть участь в біологічних реакціях, що забезпечують дисмутацію супероксидного аніону, безпосереднього метаболіту кисню, який діє на перекиси. Активність супероксиддисмутази детермінується інтенсивністю радикалоутворення і залежить від рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів у клітині. Доведено, що нагромадження токсичних перекисних продуктів (перекисів жирних кислот і альдегідів) пригнічує активність супероксиддисмутази та інших антиоксидантних ферментів. Оскільки супероксиддисмутаза утилізує активні форми кисню з утворенням перекису водню, важливим для життєздатності клітини є встановлення балансу між активністю супероксиддисмутази та ферментами, які окиснюють перекис водню (каталаза, глутатіонпероксидаза). Необхідно відзначити, що занадто швидке підвищення в клітині активності супероксиддисмутази, без відповідної активації каталази або пероксидаз, само по собі є цитотоксичним. Отже, наведені інформативні дані свідчать, що зазначений нами спосіб забезпечує більш точну оцінку токсичного ураження печінки щурів за розвитку оксидаційного стресу, ніж найближчий аналог. Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної токсикології, а саме до способів оцінки токсичного ураження печінки щурів за розвитку оксидаційного стресу. Заявлений спосіб може бути використаний з метою профілактики оксидаційного стресу у сільськогосподарських тварин, а тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність" Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Для оцінки токсичного ураження печінки щурів за розвитку оксидаційного стресу визначають каталазу (за методом Баха і Зубкової), глутатіонпероксидазу (за методом В.В. Лемешко і ін., Н. Siens), супероксиддисмутазу (за методом Чвари С і ін.). Аналіз одержаних результатів здійснюють наступним чином: - тварин, у яких активність супероксиддисмутази, каталази та глутатіонпероксидази знаходиться у межах фізіологічних величин, вважають клінічно здоровими; 2 UA 106773 U 5 10 15 20 25 30 - тварин, у яких активність супероксиддисмутази знаходиться у межах 1,54-1,11 ум. од., каталази - 6,76-5,10 мкмоль/хв. л та глутатіонпероксидази 0,28-0,11 ммоль/хв. г гемоглобіну, вважають частково ураженими за розвитку оксидаційного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму, застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварин, у яких активність супероксиддисмутази є меншою 1,10 ум. од., активність каталази є меншою 5,10 мкмоль/хв. л, глутатіонпероксидази - меншою 0,10 ммоль/хв. г гемоглобіну, вважають ураженими за розвитку оксидаційного стресу з явищами незворотного порушення обміну речовин. Ефективність заявленого способу та його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання. Дослідження проводили на самцях щурів лінії Вістар масою тіла 120-130 г, яких утримували у стандартних умовах віварію. Тварини були поділені на 2 групи (по 6 тварин): 1 - інтактні тварини; 2 - щурі, яким вводили тетрахлорметан при згодовуванні стандартного раціону. Тетрахлорметан (ТХМ) є сильним гепатотоксичним агентом. Механізм токсичного впливу чотирихлористого вуглецю на живі організми добре вивчений. При отруєнні ТХМ максимальна концентрація його у крові виявляється через 2-4 год., а через 6 год. він повністю переходить у печінку, головний мозок, жирову тканину, нирки й інші органи. В основі пошкоджуючої дії чотирихлористого вуглецю лежить здатність молекули ТХМ розщеплюватися на мембранах ендоплазматичної сітки з утворенням радикалів ССl3, який ковалентно зв'язується з білками і ліпідами, та ССl3О2, який ініціює у клітині процеси перекисного окиснення ліпідів. Утворені радикали порушують нормальне функціонування дихального ланцюга, що призводить до утворення активних метаболітів кисню (АМК), які посилюють дію ТХМ. Інтенсифікація окиснювальних процесів, порушення збалансованості антиоксидантної та прооксидантної систем, дефіцит антиоксидантів приводить до розвитку оксидативного стресу. Система антиоксидантного захисту організму тварин відповідає за регуляцію інтенсивності утворення вільних радикалів та знешкодження продуктів перекисного окиснення ліпідів. Слід відзначити, що дана система складається з ензимної і неензимної ланки. Важливою у системі антиоксидантного захисту є глутатіонзалежна ланка цієї системи, яка включає ензим глутатіонпероксидазу. Як видно з даних таблиці, під впливом тетрахлорметану активність глутатіонпероксидази печінки знижувалася протягом усього досліду. Найнижчу активність згаданого вище ензиму, який досліджувався, встановлено на 8-у та 16-у доби досліду, де відносно величин контрольної групи тварин, показники були нижчі на 39 і 45 %. Таблиця Стан антиоксидантної системи щурів за отруєння тетрахлоретаном (M±m, n=6) Показник ГП печінки, ммоль/(хв.•кг) ГП сироватки, ммоль/хв. г гемоглобіну СОД печінки, ум. од./мг СОД сироватки, ум. од. Каталаза печінки, мкмоль/хв. мг білка Каталаза сироватки, мкмоль/хв. л контрольна Група тварин дослідна; доба експерименту 8 16 24 1 30 23,29±0,21 17,29±0,38** 14,19±0,35** 12,80±0,36** 18,24±0,46* 21,41±0,45* 0,28±0,025 0,24±0,011 0,20±0,015** 0,11±0,010** 0,15±0,012** 0,19±0,010** 0,615±0,014 0,521±0,013** 0,497±0,014** 0,450±0,014** 0,560±0,014** 0,582±0,015 1,54±0,009 1,47±0,009** 1,35±0,008** 1,11±0,007** 1,21±0,006** 1,32±0,007** 0,125±0,005 0,119±0,005** 0,104±0,004** 0,092±0,005** 0,098±0,003** 0,110±0,005* 6,76±0,40 6,41±0,35 5,76±0,34* 5,13±0,30* 5,43±0,30* 6,12±0,35 Примітка: ступінь вірогідності порівняно з даними контрольної групи -р