Спосіб стимуляції проліферативної активності стовбурових ракових клітин старіючої популяції

1. Спосіб стимуляції проліферативної активності старіючої популяції пухлинних клітин, що включає культивування клітин в умовах in vivo, виділення суспензії клітин і наступний вплив стимулюючим фактором in vitro, який відрізняється тим, що після виділення суспензію клітин доводять до концентрації 1×107 клітин/мл, а як стимулюючий фактор використовують кріовплив. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кріовплив здійснюють за програмою, відповідно до якої клітини охолоджують зі швидкістю 1 °С/хв. до 80 °С з наступним прямим зануренням у рідкий азот. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кріовплив здійснюють за програмою, відповідно до якої клітини охолоджують зі швидкістю 3 °С/хв. до 28 °С, стабілізують протягом 20 хв. і далі охолоджують зі швидкістю 10 °С/хв. до -100 °С з наступним прямим зануренням у рідкий азот. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кріовплив здійснюють за програмою, відповідно до якої клітини охолоджують зі швидкістю 4 °С/хв. до 28 °С, потім стабілізують протягом 15 хв. з наступним прямим зануренням у рідкий азот. UA (21) a201007001 (22) 07.06.2010 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) ГОЛЬЦЕВ АНАТОЛІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, САФРАНЧУК ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА, ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ, ОСТАНКОВ МАКСИМ ВАДИМОВИЧ, БОНДАРОВИЧ МИКОЛА ОЛЕКСАНДРОВИЧ, СІРОУС МАРИНА АНАТОЛІЇВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Park S.Y. Cellular and genetic diversity in the progression of in situ human breast carcinomas to an invasive phenotype // J Clin. Invest. - 2010. - Vol. 1, № 120 (2). - P. 636-44. Винник Ю.С., Якимов С.В., Карапетян Г.Э., Сычев А.Г. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КРИОГЕННОЙ СТИМУЛЯЦИИ В ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКИХ РАН // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2008. - № 1. - С. 27-28 (реферат). Горохова Н.А. Кріоконсервування культивованих фібробластоподібних клітин шляхом повільного заморожування і вітрифікації: Автореферат дис… канд. біол. наук. - Харків - 2008. Скоробогатова Н.Г. Кріоконсервування фібробластоподібних клітин-попередників ембріональної печінки людини: Автореферат дис… канд. біол. наук. - Харків - 2007. Останков М.В. Теоретичне обгрунтовування та експериментальна перевірка ефективності швидкого двоступінчастого заморожування: Автореферат дис… канд. біол. наук. - Харків - 2001. Сакун О.В. Аналіз ефективності кріоконсервування клітинних суспензій з постійною та змінною швидкістю охолодження: Автореферат дис… канд. біол. наук. - Харків- 2009. C2 2 (19) 1 3 біології ракових клітин, а особливо стовбурових ракових клітин (СРК) як структур, що беруть участь в ініціації і підтримці росту пухлини і її метастазуванні. Відсутність цих знань є причиною пізнього діагностування і проведення лікування захворювання лише на етапах стаціонарної і термінальної стадій, хоча не виключається алогічна відповідь пухлинної тканини цього терміну розвитку на деякі терапівтичні заходи. З урахуванням цього, найбільш актуальним є вивчення особливостей поведінки трансформованих клітин, зокрема СРК, на пізніх стадіях пухлинного росту. З доступних джерел інформації нами виявлений лише спосіб стимуляції проліферативної активності СРК молодої популяції [1]. Відповідно до цього способу культуру клітин аденокарциноми Эрліха (АКЭ) культивують in vivo, потім суспензію клітин АКЭ виділяють і in vitro здійснюють стимуляцію проліферативної активності низькими концентраціями вільних радикалів. Вільнорадикальний вплив на клітини АКЭ індукують додаванням у середовище інкубації гідроперокиса третинного бутила і 2,2'азо-бис(2-амідинопропана). Стимуляцію проліферації визначають по включенню міченого радіонуклідами попередника синтезу нуклеїнових кислот [Н3]-тимідина в ДНК. Однак цей спосіб не може використовуватися для старіючої популяції пухлинних клітин. Це пояснюється тим, що клітини на різних стадіях розвитку мають розходження в протіканні біохімічних процесів [2], і з цієї причини клітини молодої і старіючої популяцій по різному реагують на ідентичні фактори стимуляції [1], тобто для різних стадій розвитку пухлинних клітин необхідні різні умови активації проліферативної активності. Задачею винаходу є створення способу, що забезпечує можливість стимуляції проліферативної активності СРК саме старіючої популяції пухлини. Ця задача вирішується тим, що в способі стимуляції проліферативної активності СРК, що включає культивування клітин в умовах in vivo, виділення суспензії клітин і наступний вплив стимулюючим фактором in vitro, відповідно до винаходу, після виділення суспензію клітин АКЕ доводять до концентрації 1x10 клітин/мл, а як стимулюючий фактор використовують кріовплив. Кріовплив здійснюють за однією з наступних програм: охолодження зі швидкістю 1°С /хв до -80°С з наступним прямим занурення у рідкий азот (програма І) [2]; охолодження зі швидкістю 3°С /хв до 28°С, стабілізація протягом 20 хв, далі зі швидкістю 10°С/ хв до -100°С с наступним прямим занурення у рідкий азот (програма II) [3]; охолодження зі швидкістю 4°С/ хв до -28°С, стабілізація протягом 15 хв і пряме занурення у рідкий азот (програма III) [3]. Програми кріовпливу були обрані з числа відомих програм кріоконсервування клітин, виходячи з того, що дані режими забезпечують найбільшу схоронність стовбурових елементів різних клітинних культур. Зазначені режими кріовпливу раніше не використовувалися з метою стимуляції проліферативної активності якого-небудь виду клітин. 94195 4 Використання вказаної концентрації клітин виключає необхідність після кріовпливу зменшувати чи збільшувати концентрацію (розведення чи центрифугування, відповідно), що дозволяє отримувати істинний ефект кріовпливу на клітини. Стимуляція низькими температурами дає можливість підвищувати проліферативну активність старіючої популяції СРК (CD44hі) [4] у 1,89-3,66 рази (у порівнянні з нативом). Крім того, стимульовані клітини можуть зберігатися тривалий час і використовуватися в міру необхідності. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Суспензію старіючої популяції клітин АКЭ уводили внутрішньочеревне в дозі 3х106 клітин /мишу в об'ємі 0,3 мл, культивували in vivo в перітоніальній порожнині (ПП) 7-місячних самок мишей лінії BALB/c, що утримуються в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м.Харків). Вихідну суспензію клітин, що знаходилися в асцитичної рідині, доводили до концентрації 1x107 клітин/мл фізіологічним розчином («Черкаси-ФАРМА»,Україна»). Мишей вводили в легкий ефірний наркоз і за допомогою шприца через голку № 10 виділяли з ПП. Концентрацію ядровмісних клітин у суспензії АКЭ підраховували в камері Горяєва [5]. Для оцінки абсолютної кількості клітин у ПП проводили облік об'єму накопиченої в ній асцитичної рідини. Далі за допомогою моноклональних антитіл (BD Pharmingen, USA) ідентифікували СРК із фенотипом CD44hі (кон'юговані з FITC), що являють собою популяцію недиференційованих СРК. Визначення концентрації досліджуваної субпопуляції клітин в АКЭ здійснювали на проточному цитофлуоріметрі FACS Calibur (Becton Dickinson, USA). [6] Для мінімізації помилок у пробах аналізували 10000 подій. Облік і аналіз даних здійснювали за допомогою програми WinMDI 2.9. Виділені клітини АКЭ в об'ємі 1,8 мл поміщали в пластикові ампули (Nunc; USA) і in vitro піддавали кріовпливу без застосування кріопротекторів в асцитичній рідині на заморожувачі УОП-06 виробництва СКТБ з ОП Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Умови кріовпливу: охолодження зі швидкістю 1°С /хв до - 80°С з наступним прямим зануренням у рідкий азот (програма І). Відігрівання зразків проводили на водяній бані, при температурі 40-41 °С протягом 45-50 сек, при постійному шутеліруванні ампул до зникнення твердої фази [3]. Для оцінки проліферативної активності клітин АКЭ зразки після кріовпливу культивували in vivo зазначеним вище способом. Для оцінки стимуляції проліферативної активності робили обчислення абсолютної кратності збільшення (у вигляді умовних коефіцієнтів) CD44hі клітин за весь термін росту в ПП (0-14 доби). Результати наведені в Табл.1, з якої видно, що проліферативна активність СРК старіючої популяції збільшилася в 3,66 разів. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком умов кріовпливу: охолодження зі швидкістю 3°С /хв до -28°С, стабілізація протягом 20 хв, далі зі швидкістю 10°С/хв до 100°С з наступним прямим зануренням у рідкий азот (програма II). Результати наведені в Табл.1, з 5 94195 6 якої видно, що проліферативна активність СРК старіючої популяції збільшилася в 2,24 рази. Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком умов кріовпливу: охолодження зі швидкістю 4°С/хв до -28°С, стабілізація протягом 15 хв і наступне пряме занурення у рідкий азот (програма III). Результати, наведені в Табл.1, показують, що проліферативна активність старіючої популяції СРК збільшилася в 1,89 разів. Приклади 1-3 демонструють те, що кріовплив виявляє стимулюючий ефект на СРК. Приклад 4. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що кріовпливу піддавали клітини молодої популяції АКЭ, що знаходяться на логарифмічній стадії росту. Результати наведені в Табл.2, з якої видно, що проліферативна активність СРК молодої популяції АКЭ, на відміну від старіючої, після кріовпливу піддавалася виразному інгібіюванню. Це свідчить про різноманіття клітинних реакцій на подібні по природі стимули і про різноспрямованість відповідей, аж до протилежних, на стимули одного походження. Джерела інформації: 1. Кондаков И.В. Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами // Сибирский онкологический журнал. — 2005. - Т. 13, №1.-С.58-61. 2. Федец О.И. Биоэнергетика и пролиферативная активность криоконсервированных клеток аденокарциноми Эрлиха: дис. канд.биол.наук.:Харьков, 1987-С. 14, 94. 3. Криоконсервирование клеточных суспензий / под.ред. Цуцаевой А.А. - К: Наук, думка, 1983. С. 121, 175, 240. 4. Park SY. Cellular and genetic diversity in the progression of in situ human breast carcinomas to an invasive phenotype // J Clin. Invest. - 2010. - Vol.1, №120 (2). -P. 636-44. 5. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / под ред. В.В.Меньшикова.- М.: Медицина, 1987. - С. 368. 6. Шторх В., Эммрах И. Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции // Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 254268. 7 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 94195 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601