Спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності сироватки крові

Реферат: Спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності сироватки крові включає визначення у сироватці крові вмісту церулоплазміну та трансферину. Додатково визначають вміст сульфгідрильних груп та розраховують інтегральний показник, що характеризує стан антиоксидантної ємності сироватки крові шляхом визначення суми співвідношень вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп хворого до їх аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків. UA 113602 U (54) СПОСІБ ІНТЕГРАЛЬНОЇ ОЦІНКИ АНТИОКСИДАНТНОЇ ЄМНОСТІ СИРОВАТКИ КРОВІ UA 113602 U UA 113602 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до галузі медицини, зокрема до лабораторної діагностики (клінічної біохімії), і може бути використаним для інтегральної оцінки антиоксидантної ємності сироватки крові та оцінки виразності антиоксидантного захисту організму як в умовах клініки, так і в умовах експерименту, як у дорослих, так і у дітей. Як відомо, вільнорадикальне окислення - природний метаболічний процес в усіх органах і тканинах. Кисневий гомеостаз, баланс оксигеназних та оксидазних реакцій, рівновага між швидкістю перекисного окислення ліпідів та активністю антиоксидантної системи захисту у фізіологічних умовах постійно підтримуються самим організмом. Підсилення процесів перекисного окислення ліпідів внаслідок порушення рівноваги в системі "оксидантиантиоксиданти" є неспецифічним процесом та має місце у розвитку різних патологічних станів. Надлишок утворення активних форм кисню має значну цитотоксичну дію і може бути причиною ушкодження та загибелі клітин. Внутрішньоклітинний захист від вільних радикалів здійснюється завдяки функціонуванню ферментативної та неферментативної ланок ендогенної антиоксидантної системи. Дисбаланс системи "оксиданти-антиоксиданти" грає ключову роль у розвитку різних патологічних станів та є ознакою оксидативного стресу. Останнім часом активно ведеться пошук інтегрального показника для оцінки спроможності антиоксидантної системи (антиоксидантної ємності), як міри метаболічної відповіді організму на патологічний процес, протистояти оксидативному стресу. Відомий спосіб дослідження загальної антиоксидантної активності сироватки крові (1), який полягає в оцінці здібності пригнічувати продукцію перекисного окислення ліпідів шляхом додавання до сироватки крові речовини, що має окислювальні властивості. Недоліком дослідження є те, що спосіб надає досить спрощене уявлення щодо багатокомпонентної системи антиоксидантного захисту сироватки крові (визначають один загальний показник) та відсутня спроба дати інтегральну оцінку антиоксидантної системи сироватки крові в цілому. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення антиоксидантної системи церулоплазмін-трансферин сироватки крові у хворих на хронічну хворобу нирок, які лікуються програмним гемодіалізом (2), взятий нами за прототип, який включає визначення у сироватці крові вмісту церулоплазміну та трансферину. Недоліком способу є те, що визначають та розраховують лише два компоненти антиоксидантної системи сироватки крові, які аналізують окремо. Крім цього спосіб має конкретно обмежену, а не універсальну спрямованість - визначення перелічених показників тільки у хворих на хронічну хворобу нирок УД стадії. Спроба дати інтегральну оцінку антиоксидантної ємності сироватки крові в цілому також відсутня. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності крові шляхом визначення у сироватці крові вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп як важливих компонентів антиоксидантної системи сироватки крові та для більш вираженої інформативності та індивідуалізації дослідження введення математичного розрахунку суми співвідношень вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп хворого до їх аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків (антиоксидантна ємність сироватки крові), що, в свою чергу, дозволить використовувати цей показник залежно від його кількісних величин для своєчасної оцінки виразності антиоксидантного захисту сироватки крові, тобто своєчасної діагностики порушень антиоксидантної ємності крові та виявлення на цій підставі дисбалансу оксидантних та антиоксидантних процесів, прогнозування перебігу хвороби та ефективності терапевтичних заходів щодо відповідних патологічних станів. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності сироватки крові, що включає визначення у сироватці крові вмісту церулоплазміну та трансферину, згідно з корисною моделлю, додатково визначають вміст сульфгідрильних груп та розраховують інтегральний показник, що характеризує стан антиоксидантної ємності сироватки крові, шляхом визначення суми співвідношень вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп хворого до їх аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків, і, якщо величина антиоксидантної ємності сироватки крові, яку оцінюють за її здібністю пригнічувати продукцію перекисного окислення ліпідів, у середньому дорівнює 1,0, це свідчить про відсутність порушень з боку універсальної системи антиоксидантного захисту та про збалансовану рівновагу між процесами пероксидації та антиоксидантною ємністю сироватки крові (антиоксидантною відповіддю організму), якщо цю величину реєструють вищою за 1,0 - про підвищення процесів антиоксидантного захисту та компенсаторну реакцію організму у відповідь на підсилення процесів оксидації, а якщо нижчою за 1,0 - про зниження антиокислювального потенціалу організму, певне виснаження системи 1 UA 113602 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антиоксидантного захисту та про опосередковане порушення балансу оксидантних та антиоксидантних реакцій у бік надлишкового утворення ліпідних пероксидів та розвитку оксидативного стресу. Спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності крові виконують наступним чином: у сироватці крові визначають вміст церулоплазміну: в пробірку беруть 0,1 мл сироватки крові (без ознак гемолізу) і додають 8,0 мл 0,4 Μ ацетатного буферу рН 5,5 та 1,0 мл 0,5 % водного розчину р-фенілендіаміну солянокислого (субстрат), проби струшують та інку-бують 60 хвилин при 37 °C, після чого реакцію зупиняють додаванням 2,0 мл 3 % розчину фтористого натрію, перемішують та витримують у холодильнику протягом 30 хвилин при +4 °C. Оптичну щільність інтенсивності забарвлення вимірюють на фотоелектроколориметрі при 530 нм у кюветах діаметром 10 мм проти контрольної проби, у яку розчини буферу та субстрату вносять після внесення розчину 3 % фтористого натрію та припинення реакції. Розрахунок показників здійснюють помножуючи отримані дані абсорбції (Е) на коефіцієнт К (який дорівнює 0,875) та виражають величину концентрації церулоплазміну в г/л; вміст трансферину: в пробірку беруть 0,1 мл сироватки крові (без ознак гемолізу) і додають 1,0 мл 0,2 % розчину амоній-залізо (III) цитрат дегідроцитрату (рН 5,5-5,8). Інтенсивність помутніння вимірюють проти контролю (замість 0,1 мл сироватки крові беруть 0,1 мл води) на фотоелектроколориметрі при 440 нм у кюветах діаметром 3 мм. Через 30 хвилин вимірювання повторюють (проби стоять при кімнатній температурі). Результати розраховують за різницею екстинцій дослідної та контрольної проби після 1 -ї та 30-ї хвилини, яку помножують на 100 та виражають в умовних одиницях; вміст сульфгідрильних груп: у скляну пробірку на 20 мл беруть 0,1 мл сироватки крові, додають 1 мл дистильованої води, 1 мл 6,0 Μ розчину калію йодиду, 3 краплі 5 % розчину крохмалю та 3,9 мл 0,1 Μ фосфатного буферу рН 7,6 (загальний об'єм 6 мл), проби перемішують. Так само готують контрольну пробу, додаючи замість 0,1 мл сироватки крові 0,1 мл дистильованої води. Вимірюють оптичну щільність досліджуваної проби за допомогою фотоелектроколориметра КФК-3 в кюветі з товщиною шару 20 мм проти дистильованої води, довжина хвилі 500 нм. Потім в пробу вносять 0,3 мл 0,001Н розчину молекулярного йоду, ретельно струшують і колориметрують рівно через 10 секунд після внесення йоду, час контролюють секундомером. Контроль колориметрують аналогічно. Кількість сульфгідрильних груп (SH-груп) визначають за кількістю йоду (в еквівалентах), який провзаємодіяв з тіогрупами. Розрахунок проводять за формулою: Х = 0,3·(Ек-Ед)/Ек, де X - кількість SH-груп (мкмоль); 0,3 - кількість йоду, що вносять в пробу (мікроеквіваленти), Ек та Ед - екстинції контролю та досліду; розрахунок антиоксидантної ємності сироватки крові (АОЄc) - інтегрального показника, що характеризує стан антиоксидантної ємності крові, шляхом розрахунку суми співвідношень вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп хворого до їх аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків, за формулою: АОЄс = [(ЦПх/ЦПк + Трх/Трк + SHx/SHк): 3], де АОЄс - антиоксидантна ємність сироватки крові; ЦП х - вміст церулоплазміну у хворого; ЦПк - вміст церулоплазміну контролю (середнє значення); Трх - вміст трансферину у хворого; Трк - вміст трансферину контролю (середнє значення); SHx - вміст сульфгідрильних груп у хворого; SHк - вміст сульфгідрильних груп контролю (середнє значення); 3 - кількість доданків. Необхідність визначення та використання показників вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп обумовлена тим, що перелічені показники є представниками різних ланок універсальної системи антирадикального захисту та у сумі дають узагальнюючу відповідь цієї системи на реакцію пероксидації в цілому. Урахування ж загальної відповіді системи антиоксидантного захисту на накопичення пероксидів у сироватці крові з обчисленням кількості доданків слугує для більш вираженої об'єктивізації способу, тобто надає отриманим результатам більшої інформативності в інтегральній оцінці антиоксидантної ємності та опосередковано в оцінці оксидантно-антиоксидантної рівноваги у сироватці крові. Апробація способу, що заявляється, проведена у відділах нефрології та діалізу та еферентних технологій і у лабораторії біохімії ДУ "Інститут нефрології НАМН України" у 137 хворих віком від 18 до 59 років із верифікованим діагнозом - хронічна хвороба нирок (І-V стадії), а також у 30 практично здорових осіб того ж віку з нормальними аналізами крові та сечі та без захворювань нирок в анамнезі (група контролю). Отримані результати показали, що в сироватці крові групи контролю вміст церулоплазміну за середніми значеннями становить - 0,218±0,011 г/л, вміст трансферину - 5,0±1,0 ум. од., вміст сульфгідрильних груп - 2,22±0,02 ммоль/л, розрахунок антиоксидантної ємності сироватки крові дорівнює 1,0±0,1. 2 UA 113602 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наводимо приклади практичного застосування способу. Приклад 1. Хвора Я.І.В., 34 роки, тематична карта № 374. Звернулася зі скаргами на дизурію та періодичний біль у надлобковій ділянці. Хворіє з 19 років, впродовж останніх двох років 9 рецидиви кожні 2-3 місяці. Загальний аналіз крові: L-7,5×10 /л; ШОЕ - 12 мм/год.; С-реактивний протеїн - 10,9. Загальний аналіз сечі: непрозора, білок - 0,09 г/л; L-15-20 у п/з; бактерії - багато. 6 Бактеріологічне дослідження сечі: Е. соlі × 10 КУО/мл. Клінічний діагноз: Хронічна хвороба нирок І ст.: неускладнений пієлонефрит, рецидивуючий перебіг. При застосуванні запропонованого способу виявлено, що в сироватці крові вміст церулоплазміну становить 0,246 г/л (при 0,218±0,011 у контролі), вміст трансферину - 6,2 ум. од. (при 5,0±1,0 у контролі), вміст сульфгідрильних груп - 2,34 ммоль/л (2,22±0,02 у контролі), антиоксидантна ємність сироватки крові дорівнює 1,2, тобто має місце незначне підвищення цього показника, що свідчить про компенсаторне підсилення процесів антиоксидантного захисту у відповідь на певне порушення у сироватці крові цієї хворої балансу оксидантних та антиоксидантних реакцій у бік активації утворення ліпідних пероксидів та про необхідність проведення корекції відповідних терапевтичних заходів. Приклад 2. Хворий Б.О.Б., 39 років, а. к. № 1215. Клінічний діагноз: хронічна хвороба нирок V стадії, хронічний гломерулонефрит. Артеріальна гіпертензія. Вторинна анемія. Хворіє на хронічний гломерулонефрит протягом 14 років, лікується програмним гемодіалізом протягом останніх 3 років. Загальний стан хворого стабільний, відносно задовільний. Скарг немає. Об'єктивно: шкіра бліда, набряки відсутні. Тони серця приглушені, акцент II тону на аорті. Аускультація: дихання над легенями везикулярне. Живіт без особливостей. Аналіз крові: 12 гемоглобін 97 г/л (Ν 130-160), еритроцити 3,0×10 /л (Ν 4,0-5,0), сечовина 32,0 ммоль/л (Ν 3,87,3), креатинін 0,97 ммоль/л (Ν 0,04-0,11), загальний білок 56,0 г/л (Ν 66-87), альбумін 43,1 г/л (Ν 35-50). Добовий діурез 420 мл, білок сечі 1,2 г, питома вага до 1,007. При застосуванні запропонованого способу виявлено, що в сироватці крові вміст церулоплазміну становить 0,132 г/л (0,218±0,011 у контролі), вміст трансферину - 1,3 ум. од. (5,0±1,0 у контролі), вміст сульфгідрильних груп - 0,98 ммоль/л (2,22±0,02 у контролі), при цьому антиоксидантна ємність сироватки крові дорівнює 0,43, тобто має місце суттєве зниження цього показника у сироватці крові хворого, що свідчить про певне виснаження антиоксидантного потенціалу сироватки крові та опосередковано - про порушення балансу оксидантних та антиоксидантних реакцій у бік надлишкового утворення ліпідних пероксидів і розвитку оксидативного стресу, а також про необхідність перегляду протоколу лікування у цього пацієнта (призначення антиоксидантів тощо). З наведених прикладів видно, що у обстежених пацієнтів кожний із досліджуваних компонентів антиоксидантної системи окремо характеризує стан антиоксидантної відповіді організмуна накопичення пероксидів у сироватці крові, але тільки застосування способу, що заявляється, дозволяє дати інтегральну інформативну оцінку виразності антиоксидантної ємності сироватки крові індивідуально у кожного хворого, тобто дати об'єктивну оцінку стану антиоксидантного захисту цього позаклітинного середовища у кожного пацієнта. Отже, суттєвою перевагою способу, що заявляється, є застосування інтегрального показника, що характеризує стан антиоксидантної ємності у сироватці крові, який об'єктивно відбиває стан антиоксидантної відповіді організму у цьому позаклітинному середовищі на підсилення процесів пероксидації індивідуально у кожного пацієнта. До переваг способу також належить доступність устаткування та необхідних реактивів вітчизняного виробництва, що сприяє можливості його практичного використання у будь-якій клініко-діагностичній лабораторії. Спосіб, що заявляється, може бути використаним у пацієнтів різних вікових груп в умовах клініки, а також в експериментальних дослідженнях для оцінки перебігу та прогнозу хвороби та ефективності лікування шляхом своєчасної оцінки метаболічних зрушень та ефективності їх корекції. Використання відносних одиниць усуває залежність кінцевого результату показника, що досліджують, від методів та умов визначення, одиниць виміру тощо, а також в рамках стандартизації (уніфікації) лабораторного процесу надає можливість співставлення результатів досліджень, які отримують в різних лабораторіях, їх клінічної оцінки та можливості використання при ретроспективному аналізі отриманих раніше даних. Таким чином, спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності сироватки крові потребує невеликої кількості біологічного матеріалу, є необтяжливим для хворого, інформативним, дає об'єктивну оцінку отриманих результатів за рахунок обчислення показника антиоксидантної ємності у відносних одиницях, не має обмежень у практичному застосуванні, дозволяє підвищити точність діагностики - коефіцієнт варіабельності способу не перевищує ± 6,3 %. Джерела інформації: 3 UA 113602 U 5 1. Буланкина Н.И. Определение общей антиоксидантной активности плазмы кровы. /Η.И. Буланкина, С.Н. Охрименко, Г.В. Ганусова //Методы исследования липидов и углеводов: методические рекомендации для спецпрактикума по биохимии. - Харьков, 2005. - С. 35-36. 2. Король Л.В. Антиоксидантна система церулоплазмін-трансферин та стан коморбідності у хворих на хронічну хворобу нирок, які лікуються гемодіалізом /Л.В. Король, Л.Я. Мигаль, І.О. Дудар, Ю.І. Гончар //Укр. журн. нефрології та діалізу. - 2011. - № 4 (32). - С. 35-39 (прототип). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 25 Спосіб інтегральної оцінки антиоксидантної ємності сироватки крові, що включає визначення у сироватці крові вмісту церулоплазміну та трансферину, який відрізняється тим, що додатково визначають вміст сульфгідрильних груп та розраховують інтегральний показник, що характеризує стан антиоксидантної ємності сироватки крові шляхом визначення суми співвідношень вмісту церулоплазміну, трансферину та сульфгідрильних груп хворого до їх аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків, і, якщо величина антиоксидантної ємності сироватки крові, яку оцінюють за її здібністю пригнічувати продукцію перекисного окислення ліпідів, у середньому дорівнює 1,0 - це свідчить про відсутність порушень з боку універсальної системи антиоксидантного захисту та про збалансовану рівновагу між процесами пероксидації та антиоксидантною ємністю сироватки крові (антиоксидантною відповіддю організму), якщо цю величину реєструють вищою за 1,0 про підвищення процесів антиоксидантного захисту та компенсаторну реакцію організму у відповідь на підсилення процесів оксидації, а якщо нижчою за 1,0 - про зниження антиокислювального потенціалу організму, певне виснаження системи антиоксидантного захисту та про опосередковане порушення балансу оксидантних та антиоксидантних реакцій у бік надлишкового утворення ліпідних пероксидів та розвитку оксидативного стресу. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4