Спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії

Реферат: Спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії включає проведення лабораторної оцінки вираженості та динаміки бактеріально-індукованого токсикозу по показникам наявності в крові його продуктів, причому як показники ендотоксикозу вибирають показники внутрішньочеревної контамінації, синдрому кишкової недостатності і збільшення бактеріальної токсинемії; про показники внутрішньочеревної контамінації судять по якісній експрес-оцінці рівня бактеріальної засіяності ексудату шляхом проведення модифікованого ТТХ-тесту, синдрому кишкової недостатності - по якісній експрес-оцінці рівня абдомінального ендотоксикозу шляхом гель-тромб LAL-тесту і при позитивній якісній оцінці ТТХ-тесту констатують засіяність ексудату патогенною флорою більше 100000 МТ/мл, а при позитивній якісній оцінці гель-тромб LAL-тесту констатують вміст бактеріальних ендотоксинів вище 0,25 ОЕ/мл. UA 110389 U (12) UA 110389 U UA 110389 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хірургії, зокрема гнійної, і може бути використана для експресдіагностики бактеріально-індукованого ендотоксикозу і динаміки його розвитку, зокрема з розвитком гнійно-септичних ускладнень. Відомий спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії за патентом № 2528880 (RU, заявл. 18.07.2013, опубл. 20.09.2014, Способ определения показаний к операции программированной санационной релапаротомии при перитоните). Він включає проведення лабораторної оцінки вираженості та динаміки бактеріально-індукованого абдомінального токсикозу по рН ексудату, який забирають після виконання лапаротомії із черевної порожнини. При цьому, якщо рН має значення 6,5 і менше, констатують закислення ексудату і наявність анаеробної флори. Це розцінюють як підставу для проведення санаційної релапаротомії. Спосіб дозволяє прямо і швидко за допомогою дослідження абдомінального ексудату контролювати зміну мікрофлори черевної порожнини, припускаючи її транслокацію з оперованого травного тракту. Але він є досить приблизним, оскільки не дозволяє точно верифіцирувати джерело зміни рН та характер мікробної флори, її кількість і ступінь вторинного ендотоксикозу, який визначає вираженість перебігу і тяжкості перитоніту. Слід зауважити, що закислення абдомінального ексудату відбувається, коли мікробна флора черевної порожнини вже суттєво змінилася в бік анаеробної мікрофлори, тобто не на ранніх етапах розвитку кишкової транслокації. Відомий також спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії за патентом № 2427318 (RU, заявл. 16.03.2010, опубл. 27.08.2011, Способ интраоперационного определения показаний к проведению этапного хирургического лечения при распространенном перитоните). Він включає проведення лабораторної оцінки вираженості та динаміки бактеріально-індукованого абдомінального токсикозу по показникам кількості мікроорганізмів в ексудаті. Для його виявлення забирають 1 мл ексудату і виконують проточну флуоресцентну цитометрію. При виявленні більше 1000 мікроорганізмів в 1 мкл ексудату вважають, що наявний розвинутий перитоніт і необхідно провести етапну санаційну релапаротомію. Якщо виявлено менше 1000 мікроорганізмів в 1 мкл ексудату, вважають санаційну релапаротомію недоцільною. Спосіб дозволяє прямо по мікробному числу діагностувати наявність значної бактеріальної засіяності черевної порожнини, що є достовірним показником розвинутого перитоніту. Але спосіб надто тривалий, не вказує на характер мікрофлори і не відображує ступінь абдомінального ендотоксикозу на ранніх стадіях розвитку і його вплив на загальний стан хворого, зокрема на можливу токсинемію. Найбільш близьким до корисної моделі є спосіб діагностики перебігу післяопераційного періоду після абдомінальних операцій з формуванням синдрому кишкової недостатності і накопичуванням ендотоксинів (див. Пат. № 2480756, G01N, заявл. 10.02.2011, опубл. 20.08.2012, Способ прогнозирования течения послеоперационного периода у больных с перитонитом). Він включає проведення лабораторної оцінки вираженості та динаміки бактеріально-індукованого токсикозу по показникам наявності в крові продуктів ендотоксикозу, а саме показникам наявності в крові летючих жирних кислот (ЛЖК) - оцтової, пропіонової і масляної кислоти. Ці показники визначають газохроматографічним методом, щоденно в перші 3 доби і, якщо концентрація їх хоча б в одному з досліджень підвищується до рівня оцтової кислоти від 0,19000 ммоль/л і вище, пропіонової кислоти від 0,00018 ммоль/л і вище і масляної кислоти від 0,0008 ммоль/л і вище, констатують наявність ендотоксикозу і прогнозують можливість несприятливого перебігу перитоніту. Спосіб дозволяє контролювати ранні стадії (з перших 2-3 днів) зростання концентрації летючих жирних кислот (ЛЖК) в крові, які є продуктом мікробної ферментації вуглеводів, жирів та білків кишкового вмісту, тобто характеризують процес швидкого розмноження внутрішньокишкової інфекції з розвитком неспроможності печінкового дезінтоксикаційного бар'єру і надходженням метаболітів анаеробних бактерій в кровоносне русло. Відстеження динаміки цих показників забезпечує можливість індивідуального прогнозу перебігу захворювання. Але слід зауважити, що висновок про стан хворого, а тим більше про зональну активацію інфекційно-запального процесу в черевній порожнині, здійснюється за непрямими даними на основі аналізу продуктів, які всмоктуються в кишечнику, а не в самій черевній порожнині. Таким чином, вони відображують ендотоксикоз, а не розвиток перитоніту. До того ж, ЛЖК, які спостерігають, є енергетичним субстратом кишкових епітеліальних клітин. Він підвищує проліферативну активність епітелію кишечнику, що підвищує захисну бар'єрну функцію епітелію для транслокації мікробів. В той же час ЛЖК пригнічує всі ланки місцевої імунної реактивності кишечнику та виробку прозапальних медіаторів (активність кишкового бар'єрного імунітету). ЛЖК через портальну вену надходять до печінки, де зв'язуються пероксомами гепатоцитів і їх 1 UA 110389 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 концентрація в крові, що відтікає, відображує утилізаційну спроможність гепатоцитів. Таким чином, концентрація ЛЖК в периферичній крові відображує підвищену бар'єрну функцію кишкового епітелію та функціонально-дезінтоксикаційну здатність гепатоцитів, а не перебіг перитоніту. В основу корисної моделі поставлена задача створити прямий спосіб відстеження появи та розвитку транслокації бактерій і їх токсинів в черевну порожнину на перших стадіях розвитку абдомінального ендотоксикозу (з перших часів післяопераційного періоду) шляхом визначення їх наявності та динаміки в абдомінальному ексудаті, а також граничних значень, при яких абдомінальний процес стає осередком токсинемії. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії, який включає проведення лабораторної оцінки вираженості та динаміки бактеріально-індукованого токсикозу по показникам наявності в крові його продуктів, згідно з корисною моделлю, як показники ендотоксикозу вибирають показники внутрішньочеревної контамінації, синдрому кишкової недостатності і збільшення бактеріальної токсинемії; про показники внутрішньочеревної контамінації судять по якісній експрес-оцінці рівня бактеріальної засіяності ексудату шляхом проведення модифікованого ТТХ-тесту, синдрому кишкової недостатності - по якісній експрес-оцінці рівня абдомінального ендотоксикозу шляхом гель-тромб LAL-тесту і при позитивній якісній оцінці ТТХ-тесту констатують засіяність ексудату патогенною флорою більше 100000 МТ/мл, а при позитивній якісній оцінці гель-тромб LAL-тесту констатують вміст бактеріальних ендотоксинів вище 0,25 ОЕ/мл. Доцільно додатково кожні 12 годин проводити кількісну експрес-оцінку рівня ендотоксинів в ексудаті шляхом кінетичного турбидиметричного LAL- тесту і при збільшенні рівня ендотоксинів в абдомінальному ексудаті у порівнянні з показниками якісного тесту та появі прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові констатувати розвиток бактеріальної токсинемії та її динаміку. Також доцільно при досягненні рівня ендотоксинів в абдомінальному ексудаті 1,0-2,0 ОЕ/мл, а рівня прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові 2,8±0,2 нг/мл констатувати розвиток гнійно-септичного ускладнення і необхідність невідкладної оперативної санації первинного осередку інфекції. Вибір показників внутрішньочеревної контамінації, синдрому кишкової недостатності і збільшення бактеріальної токсинемії для оцінки вираженості та динаміки бактеріальноіндукованого токсикозу дозволяє по прямим показникам визначити розвиток перитоніту на ранніх стадіях неспроможності кишкової стінки і післяопераційних швів на ній (по появі в ексудаті патогенних інфекційних агентів та їх токсинів). Якісна експрес-оцінка рівня бактеріальної засіяності абдомінального ексудату як показника внутрішньочеревної контамінації шляхом проведення модифікованого ТТХ-тесту дозволяє швидко отримати дані про появу транслокації патогенної кишкової мікрофлори в черевну порожнину. Сам тест простий, не потребує додаткових устаткування та кваліфікації персоналу. Якісна експрес-оцінка рівня абдомінального ендотоксикозу шляхом гель-тромб LAL-тесту дозволяє швидко виявити мінімальну кількість бактеріального ендотоксину, яке указує на розвиток запального процесу в черевній порожнині. LAL-тест - це ферментативна реакція LALреактиву з ендотоксином, в результаті якої утворюється щільний гель. Його перевагою є відносна простота аналізу, надійність, швидкість отримання результату, специфічність і висока чутливість до ендотоксинів гам-негативних бактерій. Граничні значення засіяності ексудату патогенною флорою, які виявляються зазначеними тестами, свідчать про початок розвитку інфекційного запального процесу в черевній порожнині. Проведення кожні 12 годин кількісної експрес-оцінки рівня ендотоксинів в ексудаті шляхом кінетичного турбідиметричного LAL- тесту дозволяє у порівнянні з первинним станом та попередніми аналізами достовірно спостерігати динаміку розвитку запального процесу в черевній порожнині, а паралельне дослідження сироватки або плазми крові на наявність прокальцитоніну дає змогу зафіксувати початок розвитку гнійно-запальних ускладнень. Максимальне граничне значення рівня ендотоксинів в ексудаті та прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові (рівня ендотоксинів в абдомінальному ексудаті 1,0-2,0 ОЕ/мл, а рівня прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові 2,8±0,2 нг/мл) свідчить про розвиток гнійносептичного ускладнення і необхідність невідкладної оперативної санації первинного осередку інфекції. Заявнику невідомі приклади прямого дослідження абдомінального ексудату з метою експрес-діагностики ступеня бактеріальної засіяності і рівня ендотоксикозу. Вибрані для цього LAL-тести використовувалися раніше для контролю якості лікарських засобів, пірогенності лікарських препаратів, а ТТХ-тест - для контролю підвищеної бактеріурії в сечі. Послідовність 2 UA 110389 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виконання цих тестів і оцінки їх результатів складається в діагностичну систему, яка дозволяє відстежувати основні патогенетичні ланки розвитку післяопераційного перитоніту. Максимальне граничне значення рівня ендотоксинів в ексудаті та прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові отримане авторами в процесі власних досліджень і є невідомим на момент подачі заявки. Кожний із тестів використовується оригінально, а послідовність їх використання дозволяє діагностувати перші ознаки розвитку процесу транслокації бактерій і токсинів, а також уловити момент надходження бактерій та їх токсинів у кровоносне русло, тобто момент, коли дренування первинного гнійно-сентичного осередку стає неминучим. Прогнозування характеру розвитку процесу і появи бактерій, і бактеріальних токсинів відбувається по двом показникам: бактеріальній засіяності абдомінального ексудату та появі підвищеного вмісту токсинів в ньому. Тобто одна діагностична ознака контролює і уточнює іншу. Спосіб реалізується наступним чином. Після абдомінальної операції через 6 часів після втручання виконують перше дослідження ексудату, що надходить з дренажів. Воно включає одночасні якісні дослідження на наявність кишкової патогенної флори ТТХ-тестом (трифенілтетразолійхлоридний тест) і на ендотоксини - гель-тромб LAL-тестом. Реактив для ТТХ-тесту готують заздалегідь шляхом розчинення 750 мг трифенілтетразолію хлориду (ТТХ) в 100 мл насиченого розчину двозаміщеного фосфату натрію. Потім беруть для приготування робочого розчину, поєднують з 100 мл насиченого розчину двозаміщеного фосфату натрію. Обидва розчини для стерилізації проводять крізь фільтр Зейтца і потім зберігають в холодильній камері. При проведенні дослідження із стерильної ємності 2 мл ексудату переносять в скляну пробірку і додають 0,5 мл робочого розчину ТТХ. Після цього пробірку розміщують в термостаті при температурі 37 °C на 4 години. При позитивному результаті, тобто мікробному числі вище 100000 мікробних тіл (МТ) в 1 мл на дні пробірки з'являється червоний осадок. При нечіткості виявлення осадку пробірку можна залишити в термостаті на 6-9 і навіть 24 години, що дає змогу достовірно судити про наявність в ексудаті зазначеного рівня бактеріємії. Повторне дослідження ТТХ-тестом доцільно виконувати кожні 12 годин. Одночасно з ТТХ-тестом проводять дослідження абдомінального ексудату гель-тромб LALтестом (Limulus Amebocyte Lysate) - якісне визначення грам-негативних бактеріальних ендотоксинів. Стандартнийнабор PYROGENT гель-тромб тесту випускає, наприклад, фірма Lonza (Швейцарія) з чутливістю 0,03; 0,06; 0,125; 0,25 ОЕ/мл (одиниць ендотоксикозу в 1 мл). Виконують забирання ексудату в апірогенні закриті ємності з наступним розчиненням в апірогенній воді, згідно з інструкцією виробника, що дає змогу отримати базовий розчин для дослідження. В дві діагностичні пробірки на кожну чутливість LAL-реактиву вносять рівні об'єми реактиву і досліджуваного розчину по 0,1 мл. Реакційні суміші акуратно перемішують і одночасно інкубують при температурі 37±1 °C впродовж 60 хвилин. Утворення щільного гелю трактують як позитивний результат (наявність ендотоксинів), а відсутність ущільнення - як негативний. При позитивних результатах якісної оцінки стану абдомінального ексудату переходять до його кількісної оцінки за допомогою кількісного кінетичного турбідиметричного LAL- тесту. Готують робочий розчин ексудату так само, як і для гель-тромб тесту. На планшеті в напівсферичних осередках виконують змішування ексудату з розчиненим LAL-реактивом різної чутливості і розміщують в спектрометр з інкубатором, який автоматично зчитує час появи мутності реакційної суміші за допомогою програмного забезпечення WinKQCL™. Вимірювання проводять при довжині хвилі 340 нм з чутливістю в діапазоні 0,01-100,00 ОЕ/мл. Визначають граничний вміст бактеріальних токсинів. Нормою є 0,25 ОЕ/мл, при перевищенні цього показника констатують вміст бактеріальних токсинів в досліджуваному розчині. При досягненні рівня ендотоксинів в абдомінальному ексудаті 1,0-2,0 ОЕ/мл одразу продовжують дослідження сироватки і плазми крові на наявність в них прокальцитоніну. Експрес-діагностику прокальцитоніну виконують імунолюмінометричним методом LUMItest™PCT, BRAHMS Diagnjstica GmbH. Berlin, Germany або напівкількісним імунохроматографічним методом BRAHMS PCT-Q. При досягненні рівня прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові 2,8±0,2 нг/мл констатують розвиток гнійно-септичного ускладнення і необхідність невідкладної оперативної санації первинного осередку інфекції. Описаний спосіб апробований в діагностиці післяопераційного перитоніту у 22 хворих, що перебували на лікуванні у відділенні політравми Харківської міської клінічної лікарні швидкої та невідкладної медичної допомоги, а також у відділенні травматичного шоку ДУ "Інституту загальної та невідкладної хірургії ім. В.Т.Зайцева НАМНУ" і у всіх хворих дозволив в ранньому післяопераційному періоді (впродовж 1-2 діб) виявити розвиток гнійно-септичних ускладнень і 3 UA 110389 U 5 своєчасно виконати релапаротомію з ліквідацією і адекватним дренуванням осередку абдомінальної інфекції, що дозволило досягти одужання у 82 % хворих. Таким чином, виконання способу за корисною моделлю дозволяє прямим способом на ранніх етапах після абдомінальних операцій виявляти розвиток транслокації бактерій і їх токсинів із черевну порожнину, а також своєчасно виявляти розвиток токсинемії і при цьому надавати своєчасну і адекватну хірургічну допомогу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 25 30 1. Спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії, який включає проведення лабораторної оцінки вираженості та динаміки бактеріально-індукованого токсикозу по показникам наявності в крові його продуктів, який відрізняється тим, що як показники ендотоксикозу вибирають показники внутрішньочеревної контамінації, синдрому кишкової недостатності і збільшення бактеріальної токсинемії; про показники внутрішньочеревної контамінації судять по якісній експрес-оцінці рівня бактеріальної засіяності ексудату шляхом проведення модифікованого ТТХ-тесту, синдрому кишкової недостатності - по якісній експресоцінці рівня абдомінального ендотоксикозу шляхом гель-тромб LAL-тесту і при позитивній якісній оцінці ТТХ-тесту констатують засіяність ексудату патогенною флорою більше 100000 МТ/мл, а при позитивній якісній оцінці гель-тромб LAL-тесту констатують вміст бактеріальних ендотоксинів вище 0,25 ОЕ/мл. 2. Спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії за п. 1, який відрізняється тим, що додатково кожні 12 годин проводять кількісну експрес-оцінку рівня ендотоксинів в ексудаті шляхом кінетичного турбідиметричного LAL-тесту і при збільшенні рівня ендотоксинів в абдомінальному ексудаті у порівнянні з показниками якісного тесту та появі прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові констатують розвиток бактеріальної токсинемії та її динаміку. 3. Спосіб діагностики транслокаційних бактеріальних ендотоксикозу і токсинемії за будь-яким з п. 1, 2, який відрізняється тим, що при досягненні рівня ендотоксинів в абдомінальному ексудаті 1,0-2,0 ОЕ/мл, а рівня прокальцитоніну в сироватці або плазмі крові 2,8±0,2 нг/мл констатують розвиток гнійно-септичного ускладнення і необхідність невідкладної оперативної санації первинного осередку інфекції. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4