Спосіб діагностики дисбіозу при хронічному катаральному гінгівіті у дітей та підлітків

Реферат: Спосіб діагностики дисбіозу при хронічному катаральному гінгівіті у дітей та підлітків включає використання мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції для визначення кількісного співвідношення загальної бактмаси, Lactobacterium spp., Enterobacterium spp., Streptococcacea spp., Prevotella spp.+Porphyromonas spp., Micoplasma (hominis+genitalium), Eubacteridacea spp., Candida spp. При цьому дослідження проводять у зразку приясенної біоплівки, порівнюють із показниками для інтактних ясен вікової групи та визначають кількісну перевагу, відповідно, умовно-коменсальних, умовно-патогенних, карієсогенних, пародонтопатогенних чи патогенних видів. UA 118422 U (12) UA 118422 U UA 118422 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузей медицини і стоматології, та може бути використана для діагностики дисбіозу у приясенній біоплівці й обґрунтування вибору пробіотиків в комплексі лікування і профілактики ускладнень. Наразі доведено, що в етіології та/або патогенезі хронічних запальних процесів ясен та періодонтальної зв'язки беруть участь локальні зміни кількісного і якісного співвідношення мікрофлори у мікробній біоплівці, у безпосередній близькості до locus morbi [Distinguishing the Signals of Gingivitis and Periodontitis in Supragingival Plaque: a Cross-Sectional Cohort Study in Malawi. Shaw L, Harjunmaa U, Doyle R, Mulewa S, Charlie D, Maleta K, Callard R, Walker AS, Balloux F, Ashorn P, Klein N. Appl Environ Microbiol. 2016 Sep 16;82(19):6057-67. doi: 10.1128/AEM.01756-16.]. Розширення показань до застосування пробіотиків для лікування та профілактики хронічного катарального гінгівіту, пародонтиту і карієсу, все ще не є остаточно доведеним і повністю безпечним, та вимагає щонайменше діагностики дисбіозу у біоплівці [Probiotics to counteract biofilm-associated infections: promising and conflicting data. Vuotto C, Longo F., Donelli G. International Journal of Oral Science (2014) 6, 189-194; doi: 10.1038/ijos.2014.52]. Крім того, хронічний катаральний гінгівіт (ХКГ), у розумінні робочої української класифікації, на основі класифікації Данилевського М.Ф., є досить неоднорідним [П.М. Скрипников, Т.В. Поліщук, О.А. Шликова, В.І. Шинкевич. Застосування препаратів "Лісобакт" та "Лацидофіл®Wm" може підвищувати ефективність комплексного лікування хронічного катарального гінгівіту І-ІІ ступенів тяжкості в дітей віком 12-15 років //Український стоматологічний альманах. 2012. № 5. URL: http//cyberleninka.ru/article/n/zastosuvannya-preparativ-lisobakt-ta-latsidofil-wm-mozhe-pidvischuvatiefektivnist-kompleksnogo-likuvannya-hronichnogo-kataralnogo (дата обращения: 12.12.2016)]. Для діагностики дисбіозу взагалі у порожнині рота використовують: метод бактпосіву з визначення колоніє-утворюючих одиниць (КУО) і ідентифікацією бактерій; метод біохімічного визначення співвідношення активності уреази і лізоциму за Левицьким и др. (2006) [Пат. № 16048 Україна. МПК А61В 5/00. Спосіб оцінки дисбактеріозу порожнини рота /Левицький А.П., Макаренко О.А., Селіванська І.О. та ін. (UA); Інститут стоматології АМН України (UA). - № u200601643; заявл. 17.02.2006; опубл. 17.07.2006, Бюл. № 7]; метод визначення трипсиноподобної активності кревікулярної рідини на основі гідролізу синтетичного пептида Nбензіол-DL-аргінин-2-нафтиламіда (BANA); концентрацію неспецифічних нейтральних протеаз, та навіть вимірювання бактеріальної активності за допомогою лазерної проточної цитометрії [Rabinovich O.F. Oral fluid bacteriocidal activity in complex diagnostics of oral disbiosis /O.F. Rabinovich, E.S. Abramova //Stomatologiia (Mosk) - 2012. - Vol. 91, N 3. - P.35-37.]. Однак, різні мікроорганізми мають різну здатність, або не здатні взагалі до росту у культуральному середовищі; важливо, що у нативних умовах, тобто у складі біоплівок, бактерії виявляють "іншу поведінку", а саме здатні набувати патогенетичний потенціал та резистентність до антибактерійних засобів і захисних механізмів господаря; метаболіти й ензими можуть мати походження і з бактерій, І з клітин макроорганізму; проточна цитометрія є дороговартісною процедурою. Методика ПЛР у реальному часі (РЧ-ПЛР), очевидно, є одним з оптимальних на сьогодні способів вивчення нативного складу мікробіоти, на результати якої не впливають культуральні умови, здатність до росту бактерій, концентрації кисню, ендогенних ензимів і т.п. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є "Спосіб використання мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції для визначення пародонтопатогенної флори" [Пат. № 65337 Україна, МПК G01N 33/00. Спосіб використання мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції для визначення пародонтопатогенної флори /І.П. Кайдашев, Л.Е. Весніна, О.А. Шликова та ін. (UA); Вищий державний навчальний заклад України "Українська медична стоматологічна академія" (UA). - № u201100737; заявл.24.01.2011; опубл. 12.12.2011, Бюл. № 23]. Суть способу полягає в тому, що відбирають пробу зі слизової оболонки порожнини рота натщесерце стерильним зондом обертальними рухами, з цієї проби виділяють ДНК іпроводять кількісне визначення співвідношень таких показників: загальної бактеріальної маси, Lactobacillus spp., Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Mycoplasma genitalium+hominis, Candida spp. за допомогою мультиплексної ланцюгової реакції в режимі реального часу. Але відсутність критеріїв дисбіозу при хронічному катаральному гінгівіті у дітей та підлітків, трактування отриманих даних, відсутність кількісних показників біоплівки при інтактних яснах, унеможливлює його застосування з даною метою. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу діагностики дисбіозу при хронічному катаральному гінгівіті у дітей та підлітків на основі обчислення кількісних співвідношень патогенних, умовно-патогенних й коменсальних видів бактерій у зразку приясенної біоплівки, визначених методом РЧ-ПЛР. 1 UA 118422 U 5 10 15 Поставлену задачу вирішують використанням мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції для визначення кількісного та якісного співвідношення щонайменше семи бактеріальних видів: Lactobacterium spp., Enterobacterium spp., Streptococcacea spp., Prevotella spp.+Porphyromonas spp., Eubacteridacea spp., Micoplasma (hominis+genitalium) та Candida spp., при цьому, згідно з корисною моделлю, визначення проводять у зразку приясенної зубної біоплівки та порівнюють отримані результати з віковою нормою для інтерпретації. Заявлений спосіб виконується наступним чином: Відбирають зразок з поверхні зубів у безпосередній близькості до ясенного краю (найбільш активного запалення) не торкаючись його. Для відбору зразку використовують стерильний мікробраш, або стерильний стоматологічний екскаватор; потім поміщують у мікропробірку типу епендорф із стерильним фізіологічним розчином чи суху, та протягом години доставляють до лабораторії. З проб виділяють ДНК, у зразках яких проводять якісну та кількісну оцінку і співвідношення 8 показників, які складаються з 7 видів зазначених мікроорганізмів і загальної бактеріальної маси за допомогою набору реагентів "Фемофлор 8" (Виробник: ООО "НПО ДНКТехнология", Росія) методом РЧ-ПЛР. Результати реєструють за допомогою ампліфікатора ДТ322 (НПО "ДНК-Технология", Москва, Росія); після ампліфікації, програмно обчислюють кількість загальної бактеріальної маси та кожного з видів мікроорганізмів. Порівнюють отримані результати з показниками для здорових ясен (табл. 1). Таблиця 1 Середні кількісні показники представників мікробної приясенної біоплівки при інтактних яснах у осіб 9-15 років Gardnerella+ Загальна StreptoLactobac- EnterobacPrevotella+ EubacteriMicoplasma Candida бактеріальcoссасеа terium spp. terium spp. Porphyro- dacea spp. (hominis+genitaliurn) spp. на маса spp. monas spp. 1 2 3 4 5 6 1 8 3,86±0,92 3,06±0,92 3,4±0,59 6,38±1,41 4,53±1,61 5,1±1,4 5,34±1,7 5,01±2,17 3,4/4,3 2,3/3,9 2,9/3,8 5,3/7,9 3,4/5,9 3,8/6,5 4,1/7,3 3,6/7,3 р3