Спосіб інгібіції проліферативної активності стовбурових ракових клітин старіючої популяції клітин аденокарциноми ерліха

Реферат: Спосіб інгібіції проліферативної активності стовбурових ракових клітин старіючої популяції клітин аденокарциноми Ерліха шляхом проведення циклів заморожування-відігріву, кожен з яких передбачає кріовплив на клітини зі швидкістю охолодження 1°С/хв. до -80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C хв. При цьому проводять чотири цикли заморожуваннявідігріву з інтервалом 5 хв. UA 110152 U (12) UA 110152 U UA 110152 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі експериментальної медицини і може бути використана для лікування онкологічних захворювань. Загальновідомо, що основною структурною одиницею, що бере участь в ініціації, підтримці росту і метастазуванні пухлин, є стовбурові ракові клітини (СРК). Хіміо- і радіорезистентність цих клітин обумовлює необхідність пошуку альтернативних чинників їх інактивації, серед яких одне з провідних місць займають кріохірургічні методи. Відомий спосіб інгібіції проліферативної активності СРК з використанням іонізуючого опромінення [1]. Проте для досягнення ефективної протипухлинної дії використовується висока доза опромінення, яка викликає побічну дію на нормальні органи і тканини [2]. При цьому вплив на СРК слабкий, тому що вони мають низьку чутливість до дії даного типу впливу [3]. Існує спосіб інгібіції проліферативної активності СРК аденокарциноми Ерліха (АКЕ) шляхом кріовпливу [4]. Кріовплив здійснюють одноразово зі швидкістю охолодження 1 °C/хв. до - 80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв. Недоліком способу є те, що одноразовий кріовплив інгібує проліферативну активність СРК тільки на ранніх стадіях розвитку пухлини, в той час як на більш пізніх стадіях розвитку кріовплив стимулює проліферацію СРК, так як виявляє "ревіталізуючий" ефект, що в свою чергу сприяє збільшенню вірогідності виникнення рецидивів. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб інгібіції проліферативної активності СРК аденокарциноми Ерліха (АКЕ), який передбачає: проведення двох циклів заморожування-відігріву з інтервалом 5 хв. Кріовплив здійснюють за такою програмою: швидкість охолодження 1 °C/хв. до - 80 °C, від -80 °C до -196 °C - швидкість 300-400 °C/хв. Відігрів проводять на водяній бані, при температурі 40-41 °C протягом 45-50 с, при постійному шутелюванні ампул до зникнення твердої фази [5]. Недоліком способу є те, що після дворазового кріовпливу, хоч і значно знижується проліферативна активність СРК в АКЕ пізніх строків розвитку, але їх проліферативний потенціал зберігається, що не виключає можливості виникнення рецидивів надалі. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити відомий спосіб інгібіції проліферативної активності СРК в АКЕ таким чином, щоб досягти максимального ступеня пошкодження СРК в АКЕ і виключити можливість виникнення рецидивів. Ця задача вирішується тим, що в відомому способі інгібіції проліферативної активності СРК в АКЕ шляхом проведення циклів заморожування-відігріву, кожен з яких передбачає кріовплив зі швидкістю охолодження 1 °C/хв. до - 80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв., відповідно до корисної моделі, здійснюють чотири цикли заморожування-відігріву з інтервалом 5 хв. Чотириразовий кріовплив забезпечує максимальний ступінь пошкодження СРК в старіючій популяції клітин АКЕ на пізніх стадіях розвитку пухлин, що виключає можливість виникнення рецидивів. Спосіб здійснюють таким чином. Клітини АКЕ, що знаходяться в асцитичній рідині, в об'ємі 1,8 мл, поміщають в пластикові ампули і піддають на заморожувачі чотирьом циклам заморожування-відігріву з інтервалом 5 хв. Кріовплив здійснюють зі швидкістю охолодження 1 °C /хв. до - 80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв. Відігрівання зразків проводять на водяній бані, при температурі 4041 °C протягом 45-50 с, при постійному шутелюванні ампул до зникнення твердої фази. Приклад. 6 Суспензію старіючої популяції клітин АКЕ вводили внутрішньочеревно в дозі 3×10 клітин/мишу в об'ємі 0,3 мл, культивували in vivo в перитонеальній порожнині (ПП) 7-місячних самок мишей лінії BALB/c, що утримуються в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків). Вихідну суспензію клітин, що знаходилися в 7 асцитичній рідині, доводили до концентрації 1×10 клітин/мл фізіологічним розчином ("ЧеркасиΦΑΡΜΑ", Україна). Мишей вводили в легкий ефірний наркоз і за допомогою шприца через голку № 10 виділяли з ПП. Концентрацію ядровмісних клітин в 1 мл суспензії ΑΚΗ підраховували в камері Горяєва [6]. Для оцінки абсолютної кількості клітин у ПП проводили облік об'єму накопиченої в ній асцитичної рідини. Далі за допомогою моноклональних антитіл (BD hi Pharmingen, USA) ідентифікували СРК із фенотипом СD44 (кон'юговані з FITC), що являють собою популяцію недифериційованих СРК. Визначення концентрації СРК в старіючій популяції клітин АКЕ здійснювали на проточному цитофлуориметрі FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) [7]. Облік і аналіз даних здійснювали за допомогою програми WinMDI 2.9. Виділені клітини АКЕ в об'ємі 1,8 мл поміщали в пластикові ампули (Nunс; USA) і піддавали чотириразовому кріовпливу в асцитичній рідині на заморожувачі УОП-06 виробництва СКТБ з ОП Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Було проведено чотири цикли заморожування-відігріву 1 UA 110152 U 5 10 з інтервалом 5 хв. Умови кріовпливу були однаковими для кожного з циклів: заморожування проводили зі швидкістю 1 °C /хв. до - 80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C/хв. Відігрівання зразків проводили на водяній бані, при температурі 40-41 °C протягом 45-50 с, при постійному шутелюванні ампул до зникнення твердої фази. Для оцінки проліферативної активності СРК, клітини АКЕ культивували in vivo і обчислювали hi абсолютну кратність збільшення (у вигляді умовних коефіцієнтів) СD44 клітин за весь термін росту в ПП (0-14 доби). Результати наведені в табл. 1, з якої видно, що одноразовий кріовплив призводив до збільшення проліферативної активності СРК старіючої популяції АКЕ в 3,66 разів, у той час як дворазовий та триразовий кріовпливи знижували її в 2,08 та 4,18 разів, відповідно. Однак тільки після чотириразового кріовпливу спостерігали відсутність СРК на 14 добу культивування клітин АКЕ. Як наслідок після чотириразового кріовпливу на 14 добу культивування клітин АКЕ були відсутні клітини загальної популяції (табл. 2). Після одноразового кріовпливу спостерігали стимуляцію росту пухлини, а після дворазового та триразового - тільки інгібіцію. 15 Таблиця 1 Дія кріовпливу на проліферативну активність СРК старіючої популяції АКЕ. Кріовплив Одноразовий Дворазовий Триразовий Чотириразовий Абсолютна кратність зміни кількості hi СРК (СD44 ) с 0 до 14 доби Натив Кріо 43,7±3,05 160±11,2 43,7±3,05 21±1,7* 43,7±3,05 10,45±1,2* 43,7±3,05 Спрямованість кріовпливу Інгібування 2,08±0,17* 4,18±0,33* Стимуляція 3,66±0,25 * - розходження статистично значимі в порівнянні з нативом Таблиця 2 Дія кріовпливу на проліферативну активність загальної старіючої популяції клітин АКЕ. Кріовплив Одноразовий Дворазовий Триразовий Чотириразовий Загальна кількість клітин АКЕ Натив Кріо 8 8 5,3±0,37×10 8,74±0,61×10 * 8 8 5,3±0,37×10 1,31±0,13×10 * 8 8 5,3±0,37×10 0,46±0,03×10 * 8 5,3±0,37×10 Спрямованість кріовпливу Інгібування Стимуляція 1,65±0,12 4,05±0,37 11,52±0,8 * - розходження статистично значимі в порівнянні з нативом 20 25 30 35 Джерела інофрмації: 1. Важений А.В. Радиационная онкология: организация, тактика, пути реализации. Челябинск. - 2001. - С. 39-60. 2. Bodnarchuk I.A. Modeling of the Survival of Mammalian Cells Exposed to Ionizing Radiation with Different Linear Energy Transfer // Biophysic. - 2003. - Vol. 48, № 3. - P. 447-452. 3. Baumann M., Krause M., Thames M., Trott K., Zips D. Cancer stem cells and radiotherapy //Int. J. Radiat. Biol. - 2009. - Vol. 85, № 5. - P. 391-402. 4. Гольце A.M., Сафранчук О.В., Бондарович Μ.О., Челомбітько О.В., Останков М.В. Зміна кріолабільності стовбурових ракових клітин у процесі культивування аденокарциноми Ерліха in vivo // Фізіологічний журнал. - 2011. - № 4. - С. 68-76. 5. Пат. України № 103604, МПК C12N5/09, C12N5/095, опубл. 25.12.2015, бюл. № 24, Спосіб інгібіції проліферації стовбурових ракових клітин старіючої популяції клітин аденокарциноми Ерліха. 6. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник /под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина. - 1987. - С. 368. 7. Шторх В., Эммрах И. Определение клеточных маркеров методом мембранной иммунофлюоресценции // Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М: Медицина. 1987. - С. 254-268. 2 UA 110152 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб інгібіції проліферативної активності стовбурових ракових клітин старіючої популяції клітин аденокарциноми Ерліха шляхом проведення циклів заморожування-відігріву, кожен з яких передбачає кріовплив на клітини зі швидкістю охолодження 1°С/хв. до -80 °C, від -80 °C до -196 °C зі швидкістю 300-400 °C хв., який відрізняється тим, що проводять чотири цикли заморожування-відігріву з інтервалом 5 хв. 10 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3