Спосіб оцінки впливу поліморфізмів м235т гена agt на ефективність диференційованої профілактики та лікування хворих з цукровим діабетом 2 типу і артеріальною гіпертензією за понятовською т.ю.

Реферат: Винахід належить до способу оцінки впливу поліморфізмів М235Т гена AGT на ефективність диференційованої профілактики і лікування хворих з цукровим діабетом 2 типу та артеріальною гіпертензією шляхом визначення поліморфізмів гену AGT, при якому досліджують наявність поліморфізмів гена AGT методом піросеквенування і при визначенні гомозиготного генотипу визначають як більш ефективний нефропротекторний блокатор ангіотензин-1 (Лозартран). UA 112939 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до області медицини, а саме ендокринології, кардіології і нефрології, і може бути використаним для оцінки ролі генетичних факторів фармакологічного ризику в профілактиці розвитку та лікуванні хворих з цукровим діабетом 2 типу та артеріальною гіпертензією. Поширеність цукрового діабету (ЦД), в середньому, становить 1-3 % в різних популяціях, в деяких країнах може досягати 6 %. Станом на 2010 рік близько 120 мільйонів людей страждали на цукровий діабет у всьому світі. За даними статистичних досліджень, кожні 10-15 років кількість людей, що хворіють на діабет, подвоюється, таким чином, цукровий діабет стає медико-соціальною проблемою. В Україні на 1 січня 2009 року було зареєстровано 1099824 хворих на цукровий діабет. Слід відзначити, що кількість осіб з недіагностованим діабетом перевищує цей показник у 3-4 рази. Незалежно від механізмів розвитку, загальною рисою всіх типів діабету є стійке підвищення рівня глюкози в крові і метаболічні порушення в тканинах, що не здатні засвоювати глюкозу. Стійке підвищення концентрації глюкози в крові негативно впливає на стан багатьох органів і тканин, і, зрештою, призводить до розвитку таких ускладнень як діабетична нефропатія (ДН). Недостатньо вивченими питаннями діабетології залишаються патогенетичні механізми ураження нирок у хворих на ЦД 2 типу, а також чинники, що визначають темпи прогресування даного ускладнення. Це є тим більш важливим, що поширеність ДН зростає, більшою мірою за рахунок хворих на ЦД 2 типу. Стан проблеми зумовлює спрямованість зусиль на пошук засобів профілактики розвитку та прогресування ниркової патології в хворих на ЦД 2 типу. Найбільш близьким до заявленого технічного рішення є розробка, в якій рекомендовано проводити аналіз поліморфізму зазначених генів з метою визначення прогнозування перебігу діабетичної нефропатії (1). Однак у вказаній роботі при дослідженні не враховано вплив блокаторів РАС на діяльність нирки при цукровому діабеті, який визначається пригніченням секреції цитокінів склерозуючої та протизапальної дії, разом з тим, не вивчені ангіотензин II - залежні механізми патогенезу ДН. В основу винаходу поставлено задачу вдосконалення способу визначення впливу поліморфізму генів АПФ, ангіотензиногену та рецепторів до ангіотензину на ефективність профілактики і лікування хворих з цукровим діабетом 2 типу та артеріальною гіпертензією шляхом дослідження клініко-генетичних паралелей особливостей ренопротекторної дії антагоніста АТ1-рецепторів ангіотензину II в залежності від наявності порівняльного аналізу AGT поліморфізму гена М235Т та обґрунтування диференційованого вибору блокаторів ангіотензин-І - перетворюючого ферменту (Еналаприл) і антагоніста AT-1-рецепторів ангіотензину II (Лозартан), що дозволить підвищити ефективність профілактики та лікування хворих з ЦД та артеріальною гіпертензією. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з винаходом, досліджують наявність поліморфізмів гена AGT методом піросеквенування і при визначенні гомозиготного генотипу визначають як більш ефективний нефропротекторний блокатор ангіотензин-1 (Лозартран). Спосіб виконується наступним чином. Дослідження в зазначеному обсязі проводилися двічі - на початку лікування і безпосередньо перед випискою із стаціонару. Як додатковий діагностичний та прогностичний критерій був оцінений поліморфізм М235Т гена AGT. Геномна ДНК із зразків крові виділена за допомогою наборів Genomic DNA purification Kit (Fermentas). Виділена ДНК ампліфікована методом мультиплексної TouchDown ПЛР HotStartTag DNA Polymerase з використанням набору Maxima Hot Start PCR master mix (Fermentas) і 10 пкмоль специфічних праймерів для аналізованих SNP гена АСЕ і AGT: 95 °C 15 хв, 10 циклів 95 °C - 30 с, 65 °C - 1 хв, із зниженням температури на 1,07 цикл.; 30 циклів, 95 °C 30 с; 60 °C - 30 с, 72 °C - 45 с, 72 °C - 10 хв. Аналіз SNP проведений методом піросеквенування з дослідженням набору Pyro Gold Reagents фірми Qiagen та 7 пкмоль специфічних секвенуючих праймерів до АСЕ і AGT, згідно методики піросеквенування (Qiagen). Аналіз поліморфізму проводили на приборі PyroMark Q96 ΜΑ. Дизайн праймерів для піросеквенування і специфічної ампліфікації rs4340 (Ins>Del Intron 16 ген АСЕ) та rs4762 гена М235Т/гена AGT виконано за допомогою програми PSQ Assay Design. Лікування хворих на ЦД 2 типу проводилося за стандартною схемою із застосуванням препаратів сульфаніл-сечовини, бігуанідів та засобів, що знижують цукор крові. Всі пацієнти одержували збалансоване харчування (дієта № 9). Як антигіпертензивна терапія та з метою органопротекції у пацієнтів І групи застосований ІАПФ Еналаприл ("Берліпріл", BerlinPharmaMenarini, Німеччина) у дозі 5-20 мг двічі на добу. У пацієнтів II групи застосований БРА Лозартан 1 UA 112939 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 ("Лозап", Zentiva, Словакія) у дозі по 10 мг двічі на добу. Дозування підбиралося індивідуально, залежно від рівня артеріальної гіпертензії, маси тіла та ступеня протеїнурії. Було обстежено 74 пацієнтів із ЦД 2 типу та АГ, середній вік складав 58,8±6,8 років. У дослідження не включали пацієнтів із ЦД І типу, важкими коморбідними станами (злоякісні пухлини, гострі та хронічні вірусні інфекції). Усіх пацієнтів було обстежено згідно Наказів МОЗ України № 1118 від 21.12.2012, № 384 від 24.05.2012 та уніфікованими клінічними протоколами з надання первинної та вторинної медичної допомоги хворим на ЦД 2 типу та артеріальну гіпертензію. Усі пацієнти отримували стандартне лікування пероральними цукрознижувальними засобами, найчастіше Метформіном, Глімепіридом або комбінацією Метформіну з інгібітором Дипептилпептидази-4. Хворим призначали прийом Еналаприлу в добовій дозі 5-20 мг у 2 прийоми з 12-годинним інтервалом в залежності від маси тіла, початкових значень AT та протеїнурії. Для діагностики мікроальбумінурії було використано імуноферментний метод визначення "Micral-Test" (Boehringer Mannheim, Австрія). Швидкість клубочкової фільтрації обчислювали за формулою CKD-EPI (2). Поліморфізми гена AGT оцінювали за стандартною методикою. Геномну ДНК було виділено з лейкоцитів венозної крові за допомогою набору реагентів "ДНК-сорб-В" (ІнтерЛабсервіс, Російська Федерація). Поліморфні варіанти гена AGT оцінювали методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням комплектів реагентів для ампліфікації "SNP-експрес" виробництво ТОВ НВФ "Літех", Російська Федерація). ПЛР проводили на ампліфікаторі BIO-RAD (США). Для ампліфікації використовували 100-150 нг ДНК. Початкова денатурація при температурі 95 °C тривалістю 10 хв ПЛР протягом 40 циклів: денатурація при 95 °C - 30 с, відпалювання при температурі 64 °C - 30 с, елонгація при 72 °C протягом 30 с та остаточна елонгація 3 хв при 72 °C. Розділення продуктів ампліфікації проводили в горизонтальному 2 % агарозному гелі, приготовленому на одноразовому трис-боратному буфері. Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням програмного забезпечення Statistica 10.0 (StatSoft, США). Нормальність розподілу ознак було перевірено згідно з критеріями Шапіро-Уілка, статистичну достовірність розбіжностей між групами оцінювали за допомогою дисперсійного аналізу ANOVA. Показники мікроальбумінурії. Зважаючи на розподіл показників, відмінний від нормального, аналізували з використанням непараметричних методів. Гомозиготність за функціонально ослабленими поліморфізмами ангіотензиногену було визначено у 11 (14,86 %) досліджуваних осіб (Табл. 1), що достовірно не перевищує середні показники для загальної Європейської популяції. За даними популяційних досліджень, серед здорових осіб частка монозиготних носіїв Т-алелі сягає 10 % [9]. Поясненням даного явища може слугувати наявність в дослідженні значної кількості пацієнтів похилого віку із вже реалізованим генетичним ризиком за участі численних екзогенних факторів, що не підлягали оцінюванню. У таблиці 1 наданий розподіл пацієнтів за генотипом AGT та розповсюдженість різних алельних варіантів серед здорових європейців-представників однорідних етнічних груп. Таблиця 1 ММ (абс, %) Гіпертензивні пацієнти з ЦД 2 типу в Одеському регіоні, n=74 A. Mondry, 2005, Німеччина (n=720, нормотензивні пацієнти) Л. Фіщук, Київ, Україна (n=102, нормотензивні жінки) Нгуен Тхи Чанг, Т.П. Шкурат, 2010, Ростовська обл., РФ (n=159, нормотензивні пацієнти) E. Androulakis, 2013, Греція (n=193, нормотензивні пацієнти) 45 МТ (абс, %) ТТ (абс, %) 20 (27,045) 43 (58,1 %) 11 (14,86 %) 231 (32,1 %) 450 (63,3 %) 33 (4,6 %) 32 (31,37 %) 55 (53,92 %) 15 (14,71 %) 122 (76,5 %) 26 (16,2 %) 11 (7,3 %) 64 (33,1 %) 112 (58 %) 17 (7,2 %) Усі пацієнти після розподілу на групи за генотипом AGT були співставними за віком та основними клінічними характеристиками. Однак достовірно найменшу тривалість ЦД II типу (p тттм = 0,009, pтт-тм = 0,002, pтт-тм = 0,37) із одночасно найбільш вираженою нирковою дисфункцією у вигляді зниження ШКФ (pтт-тм = 0,007, pтт-тм = 0,001, pтт-тм = 0,34 та високих показників мікроальбумінурії було зафіксовано у пацієнтів із ТТ гаплотипом гена AGT (p тт-тм = 0,0001, pтт-тм = 2 UA 112939 C2 0,012, pтт-тм = 0,06), що може бути свідченням нефроальтеруючого потенціалу Т-алелі у пацієнтів із таким типом коморбідності. Клінічна характеристика пацієнтів з ЦД 2 типу та АГ в залежності від поліморфізму М235Т гена AGT до початку лікування наведена в таблиці 2. 5 Таблиця 2 Параметр Середній вік пацієнтів, років Середня тривалість ЦД, років Середні рівні офісного CAT, мм рт. ст. Середні рівні офісного ДАТ, мм рт. ст. Сечовина сироватки, ммоль/л Креатинін сироватки, кмоль/л 2 ШКФ, мл/хв./1,73м Мікроальбумінурія*, мг/добу ММ (n=20) МТ (n=43) ТТ (n=11) Ρ 60,6±7,88 58,3±6,62 59,0±6,57 0,601 10,6±2,1 9,77±3,0 7,7±2,4 0,007 139,7±9,2 139,7±10,5 144,9±14,1 0,247 89,3±7,3 89,8±6,9 87,0±6,1 0,309 5,12±0,9 5,22±0,9 5,25±1,1 0,942 88,0±13,3 90,2±9,2 90,2±20,1 0,938 83,0±10,8 78,2±15,4 67,4±11,5 0,005 216 (67-230) 128 (11-220) 326 (30-412) 0,001 *Усі дані в таблиці подано у форматі M±SD, окрім показника мікроальбумінурії, що представлений у вигляді медіани з максимумом та мінімумом в кожній із досліджуваних груп. Клінічна характеристика пацієнтів з ЦД 2 типу та АГ в залежності від поліморфізму М235Т гена AGT через 12 тижнів лікування Еналаприлом представлена в таблиці 3. Таблиця 3 ММ (n=20) Середні рівні офісного CAT, 125,1±8,3 мм рт. ст. Середні рівні офісного ДАТ, *80,6±5,3 мм рт. ст. Сечовина сироватки, 4,9±0,8 ммоль/л Креатинін сироватки, кмоль/л 81,9±12,4 2 ШКФ, мл/хв/ 1,73 м 83,0±11,5 Мікроальбумінурія**, мг/добу *79 (50-166) МТ (n=43) ТТ (n=11) 139,2±9,0 143,3±12,4 88,9±5,6 87,6±5,6 4,8±0,8 5,3±1,0 88,4±17,1 77,7±15,2 *102 (0-250) 86,5±16,4 68,3±11,0 345 (40-430) * р