Спосіб інгібіції проліферації стовбурових ракових клітин в старіючій популяції клітин аденокарциноми ерліха

Реферат: Спосіб інгібіції проліферації стовбурових ракових клітин в старіючій популяції клітин аденокарциноми Ерліха передбачає кріовплив на клітини зі швидкістю 1 °C/хв до -80 °C, від 80 °C до -196 С зі швидкістю 300-400 С/хв. Кріовплив проводять дворазово з інтервалом 5 хв. UA 103604 U (12) UA 103604 U UA 103604 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі експериментальної медицини і може бути використана для лікування онкологічних захворювань. Загальновідомо, що основною структурною одиницею, що бере участь в ініціації, підтримці росту і метастазуванні пухлин є стовбурові ракові клітини (СРК). Хіміо- і радіорезистентність цих клітин обумовила необхідність пошуку альтернативних чинників їх інактивації, серед яких одне з провідних місць займають кріохірургічні методи. Відомий спосіб інгібіції проліферації СРК з використанням іонізуючого опромінення [1]. Проте для досягнення ефективної протипухлинної дії використовується висока доза опромінення, яка викликає побічну дію на нормальні органи і тканини [2]. При цьому вплив на СРК слабкий, тому що вони мають низьку чутливість до дії даного типу впливу [3]. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб інгібіції проліферації СРК аденокарциноми Ерліха (АКЕ) шляхом кріовпливу [4]. Кріовплив здійснюють одноразово за допомогою заморожувача за наступною програмою: швидкість охолодження 1 С/хв до -80 С, від -80 С до -196 С - швидкість 300-400 С/хв. Недоліком способу є те, що одноразовий кріовплив інгібує проліферативну активність СРК тільки на ранніх стадіях розвитку пухлини, в той час як на більш пізніх стадіях розвитку кріовплив стимулює проліферацію СРК, так як виявляє "ревіталізуючий" ефект, що в свою чергу сприяє збільшенню вірогідності виникнення рецидивів. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити відомий спосіб інгібіції проліферації СРК в АКЕ шляхом зміни режиму кріовпливу, що забезпечить ефективне пошкодження СРК в старіючій популяції клітин АКЕ на пізніх стадіях розвитку пухлини, і зниження ризику виникнення рецидивів. Ця задача вирішується тим, що в відомому способі інгібіції проліферації СРК в АКЕ, який передбачає кріовплив на клітини зі швидкістю 1 °C/хв до -80 °C, від -80 С до -196 С зі швидкістю 300-400 С/хв., відповідно до корисної моделі, кріовплив проводять дворазово з інтервалом 5 хв. Використання дворазового кріовпливу забезпечує більш ефективний ступінь пошкодження СРК, ніж у найближчого аналога, ступінь пошкодження СРК в старіючій популяції клітин АКЕ на пізніх стадіях розвитку пухлин і зменшити вірогідність виникнення рецидивів. Спосіб здійснюють таким чином. Клітини АКЕ, що знаходяться в асцитичній рідині, в об'ємі 1,8 мл поміщають в пластикові ампули і піддають на заморожувачі дворазовому кріовпливу з інтервалом 5 хв. Умови кріовпливу: охолодження зі швидкістю 1 °C/хв до -80 °C, від -80 С до -196 С зі швидкістю 300400 С/хв. Відігрівання зразків проводять на водяній бані, при температурі 40-41 °C протягом 4550 сек., при постійному шутелюванні ампул до зникнення твердої фази. Приклад 6 Суспензію старіючої популяції клітин АКЕ вводили внутрішньочеревно в дозі 3×10 клітин/мишу в об'ємі 0,3 мл, культивували in vivo в перитонеальній порожнині (ПП) 7-місячних самок мишей лінії BALB/c, що утримуються в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків). Вихідну суспензію клітин, що знаходилися в 7 асцитичній рідині, доводили до концентрації 1×10 клітин/мл фізіологічним розчином ("ЧеркасиФАРМА", Україна"). Мишей вводили в легкий ефірний наркоз і за допомогою шприца через голку № 10 виділяли з ПП. Концентрацію ядровмісних клітин в 1 мл суспензії АКЕ підраховували в камері Горяєва [5]. Для оцінки абсолютної кількості клітин у ПП проводили облік об'єму накопиченої в ній асцитичної рідини. Далі за допомогою моноклональних антитіл (BD hi Pharmingen, USA) ідентифікували СРК із фенотипом CD44 (кон'юговані з FITC), що являють собою популяцію недиференційованих СРК. Визначення концентрації СРК в старіючій популяції клітин AКЕ здійснювали на проточному цитофлуоріметрі FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) [6]. Для мінімізації помилок у пробах аналізували 10000 подій. Облік і аналіз даних здійснювали за допомогою програми WinMDI 2.9. Виділені клітини АКЕ в об'ємі 1,8 мл поміщали в пластикові ампули (Nunc; USA) і піддавали дворазовому кріовпливу в асцитичній рідині на заморожувані УОП-06 виробництва СКТБ з ОП Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Було проведено два цикли кріовпливу з інтервалом в 5 хв. Умови кріовпливу були однаковими для кожного з циклів: охолодження зі швидкістю 1 °C /хв до -80 °C, від -80 С до -196 С зі швидкістю 300-400 С/хв. Відігрівання зразків проводили на водяній бані, при температурі 4041 °C протягом 45-50 сек., при постійному шутелюванні ампул до зникнення твердої фази. Для оцінки проліферативної активності СРК старіючої популяції клітин АКЕ зразки після кріовпливу культивували in vivo зазначеним вище способом. Для оцінки проліферативної активності СРК робили обчислення абсолютної кратності збільшення (у вигляді умовних 1 UA 103604 U hi коефіцієнтів) CD44 клітин за весь термін росту в ПП (0-14 доби). Індекс інгібіції росту клітин АКE обчислювали за формулою: V(к )  V(о)  100 % , де V(к ) V(к ) - абсолютна кількість клітин АКЕ в ПП контрольної групи, 5 10 V(о) - абсолютна кількість клітин АКК в ПП дослідної групи Результати наведені в Табл. 1, з якої видно, що після дворазового кріовпливу проліферативна активність СРК старіючої популяції АКЕ знижувалася в 2,08 разу, у той час як одноразовий кріовплив призводив до її збільшення в 3,66 разу. Важливо, що саме така феноменологія зміни зазначеного показника призводила до значної інгібіції росту старіючої популяції АКЕ (Табл. 2). Після одноразового кріовпливу спостерігали стимуляцію росту пухлини. Таблиця 1 Дія кріовпливу на проліферативну активність СРК старіючої популяції АКЕ Кріовплив Одноразовий Дворазовий Абсолютна кратність зміни кількості hi СРК (СD44 ) с 0 до 14 доби Натив Кріо 43,7±3,05 160±11,2 43,7±3,05 21±1,7* Спрямованість кріовпливу Інгібування 2,08±0,17* Стимуляція 3,66±0,25 Таблиця 2 Дія кріовпливу на проліферативну активність загальної старіючої популяції клітин АКЕ Кріовплив Одноразовий Дворазовий 15 20 25 30 35 Загальна кількість клітин АКЕ Натив Кріо 8 8 5,3±0,37×10 8,74±0,61×10 8 8 5,3±0,37×10 1,3110 Спрямованість кріовпливу Інгібування Стимуляція 1,65±0,12 4,05±0,37 Джерела інофрмації: 1. Важенин А.В. Радиационная онкология: организация, тактика, пути реализации. Челябинск., 2001. - С. 39-60 2. Bodnarchnk I.A. Modeling of the Survival of Mammalian Cells Exposed to Ionizing Radiation with Different Linear Energy Transfer // Biophysic. - 2003. - Vol. 48, No. 3. - P. 447-452. 3. Baumann M, Krause M, Thames H, Trott K, Zips D. Cancer stem cells and radiotherapy // Int. J. Radiat. Biol. - 2009. Vol. 85, № 5. P. 391-402 4. Гольцев A.M., Сафранчук О.В., Бондарович М.О., Челомбітько О.В., Останков M.B. Зміна кріолабільності стовбурових ракових клітин у процесі культивування аденокарциноми Ерліха in vivo // Фізіологічний журнал. - 2011. - № 4. - С. 68-76. 5. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С. 368. 6. Шторх В., Эммрах И. Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции // Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 254-268. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб інгібіції проліферації стовбурових ракових клітин в старіючій популяції клітин аденокарциноми Ерліха, який передбачає кріовплив на клітини зі швидкістю 1 °C/хв до -80 °C, від -80 °C до -196 С зі швидкістю 300-400 С/хв, який відрізняється тим, що кріовплив проводять дворазово з інтервалом 5 хв. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2