Спосіб оцінки біологічної активності метаболітів антидіабетичного засобу фенсукцинал

Реферат: Спосіб оцінки біологічної активності метаболітів антидіабетичного засобу фенсукцинал, при якому в умовах субхронічної експозиції в комплексі досліджують ліпідограму, активність глутатіон-залежних ферментів системи антиоксидантного захисту, показники стану пероксидного окиснення білків та метаболізму оксиду азоту, а також біоенергетичні процеси, включаючи цикл Кребса та гліколіз. UA 79650 U (12) UA 79650 U UA 79650 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель відноситься до медицини, зокрема експериментальної фармакології та токсикології, і може бути використана при дослідженні біологічної активності та безпечності метаболітів - продуктів біотрансформації пероральних антидіабетичних засобів на основі похідних янтарної кислоти. Цукровий діабет (ЦЦ) - це одне з найбільш поширених та тяжких гетерогенних ендокринних захворювань, що є значною медико-соціальною проблемою у зв'язку з розвитком різноманітних діабетичних ускладнень (нефрон- та ретинопатії, гангрени нижніх кінцівок, інфаркту міокарда, інсульту, ураження гепатобіліарної системи), які є причиною ранньої інвалідизації та високої смертності. В Україні за останні 10 років кількість хворих на ЦД зросла майже у 1,5 рази і складає більше 1 млн. осіб, з яких 90 % хворі на ЦД 2 типу. Враховуючи зазначене вище, актуальним на сьогодні залишається впровадження в клінічну практику ефективних вітчизняних лікарських засобів для профілактики та лікування ЦД, метаболічного синдрому (МС) та їх ускладнень з мінімальними побічними ефектами або повною їх відсутністю. Одним з таких перспективних антидіабетичних засобів (АДЗ) є (3-фенілетиламід 2оксисукцинанілової кислоти - фенсукцинал, який призначено для гальмування клінічної маніфестації ЦД, корекції інсулінорезистентних станів, зокрема МС, запобігання діабетичних мікро- та макроангіопатій. Встановлено, що фенсукцинал має виразну антигіперглікемічну та антиоксидантну активність, здатний стимулювати регенерацію та секреторну функцію β-клітин підшлункової залози та захищати їх від деструкції діабетогенними чинниками, знижувати інсулінорезистентність різного ґенезу [1]. В теперішній час ведеться активна робота щодо покращення біодоступності фенсукциналу при пероральному застосуванні. У зв'язку з цим пріоритетного значення набувають дослідження фармакокінетики з визначенням швидкості та шляхів метаболізму, а також безпечності вдосконаленої лікарської форми фенсукциналу. Вагоме місце в межах цих досліджень займає з'ясування особливостей проявів та механізмів дії потенційних метаболітів фенсукциналу, які можуть чинити суттєвий вплив на фармако- та токсикокі-нетичні/динамічні властивості вихідної сполуки. Відомо, що більшість лікарських засобів при пероральному застосуванні підлягають біотрансформації шляхом двофазного процесу: метаболічне перетворення в реакціях окиснення, відновлення, гідролізу та інших, які призводять до появи функціональних груп, що підвищують полярність молекули та діють як центри для другої фази процесу; синтетичні процеси кон'югації метаболітів з ендогенними молекулами або угрупуваннями (глюкуронова та сірчана кислота, амінокислоти, метильні та інші алкільні угрупування), в яких молекули стають більш полярними та менш жиророзчинними і тому легко виводяться із організму [2]. Більшість ліків в процесі метаболізму інактивується, але можуть мати місце також активація, зміни ступеня і навіть характеру активності [3]. Метаболізм ліків може бути також причиною виникнення токсичних метаболітів, які призводять до прояву побічних ефектів. Отже, активність лікарського засобу залежить від швидкості та співвідношення різних шляхів метаболізму, тому інформація щодо метаболічної долі ліків є дуже цінною для більш повного розуміння їх фармакологічної активності та виявлення можливих токсичних ефектів. Для дослідження біологічної активності метаболітів використовують комплекс методів, що характеризують стан основних видів обміну речовин в організмі. Але у випадку, коли досліджується оригінальна сполука, така як фенсукцинал, необхідно визначити найбільш значущі критерії, які дозволяють отримати необхідну інформацію щодо біологічної активності конкретних метаболітів. Відомо, що фенсукцинал лише частково виводиться із організму у незмінному вигляді через нирки з сечею, а решта піддається біотрансформації. В результаті метаболічного перетворення фенсукциналу внаслідок послідовних реакцій гідролізу, гідроксилювання та подальшої кон'югації у другу фазу біотрансформації утворюються глюкуроніди 2-гідроксифенілсукцинаміду (2-ГФСА) та β-фенілетилсукцинаміду β-ФЕСА), які ідентифіковані в організмі. Проте найбільш вагомий інтерес для досліджень представляють метаболіти першої фази біотрансформації фенсукциналу, які, як правило, проявляють більшу біологічну активність, ніж продукти перетворення другої фази у вигляді кон'югатів глюкуронової кислоти. Тому, виходячи з теорії метаболізму, цілком правомірно припустити, що у І фазі метаболічного перетворення фенсукциналу в організмі будуть присутні саме 2-ГФСА та βФЕСА. Слід також враховувати, що метаболіти фенсукциналу утворюються в організмі в дуже малій кількості і, відповідно, можуть спричиняти зовсім інші, навіть альтернативні ефекти, ніж сам фенсукцинал. 1 UA 79650 U 5 10 В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення біологічної активності метаболітів оригінальної сполуки β-фенілетиламід-2-оксисукцинанілової кислоти фенсукциналу. Поставлена задача вирішується тим, що для оцінки біологічної активності метаболітів фенсукциналу в умовах субхронічної експозиції нових сполук 2-ГФСА та β-ФЕСА в комплексі досліджують ліпідограму, активність глутатіон-залежних ферментів системи антиоксидантного захисту, показники стану пероксидного окиснення білків та метаболізму оксиду азоту, а також біоенергетичні процеси, включаючи цикл Кребса та гліколіз. Технічний результат - розроблено адекватні критерії оцінки біологічної активності метаболітів фенсукциналу. 2-ГФСА одержували ацилюванням 2 амінофенолу янтарним ангідридом у середовищі органічного розчинника без нагрівання. Спосіб одержання наведено на схемі 1: O NH2 H N (CH3)2CO + CO2H O O 20 C OH OH O Аналогічним способом одержано β-ФЕСА, що зображено на схемі 2: O (CH3)2CO NH2 + 15 20 25 30 35 40 45 H N CO2H O O 20 C O . При дослідженні гострої токсичності нових сполук 2-ГФСА та β-ФЕСА встановлено, що при пероральному введенні мишам і щурам максимально можливої дози - 3500 мг/кг загибелі тварин не спостерігали, що дозволяє віднести дані сполуки до малотоксичних речовин [4]. Встановлено, що метаболіти фенсукциналу 2-ГФСА та β-ФЕСА в дослідах in vitro проявляють помірно виражені антиоксидантні властивості в концентрації 300 мкМ, але більш ніж у 2 рази поступаються за цим показником фенсукциналу. Аналіз залежності антиокислювальних властивостей метаболітів фенсукциналу від концентрації показав, що вона має лінійний характер в діапазоні концентрацій 100-300 мкМ для 2-ГФСА (фіг. 1) та 50-250 мкМ для β-ФЕСА (фіг.2). Проведено комплексне оцінювання біологічної активності нових сполук - метаболітів фенсукциналу в умовах субхронічного перорального 30-разового надходження в організм щурів в дозах, еквімолярних терапевтичній дозі фенсукциналу (25 мг/кг). Вибір методів дослідження для оцінювання біологічної активності метаболітів фенсукциналу обумовлений ефектами та механізмом дії самого фенсукциналу за умов його застосування на різних моделях ЦД, синдрому інсулінорезистентності в ефективній дозі 25 мг/кг. Під час проведення експерименту реєстрували інтегральні показники - масу тіла в динаміці, після закінчення досліду та знеживлення і розтину тварин - коефіцієнти маси внутрішніх органів. Найбільш значущі критерії оцінки біологічної активності метаболітів фенсукциналу - 2-ГФСА та β-ФЕСА вибирались за найбільш достовірними, односпрямованими змінами комплексу показників, які характеризують різні види метаболізму ендогенних сполук або процесів в організмі, і тими показниками, що впливають на прояви біологічної дії самого лікарського засобу. Для експрес оцінювання тромбоцитарного гемостазу визначали час, ступінь агрегації тромбоцитів на склі з універсальним індуктором агрегації, згідно з інструкцією до набору [5]. Стан коагуляційної ланки гемостазу оцінювали за наступними показниками: час рекальцифікації плазми крові, протромбіновий час з розрахунком протромбінового відношення та міжнародного нормалізованого відношення, тромбіновий час, активований парціальний частковий тромбопластиновий час згортання плазми з визначенням відповідних індексів у відсотках до нормальної плазми крові [6]. Стан процесів вільнорадикального окиснення ліпідів визначали за вмістом дієнових кон'югатів [7], гідроперекисів ліпідів у сироватці крові, гомогенаті печінки та підшлункової залози [8], активних сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою в цільній крові, гомогенаті печінки та підшлункової залози [9]. Крім цього визначали загальну окислювальну активність у сироватці 2 UA 79650 U 5 10 15 20 [10], оцінювали ступінь спонтанної окисної модифікації білків (ОМБ) та металкаталізуючого окиснення (МКО) за вмістом карбонільованих білків (КБ) у сироватці крові та гомогенаті печінки, що виражали в одиницях оптичної густини (о.о.г.) на 1 г білка та ммоль на 1 г білка [11]. Стан системи антиоксидантного захисту (АОЗ) досліджували за вмістом відновленого глутатіону крові [12], активністю глутатіонзалежних ферментів - глутатіонпероксидази (ГП), глутатіонредуктази (ГР) [13] та глутатіонтрансферази [11] у гемолізаті еритроцитів та гомогенаті печінки, а також активністю каталази в сироватці крові, гомогенаті печінки [14] і загальною антиокислювальною активністю сироватки [10]. Стан метаболізму оксиду азоту (NO) оцінювали за рівнем нітритів та нітратів у плазмі, сечі та гомогенаті печінки [15], активністю NO-синтази (NOS) у гомогенаті печінки [16]. Стан ліпідного обміну аналізували за рівнем загальних ліпідів, загального холестеролу (ХЛ), ліпопротеїдів високої щільності (ХЛ-ЛПВЩ), ліпопротеїдів низької щільності (ХЛ-ЛПНЩ), ліпопротеїдів дуже низької щільності (ХЛ-ЛПДНЩ), тригліцеридів [17]. Для оцінювання стану вуглеводно-енергетичного обміну визначали вміст глюкози у крові за допомогою приладу Eksan-g, концентрацію молочної [18] і піровиноградної кислот у сироватці [19] та рівень глікогену у печінці [17]. Активність лактатдегідрогенази у сироватці (ЛДГ) досліджували кінетичним методом [9], активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) і цитохром-соксидази (ЦХО) визначали в тканині печінки [20]. Фактичний матеріал обробляли методами варіаційної статистики із застосуванням параметричних критеріїв (метод Ст'юдента). Основні результати проведених досліджень щодо вивчення особливостей біологічної дії метаболітів фенсукциналу представлені в таблиці. Таблиця Зміни деяких біохімічних показників у щурів за умов субхронічного введення метаболітів фенсукциналу 2-ГФСА та β-ФЕСА, ( X  Sx Показник 1 Загальний холестерин сироватки, ммоль/л ХС-ЛПВЩ сироватки, ммоль/л ХС-ЛГШЩ сироватки, ммоль/л ХС-ЛПДНЩ сироватки, ммоль/л Тригліцериди сироватки, ммоль/л Спонтанна ОМБ: КБ356, о.о.г/г білка; КБз7о, о.о.г./г білка, ммоль/г білка Нітрат-аніон (NO 3): плазма крові, мкмоль/л; сеча, мкмоль/л Нітрит-аніон (NO 2): плазма крові, мкмоль/л; сеча, мкмоль/л Активність NOS гомогенату печінки, нмоль НАФН/ мг білках хв Глутатіонредуктаза гемолізату еритроцитів, мкмоль НАДФН /г Нb×хв Контроль 2 2-ГФСА 3 Контроль 4 β-ФЕСА 5 2,81±0,08 2,21±0,12* 3,2±0,2 3,1±0,3 0,94±0,14 0,96±0,12 0,94±0,14 1,43±0,05* 1,31±0,04 0,80±0,04* 1,63±0,08 1,12±0,21* 0,56±0,04 0,55±0,04 0,58±0,03 0,42±0,01* 1,25±0,09 1,23±0,08 1,32±0,06 0,94±0,03* 19,5±2,4 21,0±2,7 0,994±0,127 12,7±0,9* 13,0±1,0* 0,617±0,047* 32,5±3,1 34,5±3,2 1,64±0,15 23,4±4,0* 24,7±4,2* 1,17±0,20* 21,9+0,3 63,5±2,2 11,9+0,6* 61,9±1,3 25,4±0,7 64,0±1,6 23,9±0,4** 60,7±0,9** 3,90±1,04 9,43±0,44 1,24±0,09* 8,90±0,23 5,85±0,70 8,40±0,28 4,25±0,45 ** 7,85+0,18** 2,23+0,16 1,3±0,14* 1,97+0,14 1,58±0,14** 3,42±0,48 4,71±0,22** 3,42±0,48 2,46±0,37 3 UA 79650 U Продовження таблиці 1 Глутатіонпероксидаза: гемолізату еритроцитів, мкмоль /г Нb×хв; гомогенату печінки нмоль /мг білках хв СДГ гомогенату печінки, нмоль/мг білках хв Цитохром-с-оксидаза гомогенату печінки, ЕО2103 /мг білках хв ЛДГ сироватки, мккат/л 2 3 4 5 172,9±16,4 125,2±13,4 154,3±15,3 202,8±30,3** 172,9±16,4 125,2±13,4 233,2±25,4** 101,8±6,7 4,66±0,35 5,31±0,51 4,67±0,35 6,82±1,19 ** 4,24±0,21 5,98±0,42 * 3,17±0,22 3,06±0,20 6,67±1,01 10,2±0,53* 6,55±1,07 7,73±0,66 Примітки: 1. * - Відхилення значуще, (р