Спосіб кількісного визначення вмісту антидіабетичного засобу фенсукциналу та його метаболітів у плазмі крові

Реферат: Спосіб кількісного визначення вмісту антидіабетичного засобу фенсукциналу та його метаболітів у плазмі крові методом рідинної хроматографії. Здійснюють термоденатурацію аліквот плазми крові на водяній бані протягом 5 хвилин при +70 °C, ферментативну декон'югацію метаболітів фенсукциналу протягом 1 години при +37 °C та осадження протеїнів плазми крові розчином ацетонітрилу з наступним хроматографуванням проб, їх ідентифікацією та кількісним визначенням досліджуваних сполук. UA 111489 U (12) UA 111489 U UA 111489 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до профілактичної медицини, промислової токсикології та може бути використана санітарними та клінічними лабораторіями при проведенні медикопрофілактичних обстежень працюючих для визначення сукцинатвмісних сполук в плазмі крові. Промисловий синтез та виробництво лікарських засобів може представляти реальну загрозу забруднення навколишнього середовища та заподіювати значної шкоди здоров'ю людей, професійно зайнятих у сфері фармацевтичної індустрії. На теперішній час актуальною проблемою є встановлення безпечних рівнів вмісту лікарських засобів (ЛЗ) в виробничому та навколишньому середовищі [1]. Відомо, що контроль за вмістом хімічних сполук, в тому числі ЛЗ, в повітрі робочої зони навіть при дотриманні величин гранично допустимих концентрацій (ГДК р.з.) не надає вичерпного уявлення про кількість токсиканта, фактично поглиненого організмом. Для підвищення точності та надійності гігієнічних нормативів методи контролю повітря робочої зони повинні бути доповнені біологічним моніторуванням, яке передбачає контроль за вмістом ЛЗ та його метаболітів в біологічному середовищі працюючого контингенту в залежності від рівнів екзогенної дози. Біомоніторинг передбачає ідентифікацію та кількісне визначення концентрації ЛЗ та їх активних метаболітів у біологічних середовищах організму працюючого контингенту [2-3]. В зв'язку з цим необхідна розробка аналітичних методик кількісного визначення ЛЗ у біологічному субстраті, які ґрунтуються на сучасних інструментальних методах досліджень та мають високу чутливість і селективність визначення. На теперішній час безперечні переваги мають методи високоефективної рідинної хроматографії, які дозволяють провести як якісний, так і кількісний аналіз сполук в біологічних пробах [4]. В ДУ "Інститут проблем ендокринної патології НАМН України" синтезовано оригінальний антидіабетичний засіб (АДЗ) - β-фенілетиламід 2-оксисукцинанілової кислоти - фенсукцинал (βФЕА-ОСАК), який має широкий спектр фармакологічної дії: антигіперглікемічну, антиоксидантну, він здатний стимулювати регенерацію та секреторну функцію панкреатичних β-клітин і захищати їх від деструкції діабетогенними чинниками, гальмуючи розвиток діабетичних мікро- та макроангіопатій за умов відносної та абсолютної інсулінової недостатності [5]. При дослідженні фенсукциналу встановлено, що сполука в організмі піддається біотрансформації з утворенням двох можливих метаболітів 2-гідроксифенілсукцинаміду (2-ГФСА) та β-фенілетилсукцинаміду (βФЕСА). На сьогодні проводиться активна робота по впровадженню β-ФЕА-ОСАК у виробництво, тому актуальним є поглиблене його вивчення, зокрема з гігієнічних позицій. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб кількісного визначення вмісту фенсукциналу та його метаболітів: (2-гідроксифенілсукцинаміду та β-фенілетилсукцинаміду) у плазмі крові методом високоефективної рідинної хроматографії (в експерименті). Поставлена задача вирішується тим, що спочатку проводять пробопідготовку біозразків плазми крові щурів-самців: здійснюють термоденатурацію аліквот плазми крові на водяній бані протягом 5 хвилин при +70 °C, ферментативну декон'югацію метаболітів фенсукциналу протягом 1 години при + 37 °C та осадження протеїнів плазми крові розчином ацетонітрилу з наступним хроматографуванням проб, їх ідентифікацією та кількісним визначенням досліджуваних сполук. Технічний результат - розроблено спосіб кількісного визначення вмісту β-ФЕА-ОСАК та його метаболітів у плазмі крові методом рідинної хроматографії. Розроблений спосіб кількісного визначення фенсукциналу та його метаболітів методом рідинної хроматографії складається з таких етапів: 1. Отримання плазми крові. Плазму крові отримують шляхом відбору крові з хвостової вени експериментальних щурівсамців, які одноразово внутрішньошлунково отримували субстанцію фенсукциналу в дозі 100 мг/кг маси тіла - для основного аналізу; інтактних тварин - для приготування калібрувальних розчинів. Гепаринізовану кров центрифугують 10 хв. при 1500 об., отриману плазму крові відбирають у пробірки еппендорф з відповідним маркуванням та зберігають при -20 °C. 2. Пробопідготовка плазми крові для хроматографічного аналізу. Нерозведені аліквоти плазми крові по 100 мкл поміщають у відповідні по маркуванню круглодонні пластикові пробірки та проводять термоденатурацію біозразків на водяній бані при температурі +70 °C протягом 5 хв. Після охолодження проб в усі пробірки додають по 150 мкл 0,1 % водного розчину мурашиної кислоти та по 10 мкл 0,1 М натрій-цитратного буферного розчину (рН 5,0). Пробірки закривають кришками та перемішують їх вміст на механічному струшувачі 2 хв. Для проведення ферментативної декон'югації в усі пробірки з біозразками плазми крові додають по 5 мкл розчину ферменту Sulfatase from Helix pomatia type H-1 sulfatase  10000 units/g.sold., пробірки закривають кришками та перемішують їх вміст на механічному струшувачі 1 хв. Після цього 1 UA 111489 U 5 10 15 20 25 30 проводять термостатування проб при температурі 37 °C протягом 1 години. Після закінчення терміну інкубації в усі пробірки додають по 20 мкл розчину аскорбінової кислоти (50 мг/л) в 0,1 % розчині мурашиної кислоти з 20 % розчином ацетонітрилу та по 500 мкл осаджуючого розчину, який містить внутрішній стандарт ніпагін (метиловий ефір парагідроксибензойної кислоти), пробірки закривають кришками та струшують їх вміст на механічному струшувачі 3 хв. Далі проводять центрифугування проб при 20000 об./хв. протягом 10 хв. Відбирають по 700 мкл супернатанту кожної проби у відповідні по маркуванню пробірки еппендорф та додають по 1 мл суміші ацетонітрил - метанол - буферний розчин (1:1:2), перемішують їх вміст, фільтрують крізь мембранний фільтр із розміром пор 0,45 мкм. Надалі проводять хроматографування випробуваних розчинів та розрахунок концентрацій βФЕА-ОСАК/метаболітів (2-гідрокси-фенілсукцинаміду; β-фенілетилсукцинаміду) у плазмі крові. 3. Хроматографічний аналіз. Хроматографування проб проводять за допомогою рідинного хроматографа Agilent 1260 із спектрофотометричним детектором. Проби хроматографують триразово шляхом внесення по 20 мкл випробуваного розчину або розчину для градуювання за таких умов: - колонка сталева, розміром 2504,0 мм Nucleosil 100-5 С18; - рухома фаза: ацетонітрил - метанол - буферний розчин (5:28:67); - буферний розчин готують за допомогою калію дигідрофосфату, доводять рН до 2,3 фосфорною кислотою; - швидкість рухомої фази 1,0 мл/хв.; - температура колонки 40 °C; - детектування за довжини хвилі 210 нм. Умови придатності хроматографічної системи: - коефіцієнт розділення піків метаболіту β-ФЕСА та внутрішнього стандарту має бути не менше 1,5; - ефективність хроматографічної колонки, розрахованої за піком кожної домішки, має бути не менше 1000 т.т. Якщо необхідно, регулюють вміст органічної частини рухомої фази або співвідношення складових органічної частини рухомої фази. Ідентифікацію піків фенсукциналу та його метаболітів проводять за допомогою інформаційної хроматограми (див. креслення) та табл. 1. Таблиця 1 Інформаційна таблиця для ідентифікації піків Речовина Час утримування, хв. Метаболіт 2-ГФСА Метаболіт β-ФЕСА Внутрішній стандарт Фенсукцинал 35 40 45 50 3,574 6,387 7,518 21,252 Відносний утримування 0,475 0,850 1 2,827 час Для розрахунку концентрацій β-ФЕА-ОСАК/метаболітів в біозразках плазми крові використовують метод внутрішнього стандарту, яким вибрано ніпагін (метиловий ефір парагідроксибензойної кислоти). Для п'яти градуювальних розчинів для β-ФЕА-ОСАК, 2-ГФСА, β-ФЕСА розраховують параметри лінійної залежності відношення площі піка цих речовин до площі піка внутрішнього стандарту "К" в залежності від концентрації сполук у градуювальному розчині "С" у нг/мкл. Одержані параметри використовують для розрахунку β-ФЕА-ОСАК та метаболітів у випробуваних зразках. Валідація методики проведена у відповідності до вимог методичних рекомендацій [6]. Вибрані умови хроматографування забезпечують селективність методики. Правильність методики гарантована використанням зразків контролю якості (QC), які хроматографували паралельно із досліджуваними пробами. Відхилення знайдених концентрацій для зразків QC від номінальних значень знаходились в межах 15 %. Внутрішньосерійна прецизійність не перевищувала для концентрації β-ФЕА-ОСАК - 6 %, 2-ГФСА-10 %, β-ФЕСА - 5 %. Калібрувальні розчини готували з використанням бланкової плазми. Їх піддавали всім етапам пробопідготовки дослідних зразків. Інтервали концентрацій досліджуваних речовин в калібрувальних розчинах відповідалитаким значенням концентрацій в плазмі крові: для β-ФЕАОСАК 1-130 нг/мкл; для 2-ГФСА 1-40 нг/мкл, для β-ФЕСА 2-130 нг/мкл. 2 UA 111489 U 5 Приклад. За розробленою біоаналітичною методикою нами проведено визначення концентрації фенсукциналу та його метаболітів у плазмі крові щурів-самців, які одноразово внутрішньошлунково отримували субстанцію фенсуциналу в дозі 100 мг/кг м.т. Проби плазми крові відбирали у дискретні інтервали часу через 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 24 та 48 год. після введення досліджуваної сполуки. Відповідні дані наведено у табл. 2. Таблиця 2 Концентрації β-ФЕА-ОСАК та 2-ГФСА і β-ФЕСА у плазмі крові щурів ( X  Sx ) . час відбору, n години 0,5 1 1,5 2 4 6 24 48 10 15 20 25 30 35 40 β-ФЕА-ОСАК, нг/мкл 5 5 5 5 5 5 5 5 2-ГФСА, нг/мкл 36,6±2,8 82,1±2,7 87,6±2,6 102,8±6,1 53,7±2,9 40,3±1,9 1,9±0,07