Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення - пересмажену соняшникову олію, з використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Концентрація пересмаженої олії становить 2,9-3,1 % (об’ємна частка), а вміст меляси у середовищі для одержання інокуляту 0,7-0,9 % (масова частка). UA 111046 C2 (12) UA 111046 C2 UA 111046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Ρ.Α., Вільданова-Марцишин P.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis ІMB Ас-5017 [Пат. 63962 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Софілканич А.П., Квятківська І.В. Опубл. 25.12.2011, Бюл. № 20], який включає культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для здешевлення процесу біосинтезу і підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи (у тому числі й пересмажену соняшникову олію), а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (кількість грам ПАР, синтезованих 1 г біомаси). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує ПАР-синтезувальну здатність. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення - пересмажену соняшникову олію, з використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Згідно з винаходом концентрація пересмаженої олії у середовищі становить 2,9-3,1 %, а вміст меляси у середовищі для одержання інокуляту 0,7-0,9 % (масова частка). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання пересмаженої соняшникової олії у концентрації 2,9-3,1 % (об'ємна частка), а також інокуляту, вирощеного на середовищі з мелясою масовою часткою 0,7-0,9 % дає змогу підвищити в 1,1-1,2 разу ΠАР-синтезувальну здатність (до 3,5-3,6 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii 1MB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO, - 0,5, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, KН2РО4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 3 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,8 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити в 1,1-1,2 разу ПАР-синтезувальну здатність. Приклад 1. Синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 залежно від концентрації олії у середовищі культивування Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl·2Н2О - 0,1, KH2PO4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 2-5 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить як джерело вуглецю мелясу (1,0 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °С упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Для видалення залишкової соняшникової олії з культуральної рідини здійснюють трикратну екстракцію її петролейним ефіром 1 UA 111046 C2 5 10 15 20 (співвідношення 1:1). Далі культуральну рідину центрифугують (5000 г, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 Μ НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50 °C й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Поверхневий натяг (S) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник «умовної концентрації ПАР» (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності S від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації МАР. Перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою бензином. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 залежно від концентрації пересмаженої соняшникової олії у середовищі культивування продуцента. Таблиця 1 Вплив концентрації пересмаженої олії на біосинтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 Концентрація олії, % 2 3 4 5 25 30 35 ПАР* 3,0±0,15 3,9±0,19 2,9±0,14 2,1±0,10 ПАР, г/л 2,8±0,14 3,3±0,16 2,3±0,11 1,7±0,08 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що найвищі показники синтезу ПАР досягаються у процесі вирощування штаму ІMB В-7405 на середовищі з 3 % пересмаженої соняшникової олії. Приклад 2. Залежність синтезу ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 на пересмаженій соняшниковій олії від концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту. Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 3 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,6-1,0 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °С упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР і концентрацію ПАР (г/л) визначають, як описано у прикладі 1. Біомасу визначають ваговим методом. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. Як видно з наведених у табл. 2 даних, найвищі показники синтезу ПАР спостерігаються за концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту 0,7-0,9 %. 40 Таблиця 2 Вплив концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту на біосинтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 Концентрація меляси у середовищі для одержання інокуляту (%, масова частка) 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 ПАР* г ПАР/г біомаси 3,0±0,15 4,6±0,30 4,7±0,33 4,7±0,33 3,9±0,19 3,0±0,15 3,5±0,17 3,6±0,18 3,5±0,17 3,2±0,16 2 UA 111046 C2 5 10 Приклад 3. Визначення оптимальної концентрації пересмаженої олії у середовищі культивування N. vaccinii ІMB В-7405 Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 2,8-3,2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,8 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °С упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначають як описано у прикладі 1, ПАР-синтезувальну здатність - у прикладі 2. Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що ПАР-синтезувальна здатність досягає максимального значення у разі вирощування штаму ІMB В-7405 на середовищі з 2,9-3,1 % пересмаженої соняшникової олії. 15 Таблиця 3 Показники синтезу ПАР за умов росту N. vaccinii ІMB В-7405 на середовищі з різною концентрацією пересмаженої олії Концентрація пересмаженої олії (%, об'ємна частка) 2,8 2,9 3,0 3,1 3,2 20 25 30 35 ПАР* г ПАР/г біомаси 4,0±0,20 4,8±0,33 4,7±0,33 4,7±0,33 4,1±0,21 3,1±0,15 3,5±0,17 3,6±0,18 3,5±0,17 3,2±0,16 Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР штамами Rhodococcus erythropolis ІMB Ас5017 і N. vaccinii ІMB В-7405 на пересмаженій соняшниковій олії Культивування N. vaccinii ІMB В-7405 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 3 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,8 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування штаму ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 1,3; MgSO4·7H2O - 0,1; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,14; FeSO4·7H2O - 0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують пересмажену соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). У середовище культивування штаму Ас5017 додатково вносять 0,1 % глюкози (масова частка). Як посівний матеріал використовують штам R. erythropolis ІMB Ас-5017, вирощений до середини експоненційної фази росту на середовищі наведеного вище складу, що містить 1,0 % (об'ємна частка) соняшникової олії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв..) при 28 °С упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначають як описано у прикладі 1, ПАР-синтезувальну здатність - у прикладі 2. Показники синтезу ПАР штамами ІMB В-7405 і Ас-5017 наведено у табл. 4. Таблиця 4 Синтез ПАР за умов росту N. vaccinii ІMB В-7405 і R. erythropolis ІMB Ас-5017 на пересмаженій соняшниковій олії Штам ПАР, г/л R. erythropolis 1MB Ас-5017 (прототип) N. vaccinii 1MB В-7405 5,1 ±0,25 4,0±0,20 3 ПАР-синтезувальна здатність, г ПАР/г біомаси 3,1±0,15 3,6±0,18 UA 111046 C2 Як видно з наведених у табл. 4 даних, культивування N. vaccinii ІMB В-7405 на середовищі, що містить пересмажену соняшникову олію у концентрації 3 %, з використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі масовою часткою 0,7 %, дає змогу підвищити ПАРсинтезувальну здатність майже в 1,2 разу порівняно з прототипом. 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення - пересмажену соняшникову олію, з використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі, який відрізняється тим, що концентрація пересмаженої олії становить 2,9-3,1 % (об’ємна частка), а вміст меляси у середовищі для одержання інокуляту - 0,7-0,9 % (масова частка). Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4