Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і етанол (гексадекан) як джерело вуглецю і енергії, сульфат міді і сульфат заліза. У середовище додатково вносять сульфат цинку у концентрації 41-43 мкмоль/л. UA 110791 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН UA 110791 U UA 110791 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані як антимікробні агенти у харчовій промисловості, медицині та сільському господарстві. Відомий спосіб одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі попередників синтезу і факторів росту, а також невисокий вихід цільового продукту від субстрату (до 48 %). Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 [Пат. 81800 UA, МПК С 21 N 1/02; С 21 R 1/38. Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Мащенко О.Ю., Парфенюк С.А.; опубл. 10.07.2013, Бюл. № 13], який включає культивування штаму ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, етанол або гексадекан як джерело вуглецю і енергії, а також сульфат міді (0,15-0,17 мкмоль/л) і сульфат заліза (3,5-3,7 мкмоль/л). Недоліком цього способу є недостатньо високі антимікробні властивості синтезованих ПАР. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нового способу одержання ПАР, який покращує антимікробні властивості поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і етанол або гексадекан як джерело вуглецю і енергії, а також сульфат міді і сульфат заліза. Згідно з корисною моделлю, у середовище додатково вносять сульфат цинку (41-43 мкмоль/л). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення сульфату цинку (41-43 мкмоль/л) у середовище з етанолом (гексадеканом), сульфатом міді, сульфатом заліза дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 1,8-3,5 разів (до 6-44 мкг/мл). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH 2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4·7H2O-0,1; а також CuSO4·5H2O (0,16 мкмоль/л), FeSO4·7H2O 2+ (3,6 мкмоль/л) та ZnSO4·7H2O (42 мкмоль/л); рН середовища 6,8-7,0. Сu добавляють у 2+ середовище у вигляді розчину CuSO4·5H2O концентрацією 4 мг/100 мл. Fe вносять у 2+ середовище у вигляді 1 % розчину FeSO4·7H2O, Zn - у вигляді розчину ZnSO4·7H2O концентрацією 1,1 г/100 мл. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus ІMB В-7241 з експоненційної фази (48 год росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO 4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії для одержання інокуляту використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 30 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію синтезованих ПАР у 1,8-3,5 разу (до 6-44 мкг/мл). Приклад 1. Вплив катіонів цинку у середовищі культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 на антимікробні властивості поверхнево-активних речовин. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4·7H2O-0,1; також CuSO4·5H2O (0,16 мкмоль/л), FeSO4·7H2O (3,6 мкмоль/л); рН середовища 6,8-7,0. В одному з 2+ варіантів у середовище додатково вносять ZnSO4·7H2O (42 мкмоль/л). Сu добавляють у 2+ середовище у вигляді розчину CuSO4·5H2O концентрацією 4 мг/100 мл. Fe вносять у 2+ середовище у вигляді 1 % розчину FeSO4·7H2O, Zn - у вигляді розчину ZnSO4·7H2O концентрацією 1,1 г/100 мл. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. 1 UA 110791 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Позаклітинні поверхнево-активні речовини виділяють так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСІ, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50 °С й абсолютному тиску 0,4 атм. до постійної маси. Антимікробні властивості поверхнево-активних речовин аналізують за показником мінімальної інгібуючої концентрації. МІК - це найменша концентрація препарату, що пригнічує видимий неозброєним оком ріст тест-культури. МІК є незалежним показником, за допомогою якого можна одночасно порівняти ефективність кількох антимікробних агентів. На відміну від інших методів аналізу активності відповідних препаратів, визначення МІК має ряд переваг: простота і швидкість аналізу, можливість одночасного визначення для кількох тест-культур, дослідження ефективності різних концентрацій препарату, можливість порівняння ефективності різних препаратів чи препаратів різного ступеня очищення. Визначення МІК є важливим фактором у лабораторній діагностиці для виявлення стійкості мікроорганізмів до антимікробних препаратів, а також для контролю ефективності нових лікарських засобів. У медичній практиці за допомогою цього показника вибирають антибіотики та встановлюють необхідні їх дози для лікування пацієнтів. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють методом двократних серійних розведень у м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ). У стерильних умовах у 10 пробірок вносять по 1 мл середовища, у першу додають 1 мл розчину ПАР певної концентрації, після чого перемішують, відбирають 1 мл і переносять у наступну пробірку. Аналогічно проводять розведення для наступних дев'яти пробірок. З останньої пробірки відбирають 1 мл. Таким чином, кінцевий об'єм у кожній пробірці становить 1 мл (МПБ і розчин ПАР), а концентрація ПАР у кожній наступній пробірці знижується у 2 рази. Як контроль використовують 1 мл МПБ без 5 додавання розчину ПАР. Далі у кожну з пробірок вносять по 0,1 мл суспензії тест-культур (10 6 10 КУО/мл), та перемішують. Пробірки інкубують впродовж 24 год при 28-30 °C. Результати оцінюють візуально за помутнінням середовища: (+) - пробірки, в яких спостерігають помутніння середовища (ріст тест-культури), (-) - помутніння немає (ріст відсутній). Мінімальну інгібуючу концентрацію розчину ПАР визначають як середнє значення між концентраціями ПАР в останній пробірці, де ріст відсутній, і в попередній, де він наявний. Як тест-культури використовують бактерії Escherichia coli ІЕМ-1, Proteus vulgaris ПА-12, Staphylococcus aureus БМС-1, Enterobacter cloacae C-8 з колекції мікроорганізмів кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій. Значення мінімальної інгібуючої концентрації ПАР, синтезованих в різних умовах культивування штаму ІMB В-7241, наведено у табл. 1. Таблиця 1 Вплив катіонів цинку у середовищі культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 на антимікробні властивості ПАР Субстрат Етанол н-Гексадекан Наявність у середовищі CuSO4, FeSO4 (прототип) ZnSO4, CuSO4, FeSO4 CuSO4, FeSO4 (прототип) ZnSO4, CuSO4, FeSO4 E. coli IEM-1 MIK, мкг/мл E. cloaceae C- S. aureus 8 БМС-1 P. vulgaris ПА-12 50 100 13 25 14 28 7 14 40 80 20 80 11 44 6 44 2 UA 110791 U 5 10 15 20 Як видно з наведених у табл. 1 даних, додаткове внесення сульфату цинку у середовище з етанолом (гексадеканом), сульфатом міді та сульфатом заліза супроводжувалося синтезом ПАР, мінімальна інгібуюча концентрація яких щодо досліджуваних тест-культур бактерій становить 6-44 мкг/мл і є у 1,8-3,5 разу нижчою порівняно з МІК ПАР, утворюваних на середовищі без катіонів цинку. Приклад 2. Вплив різних концентрацій катіонів цинку на антимікробні властивості ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4·7H2O-0,1; CuSO4·5H2O (0,16 мкмоль/л), FeSO4·7H2O (3,6 мкмоль/л), ZnSO4·7H2O (38-45 мкмоль/л).; рН середовища 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus ІMB В-7241 з експоненційної фази (48 год росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 30 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР та визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Дані щодо впливу концентрації катіонів цинку на антимікробні властивості ПАР А. calcoaceticus ІMB В-7241 наведено у табл. 2. Таблиця 2 Мінімальна інгібуюча концентрація ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 залежно від концентрації катіонів цинку у середовищі культивування Субстрат Етанол н-Гексадекан 25 30 35 ZnSO4·7H2O (мкмоль/л) Е. соlі ІЕМ-1 38 39 40 41 42 43 44 45 38 39 40 41 42 43 44 45 МІК, мкг/мл S. aureus БМС- P. vulgaris ПАЕ. сlоасеае С-8 1 12 48 12 24 48 12 24 40 10 20 32 8 16 28 7 14 36 9 18 56 14 28 56 14 28 72 9 36 72 9 36 64 8 32 48 6 48 44 6 44 48 6 48 80 10 40 88 11 44 24 24 20 16 14 18 28 28 18 18 16 12 11 12 20 22 Дані, наведені у табл. 2, засвідчують, що у разі внесення у середовище культивування штаму ІMB В-7241 сульфату цинку у концентрації 41-43 мкмоль/л мінімальна інгібуюча концентрація синтезованих ПАР є найнижчою. + Приклад 3. Вплив катіонів цинку на активність НАДФ -залежної глутамат-дегідрогенази A. calcoaceticus ІMB В-7241. Оскільки штам ІMB В-7241 синтезує комплекс гліко-, аміно- та нейтральних ліпідів, цілком ймовірно, що в різних умовах культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 може змінюватися співвідношення компонентів комплексу. За літературними даними аміноліпіди є ефективнішими антимікробними агентами порівняно з гліколіпідами. Отже, можливо, що за наявності у середовищі культивування штаму ІMB В-7241 сульфату цинку вміст аміноліпідів у складі синтезованого комплексу ПАР є вищим, ніж одержаного на середовищі з сульфатом міді і + сульфатом заліза. Для перевірки цього припущення аналізують активність НАДФ -залежної 3 UA 110791 U 5 10 15 глутаматдегідрогенази - ключового ферменту біосинтезу аміноліпідів в різних умовах вирощування штаму ІMB В-7241 Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють як описано у прикладі 1. Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв, + 4 °C). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05 М К -фосфатним буфером (рН 7,0), центрифугуючи (4000 g, 15 хв, 4 °C). Відмиті клітини ресуспендують в 0,05 М + К -фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнують ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 20 с при 4 °C на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000 g, 30 хв, 4 °C), осад відділяють, а супернатант використовують як безклітинний екстракт. Активність глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4) аналізують за утворенням глутамату під час окиснення НАДФН при 340 нм. Як видно з даних, наведених у табл. 3, за наявності сульфату міді, сульфату заліза і + сульфату цинку у середовищі з етанолом і гексадеканом активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази A. calcoaceticus ІMB В-7241 є вищою, ніж на середовищі без сульфату цинку (прототип). Таблиця 3 Вплив катіонів цинку у середовищі культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 на активність + НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази -1 Наявність у середовищі Сульфат міді, сульфат заліза (прототип) Сульфат міді, сульфат заліза, сульфат цинку Фаза росту початок експоненційної кінець експоненційної початок експоненційної кінець експоненційної -1 Активність (нмоль хв мг білка) за умов росту на етанолі н-гексадекані 1017±51 Н.в. 870±43 556±27 2373±118 Н.в. 1739±87 8333±416 Примітка. Н.в. - не визначали. 20 Отже, додаткове несення сульфату цинку (41-43 мкмоль/л) у середовище з етанолом (гексадеканом), сульфатом міді, сульфатом заліза дає змогу покращити антимікробні властивості синтезованих ПАР, зокрема, знизити порівняно з прототипом мінімальну інгібуючу концентрацію поверхнево-активних речовин у 1,8-3,5 разів (до 6-44 мкг/мл). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і етанол (гексадекан) як джерело вуглецю і енергії, сульфат міді і сульфат заліза, який відрізняється тим, що у середовище додатково вносять сульфат цинку у концентрації 41-43 мкмоль/л. 30 Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4