Спосіб одержання засобу з антимікробною та протизапальною активністю з пагонів багна звичайного

Реферат: Спосіб одержання засобу з антимікробною та протизапальною активністю, що включає екстракцію рослинної сировини гарячою водою, фільтрацію, упарювання, очищення та сушіння, причому як рослинну сировину використовують пагони багна звичайного після виділення ефірної олії, екстракцію проводять послідовно і 50 % розчином етанолу при співвідношенні сировини і екстрагенту як 1:(3-9), упарювання одержаного рідкого екстракту проводять до 1/201/22 попереднього об'єму, очищення здійснюють шляхом відстоювання та відокремлення надосадової рідини, яку потім піддають стерилізації. UA 108576 C2 (12) UA 108576 C2 UA 108576 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до хіміко-фармацевтичної галузі, зокрема до одержання біологічно активних засобів рослинного походження з антимікробною та протизапальною активністю з пагонів багна звичайного після одержання ефірної олії. Відомий спосіб одержання засобу з анаболізуючою активністю [1], прийнятий за прототип. Зазначений спосіб полягає у екстракції суцвіть деревію дистильованою водою у співвідношенні 1:10 послідовно 4 рази при 80 °C, кожен раз протягом 35 хвилин. Одержані екстракти об'єднують, концентрують до половини об'єму, проводять очищення на сорбенті з суміші поліаміду і активованого вугілля у співвідношенні 1:0,2 та піддають ліофілізованому сушінню . -1 протягом 20-26 годин у сублімаційному апараті зі зниженням тиску від атмосферного до 5 10 . -2 5 10 мм рт. ст. і відповідно зниженням температури від -35 до -50 °C через 1-1,5 години. Через 16 годин після початку сушіння температуру поступово підвищують до +40 °C. Недоліками способу за прототипом можна вважати необхідність виготовлення спеціально призначеного для нього нестандартного сорбенту, а також використання ліофілізованого сушіння при значній зміні тиску та перепаді температур у 95 °C. При цьому одержаний продукт характеризується односпрямованістю фармакологічної дії. Задачею винаходу є створення способу одержання засобу рослинного походження з антимікробною та протизапальною активністю, який передбачає послідовну екстракцію пагонів багна звичайного водою та 50 % розчином етанолу після одержання ефірної олії, при цьому готовий продукт має розширений спектр фармакологічної дії, а використання заявленого способу для комплексної переробки сировини забезпечить безвідхідний процес одержання ефірної олії і додатково нового засобу з антимікробною та протизапальною активністю, що позитивно вплине на собівартість одержання обох засобів і дозволить вичерпно використати сировину. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання засобу з антимікробною та протизапальною активністю, що включає послідовну екстракцію рослинної сировини гарячою водою та 50 % розчином етанолу, фільтрацію, упарювання, очищення, стерилізацію та сушіння. Винаходом передбачено, що як рослинну сировину використовують пагони багна звичайного, з якого у стандартних промислових умовах методом гідродистиляцій при температурі 100 °C протягом 4 годин одержують ефірну олію при співвідношенні сировини і екстрагенту 1:10, при цьому паралельно водою очищеною екстрагують біологічно активні речовини (БАР) та проводять подальше настоювання протягом 12 годин. Водну витяжку відділяють, фільтрують та шрот після виділення ефірної олії екстрагують 50 % розчином етанолу у співвідношенні 1:3 тричі. Водну та спиртові витяжки об'єднують, фільтрують та упарюють до 1/20-1/22 попереднього об'єму, очищення проводять шляхом відстоювання у холодильнику та відокремлення надосадової рідини, яку піддають стерилізації та сушать до сухого екстракту у вакуум-розпилювальній сушарці. Експериментальним шляхом встановлено, що ефективним при здійсненні заявленого способу є використання співвідношення сировини і екстрагенту як 1:3-1:9. При цьому, якщо співвідношення менше 1:3, не забезпечується достатня екстракція БАР, що приводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Навпаки, якщо співвідношення більше 1:9, це веде до ускладнення та подовження технологічного процесу, час упарювання та енерговитрати значно зростають. Оптимальне співвідношення 1:3-1:4 тричі тому, що забезпечується достатня екстракція БАР, час упарювання мінімальний та дозволяє отримувати екстракт на стандартному обладнані без додаткового перезавантаження первинної сировини. Очистку екстракту в процесі здійснення заявленого способу проводять шляхом відстоювання в холодильнику, що забезпечує осадження механічних включень та гідрофобних речовин. Відстоювання в холодильнику також запобігає прокисанню водного екстракту. Згідно з заявленим способом упарювання проводять до 1/20-1/22 первинного об'єму. При більшому упарюванні залишок має більшу в'язкість та зменшується його текучість, що ускладнює роботу з екстрактом та збільшує його втрати в процесі виробництва. При меншому упарюванні значно подовжується процес сушіння, наприклад в вакуум-розпилювальному апараті, та збільшуються енерговитрати. Одержаний після упарювання екстракт стерилізують будь-яким зручним у промислових умовах способом, наприклад в автоклаві при 120 °C протягом 3-4 годин. Стерилізація забезпечує усунення мікробної контамінації та спор мікроорганізмів, що підвищує якість продукту, безпечність при його застосуванні та збільшує строк збереження. Стерилізований екстракт сушать, наприклад, в вакуум-розпилювальному апараті при температурі на вході 160 °C та на виході 80-90 °C, до сухого екстракту. 1 UA 108576 C2 5 10 15 20 25 30 35 Заявлений спосіб здійснюють шляхом одержання з пагонів багна звичайного методом гідродистиляції при температурі 100 °C протягом 4 годин ефірної олії за стандартних умов при співвідношенні сировини і екстрагенту 1:10 [2], при цьому паралельно водою очищеною здійснюється екстракція гідрофільного комплексу БАР, після зі шроту 50 % розчином етанолу екстрагують витяжку, яку об'єднують з водним, фільтрують, упарюють до 1/20-1/22 попереднього об'єму з подальшим відстоюванням у холодильнику. Надосадову рідину зливають та стерилізують. Екстракт являє собою прозору рідину темно-коричневого кольору, зі специфічним запахом. Далі водний розчин упарюють до одержання сухого екстракту. Вихід готового продукту 15-20 %. Одержаний сухий екстракт - гігроскопічний порошок від світлокоричневого до коричневого кольору, зі специфічним запахом. Колір залежить від якості сировини та умов сушіння. Отриманий готовий екстракт містить не менше ніж: 15 % поліфенольних сполук в перерахунку на галову кислоту; 2 % гідроксикоричних кислот в перерахунку на хлорогенову кислоту; 3 % флавоноїдних сполук в перерахунку на рутин. Винахід ілюструється прикладами: Приклад 1. 1 кг подрібненого шляхом вальцювання до розмірів часток 2,5-3,0 мм сухого пагонів багна звичайного заливали 10 л води очищеної та методом гідродистиляції протягом 4 годин при 100 °C виділяли ефірну олію. Сировину залишали для настоювання протягом 12 годин. Одержали 7,3 л водної витяжки. До шроту, який залишився, додавали 3,0 л 50 % розчину етанолу та настоювали при кімнатній температурі протягом доби, екстракцію повторювали тричі з новою порцією екстрагенту. Одержані спиртові (8,95 л) та водну витяжки (7,30 л) об'єднували, упарювали при температурі 85 °C під вакуумом у вакуум-циркуляційному апараті при розрідженні 690 мм рт. ст. до об'єму водного залишку 1 л. Кубовий залишок являв собою густу прозору темно-коричневу рідину, яку залишали для відстоювання на 2 доби в холодильнику. Відокремлену надосадову рідину стерилізували та сушили у розпилювальній сушарці з температурою теплоносія на вході 160 ºС і на виході - 85 °C до сухого екстракту. Вихід готового продукту - 17,2 %. Приклад 2. Вивчення антибактеріальної активності екстракту проводили методом дифузії в агар в Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова в лабораторії біохімії мікроорганізмів та живильних середовищ під керівництвом канд. біол. н. Осолодченко Т.П. [3, 4]. Відповідно до рекомендацій ВООЗ для оцінки активності препаратів використовували референс-штами Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus 6538 ATCC, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris NCTC 4636, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Pseudomonas aeruginosa 9027 ATCC, Basillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans 885/653 ATCC. Для аналізу використовували 1 % водні розчини екстракту. Екстракт з пагонів багна звичайного виявляє антибактеріальну дію відносно різних таксономічних груп мікроорганізмів (табл.). Таблиця Дослідження антибактеріальної активності екстракту з пагонів багна звичайного методом дифузії в агар Мікроорганізми S. aureus 25923 ATCC S. aureus 6538 ATCC E. coli 25922 ATCC P. vulgaris 4636 NCTC P. aeruginosa 27853 ATCC P. aeruginosa 9027 ATCC B. subtilis 6633 ATCC С. albicans 885/653 ATCC 40 45 Зона затримки росту мікроорганізму, мм 20±1 22+1,5 17+0,5 15±1 17+0,5 15+1,5 13+0,5 17+0,5 Приклад 3. Протизапальну активність сухого екстракту з пагонів багна звичайного, одержаного за заявленим способом, вивчали у дослідах на білих мишах масою 17-22 г на моделі формалінового набряку [3, 4]. Препаратом порівняння вибрали вольтарен. Дослідні тварини поділили на три групи: контрольна, група, яку лікували новим екстрактом з пагонів багна звичайного, та лікована препаратом порівняння. Ступінь протизапальної активності нового засобу оцінювали за антиексудативним ефектом. Для відтворення гострого асептичного ексудативного запалення використовували як флоген 2 % розчин формаліну, який вводили субплантарно в кількості 0,05 мл через 1 годину після 2 UA 108576 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 перорального введення досліджуваного екстракту з пагонів багна звичайного, препарату порівняння вольтарену і у контрольній групі - води. Активність досліджуваних засобів вивчали за їх здатністю зменшувати розвиток набряку в порівнянні з контролем. Отримані на моделі формалінового набряку у мишей результати свідчать про виражену протизапальну активність сухого екстракту з пагонів багна звичайного, отриманого шляхом комплексної переробки. Максимальний антиексудативний ефект екстракту 61,05 % спостерігався у дозі 30 мг/кг. Приклад 4. Нешкідливість сухого екстракту з пагонів багна звичайного, одержаного за заявленим способом, оцінювали за рівнем гострої токсичності після однократного внутрішлункового введення в дозах 5 і 10 г/кг здоровим білим нелінійним мишам. Спостереження за тваринами проводили протягом 14 діб [3, 4]. Встановлено, що введення екстракту пагонів багна звичайного в максимальних дозах (10 г/кг) не викликає клінічно обумовлених симптомів інтоксикації й не приводить до летальних випадків. Таким чином, екстракт пагонів багна звичайного характеризується високим рівнем нешкідливості й по класифікації токсичності належить до V класу токсичності - практично нетоксичних лікарських речовин [4]. Таким чином заявлено новий спосіб одержання засобу з антимікробною та протизапальною активністю, який відзначається рядом переваг: 1) простота виконання та можливість здійснення на стандартному обладнанні в промислових умовах України; 2) використання як екстрагента води та 50 % розчину етанолу, тобто спосіб доступний, екологічно безпечний, дешевий, такий, що не вимагає роботи з отруйними, вогненебезпечними й шкідливими для здоров'я людини реактивами; 3) використання як сировини пагонів багна звичайного після виробництва ефірної олії, що дозволяє комплексно переробляти дану рослинну сировину, більш раціонально використати природні ресурси, підвищити рентабельність виробництва та зменшити його негативний вплив на навколишнє середовище; 4) наявність вираженої антимікробної та протизапальної активності екстракту з пагонів багна звичайного, одержаного за заявленим способом; 5) перспективність використання одержаного екстракту як лікарської субстанції для одержання різних лікарських форм; 6) нетоксичність екстракту, одержаного за заявленим способом, дозволяє використовувати його довгостроково при лікуванні за рекомендацією лікаря; 7) тривалий термін зберігання засобу, одержаного заявленим способом. Джерела інформації: 6 1. Пат. № 2026076 РФ МКИ А61K35/78. Способ получения средства, обладающего анаболической активностью / А.В. Мазулин, Н.А. Калошина, В.И. Мозуль, Г.Н. Липкан. - № 4914474/14; Заявл. 25.02.91; Опубл. 10.01.95, Бюл. № 1. 2. Державна Фармакопея України / ДП "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. - Доповнення 2. - Харків: ДП "Науково-експертний фармакопейний центр", 2008. - 620 с. 3. Доклінічні дослідження лікарських засобів: Метод, рекоменд. / За ред. чл.-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К.: Здоров'я, 2001. - С. 292-306. 4. Експериментальне вивчення токсичної дії потенціальних лікарських засобів. Методичні рекомендації / Коваленко В.М., Стефанов О.В., Максимов Ю.М., Трахтенберг І.М. // В сб.: Доклінічні дослідження лікарських засобів. Ред. О.В. Стефанов. - К.: МОЗ України, Державний фармакологічний центр, 2001. - С. 74-97. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 Спосіб одержання засобу з антимікробною та протизапальною активністю, що включає екстракцію рослинної сировини гарячою водою, фільтрацію, упарювання, очищення та сушіння, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують пагони багна звичайного після виділення ефірної олії, екстракцію проводять послідовно і 50 % розчином етанолу при співвідношенні сировини і екстрагенту як 1:(3-9), упарювання одержаного рідкого екстракту до 1/20-1/22 попереднього об'єму, очищення шляхом відстоювання та відокремлення надосадової рідини, яку піддають стерилізації. 3 UA 108576 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4