Спосіб одержання рекомбінантного антигену для визначення антитіл проти вірусу лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії

Реферат: Спосіб одержання рекомбінантного антигену для визначення антитіл проти вірусу лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії включає отримання трансформованого клону E.coli HB101-2, накопичення бактерійної маси, стимулювання експресії антигенів ВЛВРХ, руйнування клітин для виділення антигену, кінцеву очистку. Отриманий трансформований клон експресує антигени gp51 та р24 вірусу. Накопичення бактерійної маси проводять на м'ясопептонному бульйоні з додаванням екстракту дріжджів та NaCl. Кінцеву очистку проводять за допомогою комерційної сироватки проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин. UA 101576 U (12) UA 101576 U UA 101576 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології і стосується способів одержання рекомбінантних антигенів, які застосовуються для діагностики лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ) в реакції імунодифузії (РІД). Відомо спосіб одержання рекомбінантного глікопротеїдного антигену gp51/gp30(T-) для реакції імунодифузії, що експресується у бакуловірусній системі та пропонується як альтернатива традиційному культуральному антигену для РІД (Agar gel immunodiffusion analysis using baculovirus-expressed recombinant bovine leukemia virus envelope glycoprotein (gp51/gp30(T)/ S.I. Lim [et al.]// J Vet Sci. - 2009. - Vol. 10(4). - P. 331-336). Недоліками даного способу є застосування високодорогої експресуючої системи клітин комах, заражених бакуловірусом, процедури високошвидкісного центрифугування для видалення вірусу комах та відсутність у кінцевому продукті важливого для діагностики білкового антигену р24 вірусу лейкозу ВРХ. Існує спосіб клонування, експресії та очистки білка р24 ВЛВРХ, який включає трансформацію клітин Е. соlі, отримання клонів, експресуючих білок р24, їх вирощування на середовищі Лурія-Бертані, індукцію експресії 1 мМ ізопропіл--D-тіогалактопіранозиду (IPTG) з подальшим осадженням і руйнуванням клітин-продуцентів, видаленням нуклеїнових кислот, осадженням білка насиченим розчином сульфату амонію та поліетиленіміном і кінцеве очищення рекомбінантного продукту методом метал-афінної хроматографії (Qualley, D.F. Expression, purification, and characterization of full-length bovine leukemia virus Gag protein from bacterial culture [Text]/ D.F. Qualley, B.L. Boleratz // Protein Expr Purif. - 2014. - 93. - P. 32-37). За цим способом використовуються високодорогі метал-афінна хроматографія для очищення кінцевого продукту, середовище Лурія-Бертані та реактив IPTG у 1 мМ концентрації у процесі накопичення антигену, додаткові процедури видалення нуклеїнових кислот і компоненти для осадження білка. Одержаний у цей спосіб рекомбінантний антиген не містить глікопротеїдного антигену gp51 ВЛВРХ. Найбільш близьким до рішення, що заявляється, є спосіб одержання рекомбінантного антигену р24 ВЛВРХ, який включає трансформацію клітин Е. соlі, відбір клонів, експресуючих рекомбінантний білок, вирощування трансформованих клітин на середовищі Лурія-Бертані, індукцію експресії за допомогою IPTG, руйнування клітин, кінцеву очистку методом металхелатної афінної хроматографії та визначення активності в реакції вестерн-блотінгу (Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use in the immunoblotting assay [Text]/ L. Bicka [et al.] // Acta Biochim Pol. - 2001. - Vol. 48(1). - P. 227-232). Це рішення може бути прототипом. Але відомо, що серологічна діагностика лейкозу базується на реакціях імунодифузії та імуноферментного аналізу і передбачає використання двох антигенів вірусу лейкозу gp51 та р24. Також середовище Лурія-Бертані та процедура метал-хелатної афінної хроматографії є високодорогими. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб одержання рекомбінантного антигену для визначення антитіл проти вірусу лейкозу великої рогатої худоби для реакції імунодифузії, що включає отримання трансформованого клону Е.соlі НВ101-2, накопичення бактерійної маси, стимулювання експресії антигенів ВЛВРХ, руйнування клітин для виділення антигену, кінцеву очистку шляхом отримання трансформованого клону, який експресує антигени gp51 та р24 вірусу, накопичення бактерійної маси на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням екстракту дріжджів, проведення кінцевої очистки за допомогою комерційної сироватки проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин, щоб забезпечити отримання активного специфічного антигену, який може бути застосований при серологічній діагностиці лейкозу великої рогатої худоби для виявлення антитіл проти імунодомінантних антигенів gp51 та р24 вірусу. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що у запропонованому способі, на відміну від відомого, використовується трансформований клон Е.соlі НВ101-2, який експресує обидва антигени gp51 та р24 вірусу лейкозу, накопичення бактерійної маси проводиться на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням екстракту дріжджів та NaCl, адсорбція проводиться комерційною сироваткою проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин та визначення його активності в РІД, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконують таким чином. Спочатку проводять конструювання трансформованого клону Е.соlі НВ101-2, який експресує обидва антигени gp51 та р24 вірусу лейкозу. Потім проводять накопичення бактерійної маси на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням екстракту дріжджів та NaCl (до кінцевої концентрації 5 3 3 г/дм та 10 г/дм ) протягом 18 годин за температури 37 °C на шейкер-апараті з режимом струшування (100-120) об./хв. Після чого проводять індукцію експресії 1 мМ IPTG, подальше руйнування за допомогою дворазового заморожування-відтаювання у буферному середовищі, обробку ультразвуком при максимальній потужності в режимі 15×20 секунд. Отриманий антиген 1 UA 101576 U 5 10 15 20 25 30 35 40 фільтрують через мембрани з діаметром пор (0,1-0,22) мкм, адсорбують комерційною сироваткою проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин та визначають його активность в РІД. Приклад 1. Для одержання рекомбінантного антигену ВЛВРХ було сконструйовано гетерологічну експресуючу систему з використанням трансформованого клону бактерій виду Е.соlі. Для цього була отримана рекомбінантна плазміда pUC19- EcoRI- colprom-SmaI-полілінкер- BamHI-envEcoRI-gag- Hindlll- pUC19, яка є носієм нуклеотидної послідовності повнофункціональних генів env та gag ВЛВРХ. Отриманою конструкцією були трансформовані клітини Е.соlі НВ101. Ефективність вбудовування ф'южн-послідовності ділянок, що кодують gp51 та р24 ВЛВРХ, була підтвердждена під час проведення скринінгу за допомогою спеціально створених олігонуклеотидів у позитивному трансформованому клону Е.соlі НВ101-2. Приклад 2. Рекомбінантний антиген ВЛВРХ виготовляли з бактерійної маси трансформованого клону Е.соlі НВ101-2, який є носієм вбудованої ф'южн-послідовністі ділянок, що кодують gp51 та р24 вірусу лейкозу. Клон Е. соlі НВ101-2 вирощували на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням 3 3 екстракту дріжджів та NaCl до кінцевої концентрації 5 г/дм та 10 г/дм відповідно. Культивування проводили протягом 18 годин за температури 37 °С на шейкер-апараті з режимом струшування (100-120) об/хв. Експресію антигенів ВЛВРХ стимулювали додаванням 1 мМ IPTG. Для виділення антигену бактерійну масу піддавали дворазовому заморожуваннювідтаюванню у буферному середовищі, руйнуванню ультразвуком при максимальній потужності в режимі 15×20 секунд та фільтруванню через мембрани з діаметром пор (0,1-0,22) мкм. Активність та специфічність виготовленого антигену (АГ-IPTG) визначали в РІД з використанням контрольних позитивної (ПКС) та негативної діагностичних лейкозних сироваток (НКС), сироватки ембріонів ВРХ (ЕС) за уніфікованою методикою в порівнянні з стандартизованим культуральним антигеном ВЛВРХ (АГК). Результати вивчення активності та специфічності отриманого антигену в РІД наведено у таблиці 1. Таким чином, отриманий антиген є активним але недостатньо специфічним, оскільки утворює дві лінії преципітації з контрольною позитивною сироваткою та позитивно реагує з негативною діагностичною лейкозною сироваткою. Приклад 3. Для підвищення специфічності отриманого антигену проводили адсорбцію препарату сироваткою проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин (СЕ). Для цього змішували АГ-IPTG та нативну СЕ в рівних співвідношеннях, витримували 30 хв. за температури 24 °C, осаджували центрифугуванням при 2500 об./хв. протягом 30 хв., надосадову рідину досліджували в РІД Результати вивчення активності та специфічності отриманого адсорбованого антигену АГ-IPTGCE наведено у таблиці 2. Таким чином, після адсорбції специфічність рекомбінантного антигену ефективно підвищувалась, про що свідчить відсутність додаткових ліній преципітації між антигеном адсорбованим та ПКС, НКС і СЕ. Таким чином, виготовлений за цим способом рекомбінантний антиген може використовуватись для серологічної діагностики лейкозу великої рогатої худоби на підприємствах з виробництва діагностичних препаратів. Таблиця 1 Спосіб одержання рекомбінантного антигену для визначення антитіл проти вірусу лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії № Антигени 1 2 АГ-IPTG АГК ПКС +д + Активність, РІД НКС + EC Примітка. ПКС - позитивна контрольна сироватка крові, НКС - негативна контрольна сироватка крові, EC - сироватка ембріонів ВРХ, д - дві лінії преципітації, + реакція позитивна, - реакція негативна; АГ-IPTG - антиген рекомбінантний, АГК - антигенстандартизований. 45 2 UA 101576 U Таблиця 2 Спосіб одержання рекомбінантного антигену для визначення антитіл проти вірусу лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії № Антигени 1 2 АГ-IPTG-CE АГК ПКС + + Активність, РІД НКС СЕ Примітка. ПКС - позитивна контрольна сироватка крові, НКС - негативна контрольна сироватка крові, СЕ - сироватка проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин, + реакція позитивна, - реакція негативна; АГ-IPTG-CE антиген рекомбінантний адсорбований, АГК антиген стандартизований. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб одержання рекомбінантного антигену для визначення антитіл проти вірусу лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії, що включає отримання трансформованого клону E.coli HB101-2, накопичення бактерійної маси, стимулювання експресії антигенів ВЛВРХ, руйнування клітин для виділення антигену, кінцеву очистку, який відрізняється тим, що отриманий трансформований клон експресує антигени gp51 та р24 вірусу, накопичення бактерійної маси проводять на м'ясо-пептонному бульйоні з додаванням екстракту дріжджів та NaCl, кінцеву очистку проводять за допомогою комерційної сироватки проти ешеріхіозу сільськогосподарських тварин. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3