Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід стосується способу одержання поверхнево-активних речовин, включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту - сечовину, як джерело вуглецевого живлення - технічний гліцерин, 0,16 мкмоль/л сульфату міді і 38 мкмоль/л сульфату цинку, причому концентрація сечовини становить 0,7-0,9 г/л. UA 111501 C2 (12) UA 111501 C2 UA 111501 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 [Пат. 73796 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Шулякова М.О. Опубл. 10.12.2012, Бюл. № 19], який передбачає культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецю та енергії гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизеля) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка). Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин, а також недостатньо висока концентрація технічного гліцерину у середовищі, який є відходом виробництва біодизеля. Враховуючи об'єми виробництва біодизеля у світі - понад 11 млн. т у 2008 році з щорічним наступним збільшенням на 8-10 % [Appl. Biochem. Bi-otechnol. 2012. 166, N 3. P. 680-699], а також кількість утворюваного як побічного продукту технічного гліцерину - 10 % від одержуваного біодизеля [Appl. Biochem. Biotechnol. 2013. 169, N 1. P. 110-122], стає зрозумілим, що для ефективного використання такого відходу як субстрату у біотехнологіч-них процесах його вміст у середовищі культивування продуцентів практично важливих метаболітів повинен бути якомога вищим. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує концентрацію синтезованих ПАР і вміст технічного гліцерину у середовищі культивування. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту - сечовину, як джерело вуглецевого живлення - технічний гліцерин, 0,16 мкмоль/л сульфату міді і 38 мкмоль/л сульфату цинку. Згідно з винаходом концентрація сечовини становить 0,7-0,9 г/л. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Підвищення у середовищі культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 концентрації сечовини до 0,7-0,9 г/л дає змогу підвищити у 5,9-6,1 разу концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л) і вміст технічного гліцерину до 6-8 % (об'ємна частка). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 . здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,8, MgSO4 7H2O-0,1, NaCl - 1,0, Na2HPO4 - 0,6, KH2PO4 - 0,14, pH 6,8 - 7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин (побічний продукт виробництва біодизеляя) у концентрації 7 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % технічного гліцерину (об'ємна частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу дає змогу підвищити у 5,9-6,1 разу концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л) і вміст технічного гліцерину до 6-8 % (об'ємна частка). Приклад 1. Вплив катіонів міді і цинку на синтез ПАР за умов росту А. calcoaceticus IMB В7241 на технічному гліцерині Культивування штаму IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого . складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35, MgSO4 7H2O - 0,1, NaCl - 1,0, Na2HPO4 - 0,6, KH2PO4 - 0,14, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка), розчин мікроелементів, рН 6,8-7,0. Розчин . . мікроелементів містить такі солі (г/100 мл): ZnSO4 7H2O - 1,1; MnSO4H2O - 0,6; FeSO4 7H2O . . 0,1; CuSO4 5H2O - 0,004; CoSO4 7H2O - 0,03; H3BO3 - 0,006; KI - 0,0001; ЕДТА (Трилон Б) - 0,5. В одному з варіантів у середовище замість дріжджового автолізату і мікроелементів вносять (у різних комбінаціях) сульфат цинку і сульфат міді в концентрації 38 і 0,16 мкмоль/л відповідно, а також хлорид калію (0,21 ммоль/л). 1 UA 111501 C2 5 10 15 20 Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить як джерело вуглецю та енергії 0,5 % технічного гліцерину (об'ємна частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 М НСІ, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР штамом IMB В-7241 залежно від наявності дріжджового автолізату і мікроелементів у середовищі. Таблиця 1 Вплив дріжджового автолізату і мікроелементів на синтез ПАР за умов росту A.calcoaceticus IMB В-7251 на технічному гліцерині мікроелементі в Наявність у середовищі культивування дріжджового сульфату сульфату міді автолізату цинку хлориду калію 30 35 40 + 25 + + + + + + ПАР, г/л 1,0±0,05 (прототип) 4,5±0,22 4,7±0,24 5,2±0,26 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що за наявності сульфату міді і цинку у середовищі з технічним гліцерином концентрація синтезованих ПАР досягають максимального значення (5,2 г/л), що більш ніж у 5 разів вище, ніж згідно з прототипом. Ці дані узгоджуються з одержаними раніше про те, що внесення у середовище з очищеним гліцерином сульфату міді (0,15-0,17 мкмоль/л), сульфату цинку (37-39 мкмоль/л) і хлориду калію (0,20-0,22 ммоль/л) дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність A. Calcoaceticus IMB B-7241y 2,1-2,2 разу (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси) [Пат. 81801 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Конон А.Д., Парфенюк С.А. Опубл. 10.07.2013, Бюл. № 13]. Приклад 2. Залежність синтезу ПАР від концентрації технічного гліцерину у середовищі культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 Культивування штаму IMB Ас-5017 здійснюють в умовах, наведених у прикладі 1. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин у концентрації 2~6 % (об'ємна частка). У середовище вносять сульфат цинку і сульфат міді в концентрації 38 і 0,16 мкмоль/л відповідно. Тривалість культивування 120 і 168 год. Концентрацію синтезованих ПАР аналізують як описано у прикладі 1. Дані про синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі з різними концентраціями технічного гліцерину наведено у табл. 2. 2 UA 111501 C2 Таблиця 2 Вплив концентрації технічного гліцерину у середовищі культивування A. calcoaceticus IMB В7241 на синтез ПАР Концентрація гліцерину у середовищі, % 2 3 4 5 6 5 10 Тривалість культивування, год. 120 5,2±0,26 5,2±0,26 5,0±0,25 4,0±0,20 3,9±0,19 168 5,2±0,26 5,2±0,26 5,2±0,26 4,2±0,21 4,0±0,20 Отже, підвищення концентрації технічного гліцерину у середовищі до 6 % супроводжується зниженням синтезу ПАР, причому збільшення тривалості культивування продуцента не приводить до підвищення концентрації синтезованих ПАР. Приклад 3. Залежність синтезу ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 від концентрації сечовини у середовищі з технічним гліцерином Культивування штаму IMB Ас-5017 здійснюють в умовах, наведених у прикладі 1. Концентрація сечовини у середовищі становить 0,6-1,0 г/л, технічного гліцерину - 6-8 %. У середовище вносять сульфат цинку і сульфат міді в концентрації 38 і 0,16 мкмоль/л відповідно. Концентрацію синтезованих ПАР визначають як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР залежно від концентрації джерела азоту наведено у табл. 3. Таблиця 3 Вплив концентрації азоту на синтез ПАР за умов росту A. calcoaceticus IMB В-7241 на технічному гліцерині Концентрація гліцерину, % 6 7 8 15 20 Концентрація сечовини, г/л 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 ПАР, г/л 5,3±0,26 5,9±0,29 6,1±0,30 6,1±0,30 5,0±0,25 5,0±0,25 6,0±0,30 6,1±0,30 5,9±0,29 5,3±0,26 4,9±0,24 6,0±0,30 6,0±0,30 6,0±0,30 5,0±0,25 Наведені у табл. 3 дані свідчать, що за концентрації сечовини 0,7-0,9 г/л у середовищі з 68 % технічного гліцерину концентрація синтезованих ПАР становить 5,9-6,1 г/л. Отже, використання запропонованого способу дає змогу порівняно з прототипом підвищити у 5,9-6,1 разу (до 5,9-6,1 г/л) концентрацію синтезованих A. calcoaceticus IMB В-7241 поверхнево-активних речовин і вміст технічного гліцерину у середовищі культивування штаму IMB Ас-5017 з 2 до 6-8 % (об'ємна частка). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту 3 UA 111501 C2 сечовину, як джерело вуглецевого живлення - технічний гліцерин, 0,16 мкмоль/л сульфату міді і 38 мкмоль/л сульфату цинку, який відрізняється тим, що концентрація сечовини становить 0,70,9 г/л. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4