Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин, які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Заявлено спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів, при цьому як джерело вуглецю використовують суміш глюкози масовою часткою 0,49-0,51 % і гліцерину об'ємною часткою 0,49-0,51 % у молярному співвідношенні 1:2,5 відповідно. UA 111045 C2 (12) UA 111045 C2 UA 111045 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру /Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii 1MB В-7405 [Пат. 94583 UA, Спосіб одержання поверхневоактивних речовин / Пирог Т.П., Берегова Х.А.. Кудря Н.В. Опубл. 25.11.2014, Бюл. № 22], який включає культивування N. vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів. Для підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецю та енергії використовують суміш технічного гліцерину (відхід виробництва біодизелю) об'ємною часткою 4,9-5,1 % та меляси масовою часткою 0,9-1,1 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (г ПАР/г біомаси). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує ПАР-синтезувальну здатність. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів. Згідно з винаходом як джерело вуглецю та енергії використовують суміш глюкози масовою часткою 0,49-0,51 % і гліцерину об'ємною часткою 0,49-0,51 % у молярному співвідношенні 1:2,5 відповідно. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю для культивування штаму N. vaccinii ІMB В-7405 суміші глюкози масовою часткою 0,49-0,51 % і гліцерину об'ємною часткою 0,49-0,51 % у молярному співвідношенні 1:2,5 відповідно дає змогу підвищити в 1,3-1,4 разу ПАР-синтезувальну здатність (до 3,5-3,6 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii ІMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, КН2РО4 - 0,1, FeSO4·7H2O -0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) та глюкози (0,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і глюкози (0,25%, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити в 1,3-1,4 разу ПАР-синтезувальну здатність. Приклад 1. Теоретичний розрахунок оптимального молярного співвідношення глюкози та гліцерину у середовищі культивування N. vaccinii ІMB В-7405 Для встановлення співвідношення концентрацій глюкози і гліцерину в середовищі культивування штаму 1MB В-7405 необхідно було: 1) розрахувати енергетичні потреби синтезу біомаси і поверхнево-активних речовин (трегалозомі-колатів) на енергетично дефіцитному субстраті (гліцерині); 2) визначити концентрацію енергетично-надлишкового субстрату (глюкози), яка б компенсувала втрати вуглецю гліцерину при його окисненні до СО 2 з метою отримання енергії для конструктивного метаболізму. При розрахунку оптимального співвідношення концентрацій гліцерину і глюкози нами було прийнято такі припущення: 1) глюкоза використовується переважно як джерело енергії, а на синтез біомаси і трегалозоміколатів витрачається вуглець гліцерину; 2) катаболізм глюкози здійснюється у пентозофосфатному циклі; 3) перетворення гліцерину відбувається через дигідроксіацетонфосфат за участю піролохінолінхінон- та нітрозо-N,N-диметиланілін-залежних алкогольдегідрогеназ та дигідроксіацетонкінази; 3) міколовою кислотою у складі трегало 1 UA 111045 C2 5 10 15 20 25 30 зоміколату є 3-гідрокси-2-додеканоїлдокозанова кислота, яка містить 34 атоми вуглецю; 4) співвідношення Р/О дорівнює 2. Витрати енергії на синтез трегалозофосфату. Для синтезу однієї молекули трегалозофосфату необхідно вісім молей гліцерину (4 молі для утворення гліоксилату + 4 молі для синтезу ацетил-КоА, який приєднується до гліоксилату з утворенням малату). Таким чином, вісім молей АТФ витрачається на утворення дигідроксіацетонфосфату з гліцерину, вісім - на утворення ФЕП з пірувату, чотири молі - на синтез 1,3-дифосфогліцерату з фосфогліцеринової кислоти (ФГК) та вісім молей (4 НАДН) - при перетворенні 1,3-дифосфогліцерату у триозофосфат. Отже, витрати енергії становлять 28 молей АТФ. Крім того, один моль АТФ використовується при утворенні нуклеозиддифосфатсахариду (глюкозо-6-фосфат  УДФглюкоза), необхідного для синтезу трегалозо-6-фосфату Таким чином, енергетичні потреби на синтез треголозо-6-фосфату з гліцерину становлять 30 молей АТФ. Витрати енергії на синтез міколових кислот. Синтез жирних кислот відбувається таким чином: з ацетил-КоА і СО2 шляхом АТФ-залежної реакції утворюється малоніл-КоА, а далі в результаті трьох послідовних реакцій синтезується бутирил-КоА. Утворений бутирил-КоА взаємодіє з наступною молекулою малоніл-КоА до утворення СН3 - (СН2)4 - CO - SKoA. У наступному циклі утворюється СН3 - (СН2)4 CO - SKoA. Таким чином, у результаті послідовного нарощування ацетил-КоА на двовуглецевий фрагмент синтезуються вищі жирні кислоти у вигляді відповідних ацил-КоА. Відповідно, для синтезу 3-гідрокси-2-додеканоїлдокозанової кислоти, яка містить 34 атоми вуглецю, необхідно 16 таких циклів. Оскільки в одному циклі витрачається 1 моль АТФ і для утворення міколової кислоти необхідно 17 молей ацетил-КоА, на синтез яких з гліцерину витратиться 17 моль АТФ, енергетичні витрати для синтезу одного моля міколової кислоти становитимуть 16+17=33 моля АТФ. Генерація АТФ при синтезі трегалозоміколатів з гліцерину. Енергія генерується при утворенні ацетил-КоА (попередника жирних кислот та гліоксилату). Сумарну реакцію утворення ацетил-КоА з гліцерину можна подати у вигляді такого рівняння: Гліцерин  Ацетил-КоА+АТФ+2НАДН (1) Оскільки нам необхідно 17 моль ацетил-КоА для синтезу міколової кислоти та 8 моль - для синтезу трегалозофосфату, рівняння (4.1) можна записати так: 25 Гліцерин  25Ацетил-КоА + 25АТФ + 50НАДН (2) Враховуючи припущення, що Р/О=2, під час утворення одного моля трегалозоміколату генерація енергії становить 125 молей АТФ. Розрахункові дані щодо витрати та генерації енергії в процесі синтезу трегалозоміколату з гліцерину можна представити у вигляді табл. 1. 35 Таблиця 1 Витрати та генерація енергії при синтезі трегалозоміколатів N. vaccinii ІMB В-7405 з гліцерину Витрата гліцерину, моль 25 40 45 50 Затрати енергії, моль АТФ На синтез На моль використаного ПАР гліцерину 63 2,52 Генерація енергії, моль АТФ При синтезі На моль використаного ПАР гліцерину 125 5 Отже, генерація енергії при синтезі трегалозоміколату з гліцерину становить 5-2,52=2,48 моль АТФ/моль використаного гліцерину. Енергетичні витрати при синтезі біомаси. Синтез біомаси з ФГК - ключового інтермедіата синтезу всіх клітинних компонентів - можна записати у вигляді рівняння (3): 4ФГК+NH3+29АТФ+5,5НАД(Ф)Н  (C4H8O2N)3 (3), де (C4H8O2N)3 - формула моля біомаси. Сумарні реакції перетворення гліцерину та глюкози в ФГК виражають таким чином: Гліцерин  ФГК+НАД(Ф)Н (4) Глюкоза  ФГК+7НАД(Ф)Н+3СО2 (5) Для Р/О=2 рівняння (4.4) і (4.5) набувають вигляду: Гліцерин  ФГК+2АТФ (6) Глюкоза  ФГК+14АТФ (7) Розрахунок «доповнюючої» концентрації глюкози. Виходячи з рівняння синтезу біомаси з ФГК (рівняння (3)) та рівняння катаболізму гліцерину до ФГК (рівняння (6)), можна порахувати, що потреба в АТФ для синтезу біомаси (в розрахунку на моль гліцерину) становить 8 молей АТФ. Ми вважаємо, що ця енергія може бути отримана з глюкози. 2 UA 111045 C2 5 10 15 20 25 30 35 Враховуючи, що у процесі синтезу трегалозоміколатів з гліцерину генерується 2,5 моля АТФ на моль використаного енергетично дефіцитного субстрату, за рахунок глюкози повинно бути отримано 8-2,48=5,52 молей АТФ. З рівняння (7) виходить, що для отримання такої кількості енергії потрібно 0,394 молей глюкози. Таким чином, молярне співвідношення глюкози і гліцерину в середовищі повинно бути 0,394:1, або 1:2,5. Приклад 2. Синтез ПАР залежно від молярного співвідношення концентрацій глюкози і гліцерину у середовищі культивування N. vaccinii 1MB В-7405 Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4·7H2O-0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, KH2PO4-0,1, FeSO4·7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш глюкози масовою часткою 0,5 % і гліцерину об'ємною часткою 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 і 0,8 % у молярному співвідношенні 1:1; 1:2; 1:2,5; 1:3 и 1:4 відповідно. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і глюкози (0,25%, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °С упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають5 мл ІΜ НСІ, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл ІΜ НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50 °C й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 залежно від молярного співвідношення глюкози і гліцерину у суміші. Таблиця 1 Вплив молярного співвідношення глюкози і меляси у змішаному субстраті на синтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 Молярне співвідношення глюкози і гліцерину 1:1 1:2 1:2,5 1:3 1:4 40 45 ПАР, г/л Е24, % 2,2±0,11 2,4±0,12 3,0±0,15 2,5±0,12 2,1±0,11 50±2,5 51±2,5 55±2,8 52±2,6 52±2,6 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що показники синтезу ПАР є найвищими за умов росту штаму 1MB В-7405 на суміші глюкози і гліцерину у молярному співвідношенні 1:2,5. Приклад 3. Вплив концентрації глюкози і гліцерину у суміші на синтез ПАР N. vaccinii ІMB В7405 Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш глюкози масовою часткою 0,47-0,53 % та гліцерину об'ємною часткою 0,47-0,53 %. Молярне співвідношення глюкози і гліцерину у всіх варіантах становить 1:2,5. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 3 UA 111045 C2 5 %, об'ємна частка) і глюкози (0,25%, масова частка). Кількість інокуляту -5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °С упродовж 120 год. Концентрацію синтезованих ПАР визначають як описано у прикладі 1. Біомасу визначають ваговим методом. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. Як видно з наведених у табл. 2 даних, за концентрації глюкози масовою часткою 0,49-0,51 % та гліцерину об'ємною часткою 0,49-0,51 % ПАР-синтезувальна здатність є найвищою. 10 Таблиця 2 Синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 залежно від концентрації глюкози і гліцерину у змішаному субстраті Концентрація глюкози, % (масова частка) 0,47 0,48 0,49 0,50 0,51 0,52 0,53 15 20 25 30 Концентрація гліцерину, % (об'ємна частка) 0,47 0,48 0,49 0,50 0,51 0,52 0,53 г ПАР/ г біомаси 3,2±0,16 3,3±0,16 3,5±0,17 3,6±0,18 3,5±0,17 3,3±0,16 3,2±0,16 Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 на різних змішаних субстратах Культивування N. vaccinii ІMB В-7405 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) та глюкози (0,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і глюкози (0,25%, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Як джерело вуглецю та енергії використовують також суміш технічного гліцерину (5,0 %, об'ємна частка) та меляси (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш технічного гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) і меляси (0,5%, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °С упродовж 120 год. ПАР-синтезувальну здатність визначають як описано у прикладі 3, індекс емульгування у прикладі 2. Показники синтезу ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 на суміші ростових субстратів наведено у табл.3. Таблиця 3 Синтез ПАР за умов росту N. vaccinii ІMB В-7405 на (мішаних субстратах Змішаний субстрат Технічний гліцерин+меляса (прототип) Глюкоза+Гліцерин 35 Е24, % 62±3,1 55±2,8 г ПАР/ г біомаси 2,6±0,13 3,6±0,18 Як видно з наведених у табл. 3 даних, культивування N. vaccinii 1MB В-7405 на суміші глюкози масовою часткою 0,5 % та гліцерину об'ємною часткою 0,5 % дає змогу підвищити ПАРсинтезувальну здатність в 1,4 разу порівняно з прототипом. 4 UA 111045 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю використовують суміш глюкози масовою часткою 0,49-0,51 % і гліцерину об'ємною часткою 0,490,51 % у молярному співвідношенні 1:2,5 відповідно. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5