Спосіб одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби

Реферат: Корисна модель належить до ветеринарної медицини, зокрема біотехнології, а саме до способів одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби і може бути використана для проведення цитологічних досліджень. Мета корисної моделі: розробити новий, більш ефективний спосіб одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби для проведення цитологічних досліджень. Технічний результат досягається тим, що інкубацію ділянки порожньої кишки плодів великої рогатої худоби проводять у середовище "Б" такого складу (мМ): NaCl 140; дигідрофосфат натрію - 16; ЕДТО - 1,5; дитіотреїтол - 0,5, за постійного струшування при 37 °C (співвідношення середовища до маси кишечнику - 2 мл/г), рН якої становить 7,0. Заявлений спосіб забезпечує максимальний вихід ізольованих ентероцитів із високою збереженістю їх життєздатності. UA 118136 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ЕНТЕРОЦИТІВ ПЛОДІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ UA 118136 U UA 118136 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, зокрема біотехнології, а саме до способів одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби і може бути використана для проведення цитологічних досліджень. Дослідження ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби має велике значення для з'ясування низки питань функціонування системи травлення телят у ранньому постнатальному періоді та інших систем організму. Зокрема, на даний час теоретично обґрунтовано та експериментально доведено, що становлення колострального імунітету у великої рогатої худоби в новонароджених обумовлено структурно-функціональними особливостями апікальних мембран епітеліоцитів тонкого кишечнику і, насамперед, наявністю специфічних білків, що мають властивості рецепції до імуноглобулінів молозива (Мельничук Д.О., Усатюк П.В., Цвіліховський М.І. Роль білкових структур плазматичної мембрани кишкового епітелію у формуванні колострального імунітету новонароджених телят// Вісник Національного аграрного університету. - Київ, 1998. - № 6. - С. 13-20; Цвіліховський М.І. Білки плазматичних мембрани епітелію тонкого кишечнику великої рогатої худоби: Автореф. Дис… докт. біол. наук: 03.00.04/ НАУ -К.: 1998. - 38 с). Дане положення дозволяє висунути гіпотезу про те, що причиною неадекватної реакції новонароджених телят на імуноглобуліни молозива з наступним розвитком молозивного токсикозу є порушення формування відповідних компонентів епітеліального шару шлунково-кишкового тракту в плодовому періоді пренатального онтогенезу. Для підтвердження вищевказаної гіпотези, наприклад, потрібно провести всебічні дослідження закономірностей морфогенезу мембран епітеліоцитів кишечнику у великої рогатої худоби саме на ізольованому клітинному матеріалі і, особливо, в останні місяці внутрішньоутробного розвитку. Відомі способи (Патент US 20050118143 А1, US 9273283 В2, WO 2003010304 A3, WO 2005118780 A1, RU 2104524, авторське свідоцтво SU 1310426 A1, України № 952958) передбачають отримання ізольованих клітин із різних органів. Недоліками способів є те, що вони не підходять для одержання ізольованих клітин кишечнику. Близьким по суті до способу, що запропоновано, є спосіб одержання абсорбційних ентероцитів порожньої кишки птиці хімічним методом (Патент України № 97038 С2). Недоліком даного способу є те, що він спеціально розроблений для отримання ентероцитів птиці, і тільки клітин певного типу слизової оболонки із збереженням їх транспортних властивостей. Найближчим аналогом до способу, що запропоновано є виділення загальної фракції кишкових епітеліоцитів хімічним (цитрат/етилендіамінтетраоцтова кислота) методом (Томчук В.А., Усатюк П.В., Цвіліховський М.Л., Мельничук Д.О. Отримання ізольованих клітин епітелію тонкого кишечнику великої рогатої худоби// Фізіологічний журнал. - 1994. - Т. 40. - № 5/6. - С. 4551), який включає використання середньої третини порожньої кишки для отримання ізольованих ентероцитів, яку попередньо, після забою, відділяють від інших відділів кишечнику, промивають фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, рН 7,4) для звільнення від вмісту та відокремлюють від брижі; промиту та вивернуту ділянку кишки інкубують почергово 10 та 15 хв. відповідно, у двох середовищах (А і Б) такого складу: А (мМ) - NaCl-96, КСl-1,5; натрію цитрату - 27; дигідрофосфату калію - 5,6, при 37 °C та рН 7,3 (співвідношення середовище/кишечник - 2 мл/г); Б (мМ) - NaCl-140; дигідрофосфат натрію - 16; ЕДТО - 1,5; дитіотреїтол - 0,5, за постійного струшування при 37 °C, рН 7,3 (співвідношення середовища до маси кишечнику - 2 мл/г). Після завершення інкубації, клітини осаджують центрифугуванням протягом 3 хв. при 500 g (25003000 об/хв.) з дворазовою промивкою фізіологічним розчином. Кінцевий осад розбавляють середовищем "Б". Заявлений спосіб і найближчий аналог мають спільні ознаки, а саме: спосіб включає видалення тонкої кишки, промивання її фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, рН 7,4) для звільнення від вмісту, відокремлення порожньої кишки від брижі, визначення середньої третини та видалення її для отримання ентероцитів, інкубування промитої та вивернутої ділянки кишки протягом 10 хв. у середовищі А (мМ): NaCl-96; КСl-1,5; натрію цитрату - 27; дигідрофосфату калію - 5,6, при 37 °C та рН 7,3 (співвідношення середовище/кишечник - 2 мл/г), та наступне перенесення на 15 хв. у розчин Б (мМ): NaCl-140; дигідрофосфат натрію - 16; ЕДТО - 1,5; дитіотреїтол - 0,5, за постійного струшування при 37 °C (співвідношення середовища до маси кишечнику - 2 мл/г), осадження, після завершення інкубації, із середовища ізольованих клітин центрифугуванням протягом 3 хв. при 500 g із дворазовим промиванням фізіологічним розчином та розбавлення кінцевого осаду середовищем "Б". До недоліків найближчого аналога можна віднести те, що він не враховує відмінності біології ентероцитів плодів великої рогатої худоби. 1 UA 118136 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Запропонований спосіб усуває недоліки найближчого аналогу і забезпечує максимальний вихід ізольованих ентероцитів із високою збереженістю їх життєздатності. В основу корисної моделі поставлена задача розробити новий, більш ефективний спосіб одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби для проведення цитологічних досліджень. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби включає видалення тонкої кишки, промивання її фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, рН 7,4) для звільнення від вмісту, відокремлення порожньої кишки від брижі, визначення середньої третини та видалення її для отримання ентероцитів, інкубування промитої та вивернутої ділянки кишки протягом 10 хв. у середовищі "А" (мМ): NaCl-96; ΚС1-1,5; натрію цитрату - 27; дигідрофосфату калію - 5,6, при 37 °C та рН 7,3 (співвідношення середовище/кишечник - 2 мл/г), та наступне перенесення на 15 хв. у розчин "Б" (мМ): NaCl-140; дигідрофосфат натрію - 16; ЕДТО - 1,5; дитіотреїтол - 0,5, за постійного струшування при 37 °C (співвідношення середовища до маси кишечнику - 2 мл/г), осадження, після завершення інкубації, із середовища ізольованих клітин центрифугуванням протягом 3 хв. при 500 g із дворазовим промиванням фізіологічним розчином та розбавлення кінцевого осаду середовищем "Б", згідно з корисною моделлю, використовують середовище "Б", рН якого становить 7,0. Запропонований спосіб виконують наступним чином: - негайно після забою у плодів (2-9 місячного віку) розтинають черевну порожнину, видаляють порожню кишку, відділивши брижу, визначають довжину та середину кишки, видаляють вміст, після чого відбирають частину (30 % від загальної довжини з середньої ділянки органа), яку використовують для одержання клітин, вивертають слизовою оболонкою назовні або розрізають уздовж та поділяють на невеликі сегменти по 1,5-3 см і ретельно промивають (4-5 разів) холодним (4-6 °C) фізіологічним розчином ((NaCl 120 мМ та HEPES 1 мМ, рН 7,4); - промиту та вивернуту ділянку кишечнику поміщають в підготовче середовище "А"(мМ: 96 NaCl; 27 цитрату натрію; 5,6 ΚН2РО4; 1,5 ΚСl) при 37 °C, рН 7,3 (співвідношення середовища до кишечнику відповідно 2 мл/г) на 10 хвилин; після цього його разом із вмістом кишечнику, слизом та зруйнованими клітинами зливають, а кишечник поміщають в розчин "Б" (мМ: 140 NaCl; 16 Na2HPO412 H2O; 1,5 ЕДТО; 0,5 дітіотреітолу) на 15 хв. при постійному струшуванні на водяній бані при 37 °C, рН 7,0; - після завершення інкубації, клітини осаджують центрифугуванням протягом 3 хв. при 500 g (2500-3000 об/хв.) з дворазовою промивкою фізіологічним розчином та кінцевий осад розбавляють середовищем "Б"; - отримані клітини розфасовують в поліпропіленові флакони, позначають і зберігають в рідкому азоті протягом 2-6 місяців для подальшого використання. Ефективність запропонованого способу та його переваги у порівнянні з найближчим аналогом підтверджені прикладом конкретного використання. Технічний результат вирішується тим, що інкубацію ділянки порожньої кишки плодів великої рогатої худоби проводять у середовище "Б", рН якої становить 7,0. Відомо, що у вагітних продуктивних тварин виникає стан компенсованого метаболічного ацидозу, який тісно пов'язаний з гемічною гіпоксією, посиленням інтенсивності процесів гліколізу і гальмуванням аеробних процесів, особливо в тканинах високопродуктивних глибокотільних корів (Масюк Д.М. Фізіологічний стан організму глибокотільних корів і народившихся від них телят під впливом препаратів гумусувої природи: Автореф. Дис… канд. вет. наук: 03.00.13/ ЛДАВМ -Л.: 1999. - 19 с). Зміна показників кислотно-основного стану крові, енергетичного обміну та окисно-відновних процесів в тканинах тварин значною мірою залежить від внутрішньоутробного розвитку плоду, що пов'язують з рядом особливостей функціонування його органів, а також з характером обміну речовин в тканинах плода (Тупицька О.М. Особливості вуглеводно-азотового обміну та вміст електролитів у тканинах вагітних тварин і плодів в умовах експериментального амонійного токсикозу та метаболічного ацидозу: Автореф. Дис… канд. біол. наук: 03.00.04/ НАУ -К.: 1998. - 19 с; Фоменко И.С., Калачнюк Г.И. Реакции внутриклеточного трансаминирования в слизистой желудочно-кишечного тракта 6-месячного плода коровы // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2001. - № 3. - С. 45-47). Період пренатального онтогенезу характеризується закладкою органів і їх функціональним становленням, швидким збільшенням маси тіла і окремих органів, формуванням систем, які забезпечують підтримку стабільного гомеостазу клітин і позаклітинної рідини. У зв'язку з вищезазначеним для відповідності концентрації іонів водню у середовищі виділення ентероцитів фізіологічним умовам росту і розвитку плодів було доцільним знизити рН 2 UA 118136 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовища виділення до певного рівня. Для цього було апробовано середовища з різною кислотністю і проведенням оцінки виходу та життєздатності виділених ентероцитів. У результаті проведених експериментальних досліджень нами було встановлено, що максимальний вихід ентероцитів був при рН 7,0, при цьому 97 % клітин зберігали життєздатність. Отже, оптимальним рН середовища для отримання ізольованих ентероцитів кишечнику плодів великої рогатої худоби є показник 7,0, що пов'язано з особливостями обміну речовин у вагітних високопродуктивних корів і відповідним станом функціональної системи матиплацента-плід. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником знайдено технічне рішення (Томчук В.А., Усатюк П.В., Цвіліховський М.І., Мельничук Д.О. Отримання ізольованих клітин епітелію тонкого кишечника великої рогатої худоби// Фізіологічний журнал. - 1994. - Т. 40. - № 5/6. - С. 45-51), що містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим і включає видалення тонкої кишки, промивання її фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, рН 7,4) для звільнення від вмісту, відокремлення порожньої кишки від брижі, визначення середньої третини та видалення її для отримання ентероцитів, інкубування промитої та вивернутої ділянки кишки протягом 10 хв. у середовищі А (мМ): NaCl-96; КСl-1,5; натрію цитрату - 27; дигідрофосфату калію - 5,6, при 37 °C та рН 7,3 (співвідношення середовище/кишечник - 2 мл/г), та наступне перенесення на 15 хв. у розчин Б (мМ): NaCl-140; дигідрофосфат натрію - 16; ЕДТО - 1,5; дитіотреїтол - 0,5, за постійного струшування при 37 °C (співвідношення середовища до маси кишечнику - 2 мл/г), осадження, після завершення інкубації, із середовища ізольованих клітин центрифугуванням протягом 3 хв. при 500 g із дворазовим промиванням фізіологічним розчином та розбавлення кінцевого осаду середовищем "Б". Однак, наявність зазначених, спільних ознак з найближчим аналогом недостатня для отримання технічного результату, який забезпечує запропонований спосіб. Дослідження ефективності одержання ізольованих ентероцитів плодів великої рогатої худоби запропонованим способом проведені на базі проблемної лабораторії фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин Дніпропетровського державного аграрного університету. Об'єктом досліджень були 40 плодів, віком 2-9 місяців, з середньою масою 0,6-39 кг, отриманих від клінічно здорових корів голштинської породи, забитих на Дніпропетровському м'ясокомбінаті "Ювілейний". Вік плодів визначали вимірюванням довжини тулуба від голови до хвоста, та по ступеню розвитку волосяного покрову за А.П. Студенцовим (Беременность / Студенцов А.П., Шипилов B.C., Преображенский О.Н. и др.// Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения: Под ред. Никитина В.Я., Миролюбова М.Г. -М.: "Колос", 2000. - С. 139-192). Негайно після забою у плодів розтинали черевну порожнину, виділяли порожню кишку, відділивши брижу, визначали довжину та середину кишки, видаляли вміст, після чого відбирали частину (30 % від загальної довжини з середньої ділянки органа), яку використовували для одержання клітин. За основу отримання ізольованих епітеліоцитів тонкого відділу кишечнику великої рогатої худоби брали хімічний (цитрат/ЕДТО) метод (найближчий аналог). Якість отриманих епітеліальних клітин оцінювали за морфологічними і функціональними показниками. Для цього застосовували методи: 1) гістологічні (заливка у парафін, фарбування гематоксиліном і еозином) для контролю процесів виділення клітин із слизової оболонки тонкого кишечнику, виявлення наявності агрегатів ентероцитів, характеристики їх структури; 2) фарбування 0,1 % розчином трипанового синього для визначення за допомогою світлової мікроскопії життєздатності ентероцитів (барвник проникав тільки в клітини, що загинули); 3) визначення активності цитозольного ферменту лактатдегідрогенази в інкубаційному середовищі, як критерію цілісністі плазматичної мембрани отриманих ізольованих ентероцитів тонкого кишечника; 4) вимірювання кількості загального білку на одиницю маси нативного кишечнику для характеристики повноти виділення ентероцитів. Отримані клітини розфасовували в поліпропіленові флакони, позначали і зберігали в рідкому азоті на протязі 2-6 місяців для подальшого використання. В дослідах використовували ділянку кишки у ранній плідний період середньою довжиною 0,8 м; у пізній плідний період 1,7 м, яку, вивертали слизовою оболонкою назовні або розрізали уздовж та ділили на невеликі сегменти по 1,5-3 см і ретельно промивали (4-5 разів) холодним ο (4-6 С) середовищем такого складу: 120 мМ NaCl та 1 мМ HEPES, за допомогою сухого трісу доводили рН до 7,4. Метод розрізання кишки у плодів 2-4 місячного віку використовували замість вивертання у зв'язку з її малим діаметром. Базова схема (найближчий аналог) для отримання ізольованих ентероцитів епітелію тонкого кишечнику включає наступні етапи: промиту та вивернуту ділянку кишечнику поміщають в 3 UA 118136 U 5 10 15 20 25 підготовче середовище "А"(мМ: 96 NaCl; 27 цитрату натрію; 5,6 КН2РО4; 1,5 КСl) при 37 °C, рН 7,3 (співвідношення середовища до кишечника відповідно 2 мл - 1см) на 10 хвилин; після цього його разом із вмістом кишечника, слизом та зруйнованими клітинами зливають, а кишечник поміщають в розчин "Б" (мМ: 140 NaCl; 16 Na2HPO412 H2O; 1,5 ЕДТО; 0,5 дитіотреїтолу) на 15 хв. при постійному струшуванні на водяній бані при 37 °C, рН 7,3. Після завершення інкубації клітини осаджують центрифугуванням протягом 3 хв. при 500 g (2500-3000 об/хв.) з дворазовою промивкою фізіологічним розчином. Кінцевий осад розбавляють середовищем "Б". У досліді було апробовано середовища з різною кислотністю із проведенням оцінки виходу та життєздатності виділених ентероцитів. При цьому використовували середовище "Б" з рН рівному 6,8, яке є нижчим лімітом збереження фізіологічних властивостей даних клітин; рН 7,0 (заявлений спосіб); рН 7,3 в якості вихідного значення для базової методики (найближчий аналог). В результаті проведених досліджень встановлено, що максимальний вихід ентероцитів був при рН 7,0 (запропонований спосіб) і склав 133,64 мг білку на 1 г нативного кишечнику. При збереженні кислотності розчину "Б" базової методики (найближчий аналог) вихід склав 95,6 мг на 1 г кишечнику, що є на 40 % нижчим за рівень модифікованої методики, а при рН 6,8 вихід білку був 95,1 мг/г кишечнику. При порівняні збереженості клітин мінімально життєздатними вони були при рН 6,8 (91 %), а максимальним (97 %) - при рН 7,0 (заявлений спосіб), що відрізняється від вихідної методики прототипу (вихід склав 95 %), що тісно корелює (r=0,93; р