Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю - сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно. Для біосинтезу поверхневоактивних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження м'яса олію, а концентрація олії у середовищі для одержання інокуляту становить 0,4-0,6 % (об'ємна частка). UA 111226 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН UA 111226 U UA 111226 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21N1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 [Пат. 100893 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Савенко І.В., Павлюковець І.Ю. Опубл. 10.08.2015, Бюл. 15], який включає культивування штаму A. calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно, з використанням інокуляту, вирощеного на глюкозі. Концентрація пересмаженої соняшникової олії становить 3,9-4,1 % (об'ємна частка), а сечовини 0,95-1,05 г/л. Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих ПАР. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нового способу одержання поверхнево-активних речовин, який підвищує концентрацію синтезованих ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно. Згідно з корисною моделлю, для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження м'яса олію, а концентрація олії у середовищі для одержання інокуляту становить 0,4-0,6 % (об'ємна частка). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання 0,4-0,6 % інокуляту, вирощеного на відпрацьованій після смаження м'яса олії дає змогу підвищити концентрацію синтезованих на цьому субстраті позаклітинних ПАР на 16-17 % (до 8,4-8,6 тіл). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-1,0, MgSO4·7H2O-0,1, NaCl-1,0, Na2HPO4-0,6, KH2PO4-0,14, pH 6,8-7,0. У середовище додатково вносять дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і розчин мікроелементів - 0,1 % (об'ємна частка). Розчин мікроелементів містить (г/100 мл): ZnSO4×7H2O-1,1; MnSO4×H2O-0,6; FeSO4×7H2O-0,1; CuSO4×5H2O-0,004; CoSO4×7H2O-0,03; H3BO3-0,006; KI-0,0001; ЕДТА (трилон Б) - 0,5. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану після смаження м'яса соняшникову олію у концентрації 4 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % відпрацьованої після смаження м'яса соняшникової олії. Кількість інокуляту - 10 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити на 16-17 % концентрацію синтезованих позаклітинних ПАР (до 8,4-8,6 г/л). Приклад 1. Синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 залежно від якості пересмаженої олії і способу підготовки інокуляту. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-1,0, MgSO4·7H2O-0,1, NaCl-1,0, Na2HPO4-0,6, KH2PO4-0,14, pH 6,87,0. У середовище додатково вносять дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і розчин мікроелементів - 0,1 % (об'ємна частка). Розчин мікроелементів містить (г/100 мл): ZnSO 4×7H2O1,1; MnSO4×H2O-0,6; FeSO4×7H2O-0,1; CuSO4×5H2O-0,004; CoSO4×7H2O-0,03; H3BO3-0,006; KI0,0001; ЕДТА (трилон Б) - 0,5. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану після смаження м'яса і картоплі "фрі" соняшникову олію (мережа ресторанів швидкого харчування Mcdonald's Київ) у концентрації 4 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з мелясою 1 UA 111226 U 5 10 15 20 25 (0,5 % за вуглеводами) або рафінованою соняшниковою олією (0,5 % объемна частка). Кількість інокуляту - 10 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Для видалення залишкової соняшникової олії з культуральної рідини здійснюють трикратну екстракцію її петролейним ефіром (співвідношення 1:1). Далі культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 М НСІ, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм. до постійної маси. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини, попередньо обробленої петролейним ефіром для видалення залишкової пересмаженої олії, додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено показники синтезу поверхнево-активних речовин за умов росту A. calcoaceticus ІMB В-7241 на відпрацьованій після смаження м'яса та картоплі "фрі" олії з використанням посівного матеріалу, вирощеного на різних вуглецевих субстратах. Таблиця 1 Вплив якості інокуляту на синтез ПАР за умов росту A. calcoaceticus ІMB В-7241 на відпрацьованій олії (4 %) Відпрацьована олія у Індекс емульгування Джерело вуглецю у середовищі Концентрація ПАР, середовищі для біосинтезу розбавленої у 50 разів для одержання інокуляту г/л ПАР культуральної рідини, % після смаження картоплі 3,9±0,19 42 "фрі" Рафінована олія після смаження м'яса 4,5±0,22 54 після смаження картоплі 1,5±0,08 45 "фрі" Меляса після смаження м'яса 2,8±0,14 49 30 35 40 45 Наведені результати свідчать про те, що відпрацьована після смаження м'яса соняшникова олія є придатнішим субстратом для синтезу ПАР штамом ІMB В-7241, ніж після смаження картоплі "фрі". Так, незалежно від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту (меляса чи рафінована олія) концентрація ПАР і індекс емульгування культуральної рідини після вирощування A. calcoaceticus ІMB В-7241 на відпрацьованій після смаження м'яса олії були в вищими, ніж аналогічні показники за умов росту бактерій на відпрацьованій після смаження картоплі олії (таблиця 1). Приклад 2. Синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 за використання інокуляту, вирощеного на відпрацьованій олії Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі з 0,5 % (об'ємна частка) відпрацьованої після смаження м'яса і картоплі "фрі" соняшникової олії (мережа ресторанів швидкого харчування Mcdonald's Київ). Кількість інокуляту - 10 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію ПАР (г/л) та індекс емульгування визначають як описано у прикладі 1. У таблиці 2 наведено дані про утворення ПАР за використання інокуляту, вирощеного на відпрацьованій олії. 2 UA 111226 U Таблиця 2 Синтез ПАР залежно від типу пересмаженої олії Відпрацьована олія у середовищі для одержання інокуляту Концентрація ПАР, г/л для біосинтезу ПАР після смаження картоплі після смаження картоплі "фрі" "фрі" після смаження м'яса після смаження м'яса 5 10 15 20 25 30 Індекс емульгування розбавленої у 50 разів культуральної рідини, % 5,0±0,25 50 8,5±0,42 54 Наведені дані свідчать, що використання пересмаженої олії для одержання посівного матеріалу супроводжується підвищенням як концентрації ПАР, так і індексу емульгування культуральної рідини порівняно із застосуванням інокуляту, одержаного на рафінованій олії чи мелясі (див. таблицю 1), причому найвищі показники синтезу ПАР спостерігаються у разі використання відпрацьованої після смаження м'яса олії. Одержані результати, на нашу думку, можуть бути пояснені так. З літератури [Zhang Q., Saleh A.S., Chen J., Shen Q. Chemical alterations taken place during deep-fat frying based on certain reaction products: A review // Chem. Phys. Lipids. - 2012. - Vol. 165, № 6. - P. 662-681] відомо, що у процесі смаження в олії відбуваються хімічні реакції окиснення, гідролізу, ізомеризації та полімеризації, в результаті яких утворюються вільні жирні кислоти, низькомолекулярні спирти, альдегіди, кетони, лактони, вуглеводні, моно- та дигліцериди, транс-ізомери тощо. Цікаво зазначити, що ступінь ненасиченості жирних кислот є основним фактором, що впливає на окиснювальну стабільність олії [Bordin К., Kunitake М.Т., Aracava К.К., Trindade С. S. F. Changes in food caused by deep fat frying-A review // Archivos Latinoamericanos de Nutricion. - 2013. - Vol. 63, № 1. - P. 5-13]. Рослинні олії з вищим вмістом поліненасичених жирних кислот (соняшникова, льняна) окиснюються швидше, ніж ті, що містять мононенасичені кислоти (оливкова), і саме у процесі смаження картоплі "фрі" у фритюрниці на соняшниковій олії утворюється найбільша кількість токсичних альдегідів [Guillén M.D., Uriarte P.S. Aldehydes contained in edible oils of a very different nature after prolonged heating at frying temperature: Presence of toxic oxygenated α, β unsaturated aldehydes // Food Chemistry. - 2012. - Vol. 131, № 3. - P. 915-926], які можуть бути інгібіторами синтезу ПАР. Приклад 3. Залежність синтезу ПАР від концентрації пересмаженої олії у середовищі для одержання інокуляту Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють як описано у прикладі 2. Концентрація відпрацьованої олії у середовищі для одержання посівного матеріалу становить 0,3-0,7 % (об" ємна частка). Концентрацію ПАР (г/л) визначають як описано у прикладі 1. У табл. 3 наведено показники синтезу ПАР залежно від концентрації пересмаженої олії у середовищі для одержання інокуляту. Як видно з наведених у таблиці 3 даних, найвища концентрація ПАР спостерігається за концентрації інокуляту 0,4-0,6 %. Таблиця 3 Вплив концентрації пересмаженої олії у середовищі для одержання інокуляту на синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 Відпрацьована олія для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР Після смаження картоплі "фрі" Після смаження м'яса Концентрація олії у середовищі для одержання інокуляту, % 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 3 ПАР, г/л 4,5±0,22 4,7±0,23 5,0±0,25 5,0±0,25 3,9±0,20 7,4±0,37 8,6±0,43 8,5±0,42 8,4±0,42 7,2±0,36 UA 111226 U Отже, використання 0,4-0,6 % інокуляту, вирощеного на відпрацьованій після смаження м'яса олії дає змогу підвищити (порівняно з прототипом) концентрацію синтезованих на цьому субстраті позаклітинних ПАР на 16-17 % (до 8,4-8,6 г/л). 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту і вуглецю - сечовину і пересмажену соняшникову олію відповідно, який відрізняється тим, що для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження м'яса олію, а концентрація олії у середовищі для одержання інокуляту становить 0,4-0,6 % (об'ємна частка). Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4