Оптимізоване поживне середовище для культивування клітин-продуцентів антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Реферат: Оптимізоване поживне середовище для культивування клітин-продуцентів антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби включає середовища Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики. Додатково містить як стимулятор продуктивної активності і відновлення клітини культури FLK-BLV, як продовжувач її продуктивного віку актовегін та диметилсульфоксид. UA 118520 U (12) UA 118520 U UA 118520 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології і стосується складу поживного середовища для культивування перещеплюваних ліній клітин FLK-BLV, які продукують антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ), призначений для діагностики лейкозу імунологічними методами. Відомо спосіб одержання культурального антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ), де застосовують поживне середовище для культивування клітин культури FLKBLV, яке вміщує 90 % мінімального середовища Ігла (MEM) (із солями Ерла), 10 % сироватки 3 3 ембріонів корів, 850 mg/дм NaHCO 3, 120 mg/дм натрію пірувату і розчин замінних амінокислот та пропонується як альтернатива традиційному культуральному антигену для РІД (Cell Line Data Base //http: //bioinformatics.istge.it/cldb/cll372.html). Пропонується також для одержання антигену ВЛВРХ збагачувати поживне середовище інсуліном та використовувати в його складі аглобулінову сироватку крові ВРХ (Удосконалення технології виробництва антигену для серологічної діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії. - Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - 2011, вип. 95. – С. 227-229). Недоліком даних технологій є недостатня стандартизація сироваток, що входять до складу поживних середовищ, дорога вартість та складність методів їх приготування. Найбільш близьким до рішення, що заявляється, є поживне середовище для вирощування виробничого штаму клітин FLK-BLV, продукуючих антиген ВЛВРХ (ДСТУ 7058:2009 "Антиген для серологічної діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії". Технічні умови). До складу даного середовища входить середовище Ігла (50 %), середовище 199 (40 %), сироватка крові ВРХ (10 %) та антибіотики. Це рішення може бути прототипом. Недостатня стандартизація сироваток, що входять до складу поживних середовищ веде до отримання клітин з низьким потенціалом життєздатності, тому використання лише сироватки крові ВРХ у складі поживного середовища не підтримує довготривалої функціональної активності клітин моношару культури, цим самим, не забезпечує високий рівень продукції антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити поживне середовище для культивування перещеплюваної культури клітин FLK-BLV, продуцента антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби, яке містить середовища Ігла та 199, сироватку крові ВРХ вільну від протилейкозних антитіл та антибіотики шляхом додавання актовегіну та диметилсульфоксиду (ДМСО) при наступному співвідношенні компонентів (мас. %): середовище Ігла 45-50 середовище 199 40-45 сироватка крові ВРХ 10-15 актовегін 0,14-0,16 диметилсульфоксид 1,0-1,3 бензилпеніциліну натрієва -3 (0,0054-0,0066)×10 3 сіль, МО/см 3 гентаміцин, мг/см 3,0-5,0. для забезпечення росту, підвищення життєздатності, регенерації та продовження терміну функціональної активності клітин моношару культури FLK-BLV, що сприятиме підвищенню синтезу білків антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби. В даному поживному середовищі ростовими є середовища Ігла та 199, сироватка крові ВРХ як джерело факторів росту, транспортних білків і ліпідів; антибіотики запобігають росту сторонньої мікрофлори; диметилсульфоксид як розчинник та провідник виконує трансфузію основних поживних речовин, тим самим підсилює їх функцію; актовегін ліквідує дефіцит ростових факторів сироватки та у композиції з диметилсульфоксидом (ДМСО) позитивно впливає як на ранні процеси активації проліферації і омолодження клітин за рахунок активного споживання та утилізації глюкози і кисню, так і в культурі зі сформованим моношаром сприяє регенерації клітин, продовженню терміну їх продуктивного стану, що веде до підвищення накопичення вірусної маси. Крім вищеозначеного впливу на клітини культури, диметилсульфоксид запобігає бактерицидному та грибковому забрудненню (підсилює дію антибіотиків). Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що поживне середовище відрізняється від відомого вмістом актовегіну та диметилсульфоксиду, які підвищують продукцію антигену вірусу лейкозу ВРХ у перещеплюваній культурі клітинFLK-BLV за рахунок активації проліферації клітин моношару, продовжують термін їх продуктивної життєздатності, захищають від контамінації та забезпечують отримання більш активного антигену для серологічної діагностики лейкозу ВРХ, що відповідає критерію "новизна". Поживне середовище готується таким чином. 1 UA 118520 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 В умовах асептики змішують середовище Ігла, середовище 199, сироватку крові ВРХ, до суміші додають актовегін та диметилсульфоксид в означених дозах і антибіотики. Приклад 1. 3 3 Суспензію клітин FLK-BLV з концентрацією 100-300×10 кл/см засівають у стерильні флакони об'ємом 50-250 см до поживного середовища, яке містить середовище Ігла та 199, сироватку крові ВРХ, бензилпеніциліну натрієву сіль, гентаміцин. До ємкостей з засіяним поживним середовищем додають актовегін в дозах 0,12; 0,14; 0,16 %. Культуру клітин вирощують протягом 6-7 діб за температури 37 (±0,5)°С до повного виконання моношару. Як контроль використовують культуру клітин FLK-BLV без добавок. Після закінчення строку інкубації перещеплюваної культури клітин FLK-BLV відбирають вірусвмісну культуральну рідину, яку перевіряють на стерильність, піддають дворазовій дефростації та освітленню шляхом центрифугування протягом 30 хвилин в режимі 3000 об./хв. Для отримання антигену вірусу лейкозу ВРХ вірусвмісну культуральну рідину збирають з кожного 5 пасажу, концентрують з використанням розподілюючих колонок до 1/100 від первинного об'єму, або в плівці, проти ПЕГ 6000. Сконцентрований в такий спосіб антиген далі ресуспендують у фосфатно-сольовому фізіологічному розчині, (рН 7,0-7,2). Активність отриманого антигену визначають серологічним методом граничних розведень в реакції імунодифузії (РІД) з використанням контрольних позитивної та негативної діагностичних лейкозних сироваток за уніфікованою методикою. Активність антигену оцінюють за показниками кінцевого та робочого титру (таблиця 1) Активність антигену, отриманого на поживному середовищі з вмістом актовегіну в дозі 0,14 % перевищує контрольний в 1,75 разу на 5 пасажі культивування та 1,9 разу на 10 пасажі культивування, що показує на найвищі результати цього досліду. Приклад 2. 3 3 Суспензію клітин FLK-BLV з концентрацією 100-300×10 кл/см засівають у стерильні 3 флакони об'ємом 50-250 см до поживного середовища, яке містить середовища Ігла та 199, сироватку крові ВРХ, бензилпеніциліну натрієву сіль, гентаміцин. До ємкостей з засіяним поживним середовищем додають диметилсульфоксид ДМСО в дозах 0,5; 1,0; 2,0 %. Культуру клітин вирощують протягом 6-7 діб за температури 37 (±0,5)°С до повного виконання моношару. Як контроль використовують культуру клітин FLK-BLV без добавок. Після закінчення строку інкубації перещеплюваної культури клітин FLK-BLV відбирають вірусвмісну культуральну рідину, перевіряють на стерильність, піддають концентрації та визначають активність отриманого антигену за вищеозначеною методикою (приклад 1). Результати визначення активності отриманих антигенів наведено в таблиці 2. Стимуляція клітин культури FLK-BLV диметилсульфоксидом в дозі 1,0 % підвищує активність антигену в 1,7 разу на 5 пасажі культивування та 1,75 разу на 10 пасажі культивування, що є найкращими результатами цього досліду. Приклад 3. 3 3 Суспензію клітин FLK-BLV з концентрацією 100-300×10 кл/см засівають у стерильні 3 флакони об'ємом 50-250 см до поживного середовища, яке містить середовища Ігла та 199, сироватку крові ВРХ, бензилпеніциліну натрієву сіль, гентаміцин. До ємкостей з засіяним поживним середовищем додають актовегін в дозі 0,14 % та диметилсульфоксид в дозі 1,0 %. Культуру клітин вирощують протягом 6-7 діб за температури 37 (±0,5)°С до повного виконання моношару. Як контроль використовують культуру клітин FLK-BLV без добавок. Після закінчення строку інкубації перещеплюваної культури клітин FLK-BLV відбирають вірусвмісну культуральну рідину, перевіряють на стерильність, піддають концентрації та визначають активність отриманого антигену за вищеозначеною методикою (приклад 1). Результати визначення активності отриманих антигенів наведено в таблиці 3. Таким чином, застосування запропонованого поживного середовища для культивування клітин, продукуючих антиген ВЛВРХ, з вмістом препаратів актовегін в дозі 0,14 % та ДМСО в дозі 1 %, підвищує його активність у 2 рази відносно до контрольного, що може використовуватись у технології виготовлення препаратів для серологічної діагностики лейкозу на підприємствах по виробництву діагностичних ветеринарних препаратів. 2 UA 118520 U Таблиця 1 Оптимізоване поживне середовище для культивування клітин-продуцентів антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби група КА А1 А2 A3 5 пасаж 10 пасаж Активність Вища активність від К Активність антигену в Вища активність від К в антигену в РІД враз РІД разів 1:2 1:1,8 1:2,5 1,25 1:2,2 1,2 1:3,5 1,75 1:3,4 1,9 1:1,8 1:1,5 0,1 0,3 Примітка: КА - контрольний антиген, отриманий на поживному середовищі без актовегіну; А1 антиген, отриманий на поживному середовищі з додаванням актовегіну у дозі 0,12 %; А2 антиген, отриманий на поживному середовищі з додаванням актовегіну у дозі 0,14 %; A3 антиген, отриманий на поживному середовищі додаванням актовегіну у дозі 0,16 %. Таблиця 2 Оптимізоване поживне середовище для культивування клітин - продуцентів антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби група КД Д1 Д2 Д3 5 пасаж 10 пасаж Активність Вища активність від К Активність антигену в Вища активність від К в антигену в РІД в раз РІД разів 1:2 1:2 1:2,2 1,1 1:2,5 1,25 1:3,4 1,7 1:3,5 1,75 1:2,8 1,4 1:2,8 1,4 Примітка: КД - контрольний антиген, отриманий на поживному середовищі без додавання диметилсульфоксиду; Д1 - антиген, отриманий на поживному середовищі з додаванням диметилсульфоксиду у дозі 0,5 %; Д2 - антиген, отриманий на поживному середовищі з додаванням диметилсульфоксиду у дозі 1,0 %; Д3 - антиген, отриманий на поживному середовищі додаванням диметилсульфоксиду у в дозі 2,0 %. 5 Таблиця 3 Активність антигенів, отриманих на комплексному поживному середовищі Дослідний антиген, титр Нативний 1:2 1:4 1:6 нативна +++ +++ +++ 1:2 ++++ ++++ ++++ ПКС, титр антитіл 1:3 1:4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Контрольний антиген, титр Нативний 1:2 1:4 1:6 +++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ 3 ++++ ++++ 1:5 +++ +++ ++++ 1:6 +++ +++ UA 118520 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Оптимізоване поживне середовище для культивування клітин-продуцентів антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що включає середовища Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики, яке відрізняється тим, що містить додатково як стимулятор продуктивної активності і відновлення клітини культури FLK-BLV, як продовжувач її продуктивного віку актовегін та диметилсульфоксид, при наступному співвідношенні компонентів (мас. %): середовище Ігла 45-50 середовище 199 40-45 сироватка крові ВРХ 10-15 актовегін 0,14-0,16 диметилсульфоксид 1,0-1,3 3 -3 бензилпеніциліну натрієва сіль, МО/см (0,0054-0,0066)×10 3 гентаміцин, мг/см 3,0-5,0. 10 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4