Спосіб моделювання оксидативного стресу у щурів

Реферат: Спосіб моделювання оксидативного стресу у щурів, у якому дослідним тваринам споюють систематично упродовж 14 діб оксидант - гіпохлорит натрію. UA 111832 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ У ЩУРІВ UA 111832 U UA 111832 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної біології і може бути застосована для моделювання оксидативного стресу у щурів та інших теплокровних для дослідження дії нових сполук з антиоксидантними властивостями. Відомий спосіб створення хронічного стресу різного рівня у щурів [Патент UA № 25759, МПК (2006) А61В 5/16. Спосіб моделювання хронічного стресу різного рівня у щурів / Г.Ю. Пишнов, Т.С.Брюзгіна (Україна). опубл. 27.08.2007. Бюл. № 13], згідно з яким ситуативний стресуючий подразник підсилюється дією світла у нічний час та електричним струмом порогової чутливості, а тривалість дії подразників продовжують до 10 місяців. Недоліком цього способу є дія на психоемоційний стан, за рахунок навантаження різного рівня, організму щура. Проте, цю модель не можна використати для розвитку окисного стресу у щурів. Відомий спосіб розвитку оксидативного стресу шляхом одноразового внутрішньошлункового уведення щурам водного розчину кадмію хлориду в дозі 7 мг/кг маси тіла тварини [Кирилів М.В. Оксидативний стрес у білих щурів за умов токсичного впливу іонів кадмію / М.В. Кирилів // Медична та клінічна хімія. - 2013. - Т. 15, № 4. - С 74-78]. Недоліком цього способу є токсичність важких металів, до яких належить кадмій. Найближчим за технічною суттю аналогом є спосіб виклику стресу у щурів шляхом уведення (per os) преднізолону в дозі 50 мг/кг упродовж 14 днів [Макеев А.А. Морфофункциональная организация пластинки роста тела позвонка крыс в условиях глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса и применения антиоксиданта тиофана / А.А. Макеев, А.В. Сахаров, А.Е. Просенко // Вестник КрасГАУ. - 2009. - № 6. - С. 105-108]. Недоліком цього способу є використання синтетичного препарату з групи глюкокортикоїдних гормонів - преднізолону, який може змінити гормональний статус організму. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб моделювання оксидативного стресу у щурів шляхом використання, як окисника, гіпохлориту натрію, що дасть змогу не порушити гормональний фон та не накопичувати шкідливі сполуки в організмі. Поставлена задача вирішується так, що у способі моделювання оксидативного стресу у щурів, згідно з корисною моделлю, тваринам споюють систематично упродовж 14 діб оксидант, причому як оксидант використовують гіпохлорит натрію. З літературних джерел [Сравнение методов инфракрасной лазерной терапии (ИКЛТ) и терапии гипохлоритом натрия при лечении больных хроническими диффузными заболеваниями печени / З.С. Скворцова, И.Ю. Стаценко, О.Ю. Свириденко и др. // Вест. Волгоград, мед. ун-та. (Сб. науч. тр.). - 2003. - № 9. - С. 121-123; Ребров А.П., Пономарева Е.Ю., Головачева Л.В. Применение раствора гипохлорита натрия при лечении больных пневмонией и хроническими неспецифическими заболеваниями легких // Методические рекомендации. Саратов, 1995. - 15 с; Растворы гипохлорита натрия для медицины и ветеринарии / А.Б. Величенко, Д.В. Гиренко, Т.В. Лукьяненко и др. // Вопр. химии и хим. технологии. - 2006. - № 6. С. 160-164] відоме використання гіпохлориту натрію в медицині при санації ран, для детоксикації організму. Він ефективно діє на різні токсини [Коцюмбас І. Перспективи застосування гіпохлоритів у ветеринарній медицині / І.Коцюмбас, Веліченко О., Коцюмбас Г. та ін. - Л.: ТзОВ ВФ "Афіша". - 2009. - 312 с]. Суттєвою перевагою гіпохлориту натрію як переносника активного кисню є те, що він дає змогу обійти ефект "білкового захисту" токсичних метаболітів. Гіпохлорит натрію постійно присутній в організмі, як один з головних компонентів природних факторів дезінтеграції інфекційного агента в лейкоциті. Гіпохлорит натрію у великих концентраціях здійснює негативний вплив на організм, веде до некрозів тканин, оскільки надлишок активного кисню пошкоджує ліпіди клітинних мембран шляхом їхнього окиснення. Відомо про здатність гіпохлориту (ОСl ) активувати процеси пероксидного окиснення ліпідів, як сильного окисника. ОСl реагує з органічним гідропероксидом без утворення синглетного кисню. Реакція протікає через вільнорадикальні стадії, з утворенням алкоксильних радикалів [Чеканов А.В., Панасенко О.М., Осипов А.Н. и др. Взаимодействие гипохлорита с гидропероксидом жирной кислоты приводит к образованию свободных радикалов. Биофизика. - 2005. -Т. 50, вып. 1. - С. 13-19]. Особливо чутливими до гіпохлориту натрію є ліпіди клітинних мембран і, більшою мірою ті, до складу яких входять ненасичені жирні кислоти. Гіпохлорит натрію окиснює ліпіди у складі ліпопротеїнів за вільнорадикальним механізмом. Реакційна здатність гіпохлориту натрію зменшується у такому порядку: ліпопротеїни дуже низької густини → ліпопротеїни низької густини → ліпопротеїни високої густини [Коцюмбас І. Перспективи застосування гіпохлоритів у ветеринарній медицині / І. Коцюмбас, О. Веліченко, Г. Коцюмбас та ін. - Л.: ТзОВ ВФ "Афіша".2009.-312с.]. Запропоновано спосіб моделювання оксидативного стресу у щурів шляхом індукції процесів ліпопероксидації за рахунок систематичного випоювання щурам розчину гіпохлориту натрію, 1 UA 111832 U 5 10 15 20 25 30 35 упродовж 14-ти діб. Під час уведення в організм цієї сполуки у концентрації 5 мг/л і 20 мг/л, а також після 7-денної реабілітації, інтенсивність процесів ліпопероксидації у крові щурів зростає. Переваги даної корисної моделі полягають в тому, що гіпохлорит натрію є сильним окисником, він віддає активний кисень для знешкодження токсичних сполук, проте, коли в організмі вони відсутні, він вступає в реакції із структурними компонентами клітин, зумовлюючи розвиток оксидативного стресу. Спосіб можна проілюструвати прикладами: Приклад 1. Вміст первинних та вторинних продуктів ліпопероксидації у плазмі крові щурів. Експериментальну частину роботи проводять на самцях безпородних білих щурів з репродуктора "Глеваха", Київської області, живою масою 180-200 г. Тварин підбирають за принципом аналогів, по 20 голів у кожній групі. Перша група тварин слугує контролем. Тваринам другої та третьої груп, протягом 14-ти діб, випоювання води замінюють випоюванням гіпохлориту натрію у концентраціях 5 і 20 мг/л відповідно. Розчини гіпохлориту натрію готують, використовуючи високоочищену воду, але не дистильовану. На 1-шу, 7-му та 14-ту доби досліду по п'ять тварин з кожної групи, декапітують під легким ефірним наркозом. Останні п'ять щурів з кожної групи залишають на реабілітацію, яка триває 7 діб. На 21-шу їх декапітують. На 1-шу, 7-му, 14-ту та 21 доби у декапітованих тварин відбирають зразки крові. З гепаринізованої крові відбирають плазму для дослідження. У відібраних зразках плазми визначають інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів за вмістом первинних продуктів ліпопероксидації - гідропероксидів за способом Олексюка Н.П. - та вторинних продуктів ліпопероксидації - ТБК-активних продуктів (продуктів, які реагують з тіобарбітуровою кислотою), використовуючи спосіб Тимирбулатова P.P. [Олексюк Н.П., Янович В.Г. Активність про- і антиоксидантних систем у печінці прісноводних риб у різні пори року // Український біохімічний журнал. - 2010. - Т. 82, № 3. - С 41-48; Тимирбулатов Р.А., Селезнев Е.И. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидосодержащих компонентов крови и его диагностическое значение // Лаб. дело. - 1981. - № 4. - С. 209-211]. Кількість білка у кожному зразку визначають за способом Лоурі. Встановлено, що на 1-шу та 7-му доби дії гіпохлориту натрію, концентрацією 5 мг/л, вміст ТБК-активних продуктів залишається в межах контрольних значень. Проте, дія гіпохлориту натрію, концентрацією 20 мг/л, у плазмі крові щурів зумовлює значну інтенсифікацію процесів ліпопероксидації: на 1-шу добу досліду вміст ТБК-активних продуктів зростає на 254 %, а на 7му добу - на 139 %. На 14 добу, у плазмі щурів, відбувається незначне підвищення вмісту вторинних продуктів ліпопероксидації на 12 %, за дії гіпохлориту натрію, нижчої досліджуваної концентрації. Збільшення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів на 29 % проходить і за дії гіпохлориту натрію вищої концентрації. На 21 добу, після дії гіпохлориту натрію, концентрацією 5 мг/л, у плазмі крові щурів відбувається незначне зниження вмісту ТБК-активних продуктів, тоді як після дії гіпохлориту натрію, концентраціією 20 мг/л, навпаки, вміст вторинних продуктів ліпопероксидації значно підвищується на 147 % відносно контролю (табл. 1). 40 Таблиця 1 Вміст ТБК-активних продуктів у плазмі крові щурів за дії гіпохлориту натрію (мкмоль/мг білка) 1 доба КонтГХН5 ГХН20 роль 0,219± 0,220± 0,778± 0,003 0,002 0,003*** 45 7 доба 14 доба 21 доба КонтКонтКонтГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 роль роль роль 0,218± 0,222± 0,521± 0,222± 0,248± 0,286± 0,219± 0,210± 0,547± 0,002 0,005 0,002*** 0,006 0,004 0,008 0,003 0,0009* 0,016*** Гіпохлорит натрію, за концентрації 5 мг/л, зумовлює значне підвищення вмісту гідропероксидів у плазмі крові щурів упродовж усього досліду. За дії гіпохлориту натрію, концентрацією 20 мг/л, на 1-шу добу вміст гідропероксидів у плазмі є в межах норми, проте вже з 7-ї доби вміст первинних продуктів ліпопероксидації підвищується: на 7-му добу - на 22 %, на 14-ту добу - на 7 %; на 21-шу добу - на 105 %, відносно контрольних значень. Після реабілітаційного періоду у крові щурів відбувається значне збільшення вмісту гідропероксидів, що свідчить про порушення системи прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу, навіть після припинення дії гіпохлориту натрію на організм (табл. 2). 50 2 UA 111832 U Таблиця 2 Вміст гідропероксидів у плазмі крові щурів за дії гіпохлориту натрію (ум. одиниць/мг білка) 1 доба 7 доба 14 доба КонтКонтКонтГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 роль роль роль 0,969± 1,913± 0,955± 0,975± 1,529± 1,186± 0,971± 0,004 0,034*** 0,004* 0,004 0,023*** 0,005*** 0,005 5 10 15 20 ГХН5 1,577± 0,039*** 21 доба (реабілітація) КонтГХН20 ГХН5 ГХН20 роль 1,035± 0,972± 3,182± 1,997± 0,005*** 0,006 0,135*** 0,018 Отже, гіпохлорит натрію у концентрації 5 мг/л зумовлює утворення, більшою мірою, первинних продуктів ліпопероксидації, тоді як гіпохлорит натрію у концентрації 20 мг/л - і первинних продуктів ліпопероксидації і вторинних (ТБК-активних продуктів). Приклад 2. Для вивчення дії гіпохлориту натрію на активність ферментів антиоксидантної системи, яка захищає клітини від окисного стресу дослід проводять аналогічно до прикладу 1. У зразках крові, а саме у плазмі, визначають активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази за методами Костюка В.А., Королюка М.А., Моіна В.М. відповідно [Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.М. Простой и чувствительной метод определения СОД, основаный на реакции окисления кверцитина // Вопросы мед. химии. - 1990. - Т. 36, № 2. - С. 8891; Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19; Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в еритроцитах // Лабораторное дело. - 1986. № 2. - С. 724-727]. За дії гіпохлориту натрію, у концентрації 5 мг/л, встановлено зростання активності супероксиддисмутази упродовж усього досліду. Так, на 1-шу добу дії досліджуваної сполуки активність ферменту зростає на 127 %, на 7-му - на 86 %, на 14-ту - на 158 % і на 21-шу - на 312 % (табл. 3). Після реабілітаційного періоду активність супероксиддисмутази не спадає, а, навпаки, значно зростає, що свідчить про розбалансування прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у плазмі крові щурів, а, відповідно і про зростання окисного стресу. Таблиця 3 Зміна активності супероксиддисмутази у плазмі щурів за дії гіпохлориту натрію (од. активності/хв мг білка) 1 доба Контроль 14 доба 21 доба КонтКонтК.+ ГХН5 ГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 ГХН5 роль роль ГХН20 13894,37 7802,88 3421,72 11183,63 16479,46 4185,69 3982,95 4185,69 4385,03    4014,68 10359,44  3998,39     178,653* 191,269 88,909* 176,356 317,192*** 184,853* 189,235 382,619* 67,132 120,511 130,973 120,511 ** *** * ** ** 25 30 7 доба КонтГХН20 роль На фоні зростання активності супероксиддисмутази, активність каталази і глутатіонпероксидази спадають упродовж досліду за дії гіпохлориту натрію концентрацією 5 мг/л, у плазмі (табл. 4, 5). Гіпохлорит натрію у концентрації 20 мг/л у плазмі щурів зумовлює спадання активності супероксиддисмутази на 7-му добу досліду і зростання - на 14-ту, а також спадання активності каталази і глутатіонпероксидази упродовж досліду. 3 UA 111832 U Таблиця 4 Зміна активності каталази у плазмі щурів за дії гіпохлориту натрію (мкмоль Н 2О2/хв мг білка) 21 доба (реабілітація) КонтКонтКонтКонтГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 ГХН5 роль роль роль роль 0,029± 0,004± 0,021± 0,028± 0,011± 0,012± 0,029± 0,014± 0,01± 0,028± 0,011± 0,007 0,001* 0,001 0,007 0,002 0,0009* 0,007 0,001* 0,0005* 0,007 0,0008 1 доба 5 7 доба 14 доба ГХН20 0,0147± 0,002 Наведені результати доводять, що гіпохлорит натрію у концентрації 5 мг/л і 20 мг/л зумовлює порушення роботи ферментів антиоксидантного захисту. Це свідчить про розвиток окисного стресу за дії досліджуваного чинника у плазмі крові клінічно здорових щурів. Таблиця 5 Зміна активності глутатіонпероксидази у плазмі щурів за дії гіпохлориту натрію (мкмоль G-SH/хв мг білка) 21 доба (реабіліт ація) КонтКонтКонтКонтГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 ГХН5 ГХН20 ГХН5 К.+ГХН20 роль роль роль роль 136,12 55,49± 75,01± 134,02 119,32 65,47± 134,05 55,34± 73,77± 132,46± 56,25± 67,22± ±14,31 3,55** 3,88** ±10,78 ±3,46 5,66*** ±11,49 3,06*** 5,19** 10,77 4,59*** 1,64** 1 доба 10 15 7 доба 14 доба Щоб змоделювати оксидативний стрес доцільно замість води для випоювання використовувати розчин гіпохлориту натрію упродовж 14 діб. Після 7-денної реабілітації окисний стрес не нівелюється, а, навпаки, посилюється, про що свідчить вміст первинних та вторинних продуктів ліпопероксидації, а також зміна активності ферментів антиоксидантної системи у плазмі крові щурів. Уведення цієї речовини не призводить до зміни гормонального статусу організму. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб моделювання оксидативного стресу у щурів, за яким дослідним тваринам споюють систематично упродовж 14 діб оксидант, який відрізняється тим, що як оксидант використовують гіпохлорит натрію. 20 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4