Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetohacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю - сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно, з використанням інокуляту, вирощеного на глюкозі. Концентрація пересмаженої соняшникової олії у рідкому середовищі становить 3,9-4,1 % (об'ємна частка), а сечовини - 0,95-1,05 г/л. UA 111047 C2 (12) UA 111047 C2 UA 111047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UА, МПК С21N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Ρ.Α., Вільданова-Марцишин P.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis 1MB Ас-5017 [Пат. 63962 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Софілканич А.П., Квятківська І.В. Опубл. 25.12.2011, Бюл. № 20], який включає культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для здешевлення процесу біосинтезу і підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи (у тому числі й пересмажену соняшникову олію), а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих ПАР. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує концентрацію синтезованих ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю - сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно, з використанням інокуляту, вирощеного на глюкозі. Згідно з винаходом концентрація пересмаженої соняшникової олії становить 3,9-4,1 % (об'ємна частка), а сечовини - 0,95-1,05 г/л. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання пересмаженої соняшникової олії у концентрації 3,9-4,1 % (об'ємна частка), а сечовини - 0,95-1,05 г/л дає змогу підвищити в 1,4-1,5 разу концентрацію синтезованих позаклітинних ПАР (до 7,2-7,4 г/л). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-1,0, MgSO4·7H2O-0,1, NaCl-1,0, Na2HPO4-0,6, KH2PO4-0,14, pH 6,87,0. У середовище додатково вносять дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і розчин мікроелементів - 0,1 % (об'ємна частка). Розчин мікроелементів містить (г/100 мл): ZnSO 47H2O1,1; MnSO4H2O-0,6; FeSO47H2O-0,1; CuSO45H2O-0,004; CoSO47H2O-0,03; H3BO3-0,006; KI0,0001; ЕДТА (трилон Б) - 0,5. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 4 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % глюкози (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити в 1,4-1,5 разу концентрацію синтезованих позаклітинних ПАР. Приклад 1. Синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від концентрації пересмаженої олії у середовищі культивування Культивування штаму IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35, MgSO4·7H2O-0,1, NaCl-1,0, Na2HPO4-0,6, KH2PO4-0,14, pH 6,8-7,0. У середовище додатково вносять дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і розчин мікроелементів - 0,1 % (об'ємна частка). Розчин мікроелементів містить (г/100 мл): ZnSO 47H2O1,1; MnSO4H2O-0,6; FeSO47H2O-0,1; CuSO45H2O-0,004; CoSO47H2O-0,03; H3BO3-0,006; ΚΙ 0,0001; ЕДТА (трилон Б) - 0,5. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 2-5 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % глюкози (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища 1 UA 111047 C2 5 10 15 20 25 Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Для видалення залишкової соняшникової олії з культуральної рідини здійснюють трикратну екстракцію її петролейним ефіром (співвідношення 1:1). Далі культуральну рідину центрифугують (5000 г, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 Μ НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50 °C й абсолютному тиску 0,4 атм. до постійної маси. Поверхневий натяг (σS) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності σ S від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою бензином. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від концентрації пересмаженої олії у середовищі культивування. Таблиця 1 Вплив концентрації пересмаженої соняшникової олії у середовищі на біосинтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 Концентрація олії, % (об'ємна частка) 2,0 3,0 4,0 5,0 30 35 40 ПАР, г/л 2,3±0,П 4,0±0,20 3,9±0,19 3,7±0,18 ПАР* 6,1±0,30 6,7±0,33 6,1±0,35 6,0±0,34 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що найвищі показники синтезу ПАР досягаються за використання олії у концентрації 3 % (об'ємна частка). Приклад 2. Залежність синтезу ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 від концентрації пересмаженої соняшникової олії та сечовини у середовищі культивування Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Концентрація сечовини у середовищі становить 0,35-1,0 г/л. Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 3,0-5,0 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,35 г/л сечовини і 1,0 % глюкози (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію ПАР (г/л) визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, підвищення концентрації сечовини у середовищі супроводжується збільшенням концентрації синтезованих ПАР порівняно з показниками на базовому середовищі, що містить 0,35 г/л джерела азоту. Найвища концентрація ПАР (7,4 г/л) досягається за концентрації сечовини 1,0 г/л та олії 4,0 %. 2 UA 111047 C2 Таблиця 2 Вплив концентрації сечовини та пересмаженої олії у середовищі на біосинтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 Концентрація соняшникової олії, % 3 4 5 5 10 Концентрація (NH2)2CO, г/л 0,35 0,7 1,0 0,35 0,7 1,0 0,35 0,7 1,0 Концентрація ПАР, г/л 4,0±0,20 5,6±0,28 4,9±0,24 3,9±0,19 5,7±0,29 7,4±0,37 3,7±0,18 5,2±0,26 5,2±0,26 Приклад 3. Визначення оптимальної концентрації сечовини і пересмаженої олії у середовищі культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Концентрація сечовини у середовищі становить 0,8-1,1 г/л. Як джерело вуглецю використовують пересмажену олію у концентрації 3,8-4,2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,35 г/л сечовини і 1,0 % глюкози. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають як описано у прикладі 1 (табл. 3). Таблиця 3 Синтез ПАР за умов росту штаму 1MB В-7241 на середовищі з різними концентраціями сечовини та пересмаженої олії концентрація соняшникової олії, % 3,8 3,9 4,0 4,1 концентрація (NH2)2CO, г/л 0,90 0,95 1,0 1,05 1,1 0,90 0,95 1,0 1,05 1,1 0,90 0,95 1,0 1,05 1,1 0,90 0,95 1,0 1,05 1,1 3 концентрація пар, г/л 5,8±0,29 5,8±0,29 6,0±0,30 6,0±0,30 5,9±0,29 6,2±0,31 7,2±0,36 7,2±0,36 7,2±0,36 6,5±0,32 6,8±0,33 7,3±0,36 7,4±0,37 7,3±0,36 6,8±0,33 6,9±0,34 7,3±0,36 7,3±0,36 7,3±0,36 6,9±0,34 UA 111047 C2 Продовження таблиці 3 0,90 0,95 1,0 1,05 1,1 4,2 5 10 15 20 25 6,5±0,32 6,5±0,32 6,5±0,32 6,5±0,32 6,6±0,32 Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР штамами Rhodococcus erythropolis IMB Ас5017 і A. calcoaceticus IMB В-7241на пересмаженій соняшниковій олії. Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Концентрація сечовини у середовищі становить 1,0 г/л, пересмаженої олії - 4,0 % (об'ємна частка). Культивування штаму 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3-1,3; MgSO4·7H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO40,14; FeSO4·7H2O-0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують пересмажену соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). У середовище культивування штаму 1MB Ас-5017 додатково вносять 0,1 % глюкози (масова частка). Як посівний матеріал використовують штами A. calcoaceticus ІMB В-7241 і R. erythropolis IMB Ас-5017, вирощені до середини експоненційної фази росту на середовищах наведеного вище складу, що містять 1,0 % (масова частка) глюкози і 1,0 % (об'ємна частка) соняшникової олії відповідно. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію ПАР визначають як описано у прикладі 3. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини, попередньо обробленої петролейним ефіром для видалення залишкової пересмаженої олії, додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Показники синтезу ПАР штамами ІMB В-7241 і Ас-5017 наведено у табл. 4. Таблиця 4 Синтез ПАР за умов росту A. calcoaceticus 1MB В-7241 і R. erythropolis IMB Ас-5017 на пересмаженій соняшниковій олії Штам R. erythropolis IMB Ас-5017 (прототип) A. calcoaceticus IMB В-7241 30 ПАР, г/л 5,1±0,25 7,4±0,37 Індекс емульгування, % 47±2,3 54±2,7 Як видно з наведених у табл. 4 даних, культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі, що містить 4 % пересмаженої соняшниковій олії та 1,0 г/л сечовини дає змогу підвищити в 1,45 разу концентрацію синтезованих ПАР порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Acinetohacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю - сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно, з використанням інокуляту, вирощеного на глюкозі, який відрізняється тим, що концентрація пересмаженої соняшникової олії становить 3,9-4,1 % (об'ємна частка), а сечовини - 0,95-1,05 г/л. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4