Поживне середовище для культивування перещеплюваної культури клітин flk-blv – продуцента антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Реферат: Поживне середовище для культивування перещеплюваної культури клітин FLK-BLV продуцента антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби включає середовище Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики. Містить додатково як стимулятор продукції антигену вірусу лейкозу перекис водню. UA 84930 U (12) UA 84930 U UA 84930 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології і стосується складу поживного середовища для культивування перещеплюваних ліній клітин FLK-BLV, які продукують антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ), призначений для діагностики лейкозу імунологічними методами. Для культивування клітин FLK-BLV, що використовують з метою виготовлення антигену для діагностики лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ), застосовують поживне середовища, яке вміщує 90 % мінімального середовища Ігла (MEM) (із солями Ерла), 10 % сироватки ембріонів З 3 корів, 850 mg/дм NaHCO 3, 120 mg/дм натрію пірувату та розчин замінних амінокислот (Cell Line Data Base //http://bioinformatics.istge.it/cldb/c11372.html). Пропонується також для одержання антигену ВЛВРХ збагачувати поживне середовище інсуліном, актовегіном, диметилфульфоксидом та використовувати в його складі аглобулінову сироватку крові ВРХ (Удосконалення технології виробництва антигену для серологічної діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії. - Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник.-2011, вип. 95. - С 227-229). Недоліками даних середовищ є висока вартість, багатокомпонентність та трудомісткість у їх приготуванні. Найбільш близьким до рішення, що заявляється, є поживне середовище для вирощування виробничого штаму клітин FLK-BLV, продукуючих антиген ВЛВРХ (ДСТУ 7058:2009 "Антиген для серологічної діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузіі". Технічні умови). До складу даного середовища входить середовище Ігла (50 %), середовище 199 (40 %), сироватка крові ВРХ (10 %) та антибіотики. Це рішення може бути прототипом. Але відомо, що використання лише сироватки крові ВРХ у складі поживного середовища не забезпечує високий рівень продукції антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV. В основу корисної моделі поставлена задача розробити поживне середовище для культивування перещеплюваної культури клітин FLK-BLV - продуцента антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби, яке містить середовища Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики шляхом додавання перекису водню при наступному співвідношенні компонентів (мас. %): середовище Ігла 45-50 середовище 199 40-45 сироватка крові ВРХ 10-15 -3 бензилпеніциліну натрієва сіль (0,0054-0,0066)×10 гентаміцин 3,0-5,0 -3 перекис водню (0,027-0,034)×10 , щоб забезпечити підвищення активності антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV. В даному поживному середовищі ростовими є середовища Ігла та 199, сироватка крові ВРХ застосовується як джерело факторів росту, транспортних білків і ліпідів, антибіотики запобігають росту сторонньої мікрофлори, перекис водню активує експресію вірусу лейкозу та його антигенів. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що поживне середовище відрізняється від відомого вмістом перекису водню, який підвищує продукцію антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV та забезпечує отримання більш активного антигену для серологічної діагностики лейкозу ВРХ, що відповідає критерію "новизна". Поживне середовище готується таким чином. В умовах асептики змішують середовище Ігла, середовище 199, сироватку крові ВРХ. До суміші додають антибіотики та перекис водню. Приклад 1 3 Суспензію клітин FLK-BLV засівали у стерильні флакони об'ємом 50-250 см з концентрацією 3 3 100-300×10 клітин/см поживного середовища, до складу якого входили середовище Ігла, середовище 199, сироватка крові ВРХ, бензилпеніциліну натрієва сіль та гентаміцин. Культуру клітин вирощували протягом 2 діб за температури 37 (±0,5)°С до 90-100 % виконання -3 моношару. До флаконів додавали перекис водню до концентрації (0,017-0,068)×10 . Культуру клітин додатково інкубували за температури 37(±0,5) °С протягом 4, 24, 72 та 148 годин. Як контроль використовували культуру клітин FLK-BLV без додавання препарату. Після закінчення строку інкубації перещеплюваної культури клітин FLK-BLV відбирали культуральну рідину, яку піддавали дворазовій дефростації та освітленню шляхом центрифугування протягом 30 хвилин в режимі 3000 об./хв. Для отримання антигену вірусу лейкозу ВРХ культуральну рідину концентрували до 1/100 від первинного об'єму за допомогою 1 UA 84930 U 5 10 15 20 25 ПЕГ 6000. Сконцентрований в такий спосіб антиген далі ресуспендували у фосфатносольовому фізіологічному розчині, рН 7,0-7,2. Активність отриманого антигену визначали серологічним методом граничних розведень в реакції імунодифузіі (РІД) з використанням контрольних позитивної та негативної діагностичних лейкозних сироваток та стандартизованого антигену ВЛВРХ за уніфікованою методикою. Активність антигену оцінювали за показниками кінцевого та робочого титру. Результати визначення активності антигенів, отриманих після додавання різних концентрацій перекису водню з різними строками впливу, наведено у таблиці 1. -3 Таким чином, додавання (0,017-0,034)×10 мас. % перекису водню під час культивування клітин, які продукують антиген ВЛВРХ, з подальшим інкубуванням протягом 72 годин, підвищує активність лейкозного антигену в 1,5-2 рази. Приклад 2 3 Суспензію клітин FLK-BLV засівали у стерильні флакони об'ємом 50-250 см з концентрацією 3 3 100-300×10 клітин/см поживного середовища, до складу якого входив перекис водню (0,017-3 0,034)×10 мас. %. Культуру клітин вирощували протягом 5-7 діб за температури 37(±0,5) °С. Пересів культури виконували по мірі виповнення моношару клітин. Виконували 3 послідовних пасажі культури клітин. Як контроль використовували культуру клітин FLK-BLY без додавання препарату. Після закінчення строку інкубації перещеплюваної культури клітин FLK-BLV отримували культуральну рідину, з якої виготовляли антигени ВЛВРХ, активність яких визначали в реакції імунодифузії (приклад 1). Результати визначення активності антигенів, отриманих з використанням поживних середовищ різного складу, наведено у таблиці 2. Таким чином, застосування запропонованого поживного середовища з вмістом 8,0-10,0 мкМ перекису водню для культивування клітин, продукуючих антиген ВЛВРХ, на рівні 2-3 пасажу підвищує активність лейкозного антигену в 1,5 рази, що може використовуватись у технології виготовлення препаратів для серологічної діагностики лейкозу на підприємствах по виробництву діагностичних ветеринарних препаратів. Таблиця 1 Поживне середовище для культивування перещеплюваної культури клітин FLK-BLV продуцента антигену вірусу лейкозу ВРХ № пп 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Концентрація перекису водню у поживному середовищі, мкМ -3 (0,017-0,034)×10 -3 (0,037-0,068)×10 контроль -3 (0,017-0,034)×10 -3 (0,037-0,068)×10 контроль -3 (0,017-0,034)×10 -3 (0,037-0,068)×10 контроль -3 (0,017-0,034)×10 -3 (0,037-0,068)×10 контроль Строк впливу перекису водню, годин 4 24 72 148 30 2 Кінцевий титр антигену Робочий титр антигену 1:3 нативний нативний 1:2 нативний 1:8 1:6 1:2 1:4 1:4 1:4 1:2 нативний нативний нативний 1:2 1:2 нативний нативний нативний нативний нативний UA 84930 U Таблиця 2 № пп 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Концентрація перекису водню у поживному середовищі, -3 (0,017-0,024)×10 -3 (0,027-0,034)×10 мкМ Кінцевий титр антигену Робочий титр антигену 1:8 1:6 1:7 1:7 1:7 1:7 1:6 1:7 1:7 -3 (0,017-0,024)×10 -3 (0,027-0,034)×10 -3 (0,017-0,024)×10 -3 (0,027-0,034)×10 1:3 1:2 1:3 1:2 1:3 1:2 1:2 1:3 1:2 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Поживне середовище для культивування перещеплюваної культури клітин FLK-BLV продуцента антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що включає середовище Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики, яке відрізняється тим, що містить додатково як стимулятор продукції антигену вірусу лейкозу перекис водню при наступному співвідношенні компонентів (мас.%): середовище Ігла 45-50 середовище 199 40-45 сироватка крові ВРХ 10-15 -3 бензилпеніциліну натрієва сіль (0,0054-60,0066)х10 гентаміцин 3,0-5,0 -3 перекис водню (0,027-0,034)х10 . 10 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3