Спосіб інгібіції росту стовбурових ракових клітин

Реферат: Винахід належить до експериментальної медицини і може бути використаний для розробки нових методів дослідження цитостатичних властивостей протипухлинних препаратів, що містять метали, для діагностики та лікування онкозахворювань. Спосіб інгібіції росту стовбурових ракових клітин включає введення в організм гібридного комплексу, що містить 1,3 г/л сферичних наночастинок ортованадату гадолінію-ітрію, активованого європієм, та 0,55 г/л холестерину. Використання зазначеного гібридного комплексу забезпечує підвищення індексу інгібіції пухлини до 74,70±4,38 %. UA 115251 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до експериментальної медицини і може бути використаний для розробки нових методів дослідження цитостатичних властивостей протипухлинних препаратів, що містять метали, для діагностики та лікування онкозахворювань. Ідентифікація та інгібіція стовбурових ракових клітин (СРК), які є індукторами пухлинного процесу, є однією з надзадач сучасної онкології. Саме така концепція лежить в основі напрямку, який одержав назву "тераностика", який заснований на поєднанні діагностики і таргетного лікування хворих, заснованого на результатах цієї діагностики. На теперішній час актуальною проблемою є розробка способів, які б дозволили одночасно і виявляти СРК, і інгібувати їх ріст, що надасть можливість оперативно діагностувати і лікувати пухлину, а також скоротити витрати на діагностику та лікарські препарати. Відомі способи інгібіції росту ракових клітин із використанням препаратів похідних платини (Pt) (цисплатин, карбоплатин, оксаліплатин). Ці препарати здатні ушкоджувати ДНК, формуючи Pt-ДНК аддукти, які блокують реплікацію, транскрипцію і, як результат, клітинну проліферацію [1]. Однак при використанні цих препаратів виникає токсичний ефект (нефротоксичність, ототоксичність, нейротоксичність) і лікарська резистентність [2]. До того ж ці препарати не дозволяють ідентифікувати СРК. Відомий спосіб ідентифікації ракових клітин з використанням наночастинок (НЧ) дендримеру поліамідоміну, кон'югованого з моноклональними антитілами к карциноембріональному антигену [3]. Але цей нанокомплекс не дозволяє ідентифікувати СРК і не виявляє здатності гальмувати ріст пухлини. Відомий спосіб інгібіціїї росту ракових клітин з використанням веретеноподібних НЧ 3+ ортованадату гадолінію, активованого європієм (GdVO4:Eu ). Ці препарати здатні зв'язуватися з пухлинними клітинами і блокувати клітинну проліферацію [4], але у зв'язку з низькою проникаючою здатністю в СРК, веретеноподібні НЧ не можуть бути використані для ідентификації цих клітин. Найбільш близьким до заявленого за своєю суттю є спосіб ідентифікації і інгібіції СРК за 3+ допомогою сферичних НЧ ортованадату гадолінію-ітрію, активованого європієм (GdYVO4:Eu ) [5]. Цей спосіб забезпечує ефективну ідентифікацію СРК, однак є недостатньо ефективним щодо інгібіції росту СРК. При його використанні вміст СРК знижується лише в 2 рази, що відображується на індексі інгібіції росту пухлини, який становить лише 58,24±3,45 %. В основу винаходу поставлена задача удосконалити відомий спосіб ідентифікації та інгібіції росту СРК шляхом використання більш ефективного засобу, що дозволить підвищити ступінь інгібіції росту СРК при збереженні можливості їх ідентифікації. Поставлена задача вирішується тим, що в способі ідентифікації і інгібіції росту СРК, що передбачає використання сферичних НЧ ортованадату гадолінію-ітрію, активованого європієм (далі сферичні НЧ ортованадату), відповідно до винаходу, використовують гібридний комплекс цих НЧ з холестерином (далі гібридний нанокомплекс). Гібридний нанокомплекс синтезували згідно з методом, описаним в документі [6], а одержання сферичних НЧ ортованадату гадолінію-ітрію, активованого європієм, здійснювали методом, відомим з документа [7]. Гібридний нанокомплекс має високу проникаючу здатність завдяки наявності у ньому холестерину, який має високу спорідненість до мембран пухлинних клітин [8]. Це дозволяє здійснювати "адресну" доставку засобу саме до клітин пухлини без впливу на немалігнізовані клітини, одержати більш високий, ніж у прототипі, ефект інгібіції СРК, і, як результат, підвищити індекс інгібіції росту пухлини до 74,70±4,38 %. При цьому здатність сферичних НЧ ортованадату ідентифікувати СРК не знижується. Ефективність заявленого способу досліджували на 8-місячних самках мишей лінії BALB/c масою 16-18 г, яких утримували в умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини ΗАН України (м. Харків). Як первинні культури використовували стабілізовані після кріоконсервування клітини аденокарциноми Ерліха (АКЕ). Стабілізацію клітин проводили за морфо-функціональними показниками шляхом 3-кратної перевивки in vivo. Миші були розділені на 3 групи. Тваринам групи 1 внутрішньочеревно в перитоніальну 6 порожнину (ПП) в дозі 3×10 клітин/мишу вводили клітини АКЕ, які попередньо інкубували 3 години в ізотонічному розчині 5 %-ної глюкози без додавання сферичних НЧ ортованадату (контроль). Тваринам групи 2 внутрішньочеревно в ПП вводили клітини АКЕ, попередньо 6 інкубовані зі сферичними НЧ ортованадату, в дозі 3×10 клітин/мишу, об'ємом 0,3 мл (прототип). Інкубацію клітин АКЕ зі сферичними НЧ ортованадату (1,3 г/л) проводили в ізотонічному 5 %ному розчині глюкози протягом 3 годин при кімнатній температурі. В групі 3 тваринам внутрішньочеревно в ПП вводили клітини АКЕ, попередньо інкубовані в ізотонічному 5 %-ному 1 UA 115251 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розчині глюкози з гібридним нанокомплексом (сферичні НЧ ортованадату - 1,3 г/л, холестерин 6 0,55 г/л). Клітини вводили в дозі 3×10 клітин/мишу об'ємом 0,3 мл. + Із загальної популяції клітин АКЕ виділяли фракцію CD44 за допомогою магнітного сортера (BDTM [magnet) з використанням первинних немічених моноклональных антитіл до CD44 і вторинних Mouse Ig1 Magnetic Particles-DM ('BD Pharmingen', США) відповідно до протоколу виробника. Ідентифікацію інкубованих клітин проводили на люмінесцентному мікроскопі Olympus IХ 71 із джерелом збудження - ксеноновою лампою 75 W. Для збудження люмінесценції в мікроскопі був використаний фільтр, що пропускає випромінювання з довжиною хвилі 460-490 нм. Спостереження проводили при збільшенні X1000 в умовах масляної імерсії. Після 3-годинної інкубації клітин АКЕ із сферичними НЧ ортованадату відзначалася чітка локалізація НЧ в 6,00±0,81 % трансформованих клітин, в той час як при інкубації збагаченої СРК + фракції CD44 клітин, виділеної методом магнітного сортування, був виявлений високий відсоток клітин, що світилися (49,57±3,56 %). Додавання до сферичних НЧ ортованадату холестерину статистично не впливала на їх візуалізуючу здатність 5,6±0,73 % в загальній + популяції та 47,34±4,56 % в фракції CD44 . Оцінку показників у дослідних та контрольних тварин проводили після виведення тварин з експериментів на 7 добу після ініціації АКЕ. Індекс інгібіції росту АКЕ обчислювали за формулою [9]: V к   V о  100 % , де V к  V к  - абсолютна кількість клітин АКЕ в ПП контрольної групи, V о - абсолютна кількість клітин АКЕ в ПП дослідної групи Оцінку вмісту СРК в ПП здійснювали методом прямої мембранної імунофлуоресценції на проточному цитофлуориметрі (FACS Calibur (BD, США)) з використанням антимишачих ФІТЦмічених моноклональних антитіл (BD, США) до CD44, CD117. Облік даних, отриманих цитофлуориметричним аналізом, здійснювали за допомогою програми WinMDi 2.8. При атестації клітинного складу гетерогенного пулу АКЕ були оцінені такі субпопуляції hi + клітин: CD44 , які є найбільш імовірними претендентами на роль СРК, та CD117 акцесорнорегуляторні клітини пухлини. Результати фенотипічних і функціональних характеристик клітин АКЕ контрольних та дослідних груп наведені в Таблиці. З Таблиці видно, що при всіх видах обробки АКЕ відбувалися виражені зміни процесу формування in vivo (у ПП) як загального пулу клітин, так і hi + CD44 -, CD117 -субпопуляцій. Обробка клітин АКЕ гібридним нанокомплексом приводила до hi + зниження концентрації найбільш канцерогенних CD44 - і підвищення вмісту CD117 -клітин, що обумовлювало зменшення абсолютної кількості клітин АКЕ в ПП і, відповідно, інгібіцію росту пухлини у порівнянні з прототипом. Аналіз експресії генів nanog, oct-4, sox-2 у клітинах АКЕ проводили методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Характер експресії в клітинах пухлини генів плюрипотентності nanog, oct-4, sox-2, які характеризують виразність прогресії пухлинного росту до і після впливу гібридного нанокомплексу представлена на графіку. За "І" прийняті значення відносної експресії генів у клітинах АКЕ, нормовані по house-keeping гену (18s rRNA); * - результати мають статистично значимі розходження в порівнянні з контролем; $ - результати мають статистично значимі розходження між групами, яким вводили сферичні НЧ ортованадату, # - яким вводили гібридний комплекс, (р