Поживне середовище для культивування клітин, продукуючих антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Реферат: Поживне середовище для культивування клітин, продукуючих антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби включає суміш середовищ Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики. Додатково містить натрію вальпроат. UA 72607 U (12) UA 72607 U UA 72607 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології і стосується складу поживного середовища для культивування перещеплюваних ліній клітин, які продукують антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ), призначений для діагностики лейкозу серологічними методами. Відомо поживне середовище культивування клітин, призначених для отримання онкорнавірусного антигену, до складу якого з метою підвищення виходу цільового продукту додають гемогідролізат (А.С 1585951, А1, А61К39/12 « Способ получения антигена для діагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии"). Існує також ростове середовище для одержання антигену ВЛВРХ, збагачене вітамінносольовими домішками (патент РФ № 2020960 СІ, 5А61К39/12 "Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота"). Недоліками даних середовищ є багатокомпонентність та трудомісткість у їх приготуванні. Найбільш близьким до рішення, що заявляється, є поживне середовище для вирощування виробничого штаму клітин FLK-BLV, продукуючих антиген ВЛВРХ (ДСТУ 7058:2009 "Антиген для серологічної діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузіі". Технічні умови). До складу даного середовища входить середовище Ігла (50 %), середовище 199 (40 %), сироватка крові ВРХ (10 %) та антибіотики. Але інтенсивність продукції антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV залежить від складу поживного середовища і є невисокою при застосуванні сироватки крові ВРХ у його складі (Сюрин В.Н. и др. /Вирусные болезни животных. - М. ВНИТИБП.-1998. - С. 391-392). В основу корисної моделі поставлено задачу розробити поживне середовище для культивування клітин, продукуючих антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби, яке містить суміш ростових середовищ Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики шляхом додавання натрію вальпроату при наступному співвідношенні компонентів (об%): середовище Ігла 45-50 середовище 199 40-45 сироватка крові ВРХ 10-15 бензилпеніциліну натрієва 3 сіль,МО/см 90-110 3 гентаміцин, мг/см 30-50 натрію вальпроат, мМ 0,5-1,0, щоб забезпечити підвищення активності та виходу антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV., Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що поживне середовище відрізняється від відомого вмістом натрію вальпроату, який стимулює продукцію вірусу та антигену вірусу лейкозу у перещеплюваній культурі клітин FLK-BLV та забезпечує отримання більш активного антигену для серологічної діагностики лейкозу ВРХ, що відповідає критерію "новизна". Поживне середовище готується таким чином. В умовах асептики змішують середовище Ігла, середовище 199, сироватку крові ВРХ, яка не вміщує антитіла до ВЛВРХ. До суміші додають антибіотики та натрію вальпроат. 3 Приклад 1. Суспензію клітин FLK-BLV засівають у стерильні флакони об'ємом 50-250 см з 3 3 концентрацією 100-300 × 10 клітин/см поживного середовища, до складу якого входить натрію вальпроат 0,5-1,0 мМ та 5,0-10,0 мМ. Культуру клітин вирощують протягом 5-7 діб за температури 37 (±0,5)°С. Пересів культури виконують у міру виповнення моношару клітин. Виконують 10 послідовних пасажів культури клітин. Як контроль використовують культуру клітин FLK-BLV без додавання препарату. Характер росту і морфологію клітин визначають під світловим мікроскопом. Показники інтенсивності росту та морфології моношару культури клітин, що вирощена на виготовленому поживному середовищі, наведено у таблиці 1. Таким чином, додавання натрію вальпроату до поживного середовища перещеплюваної культури клітин FLK-BLV у концентраціях 0,5-1,0 мМ позитивно впливає на морфологічний стан клітин, які зберігають типову веретеноподібну форму без виникнення вакуолізації, напластувань, пустот у моношарі протягом 10 послідовних пасажів. Приклад 2. Після закінчення строку інкубації перещеплюваної культури клітин FLK-BLV (приклад 1) на рівні I-V пасажів відбирають культуральну рідину, отриману з використанням поживного середовища з вмістом 0,5-1,0 мМ натрію вальпроату. Як контроль використовують культуральну рідину, отриману без додавання натрію вальпроату. Культуральну рідину піддають дворазовій дефростації та центрифугуванню протягом 30 хвилин в режимі 3000 об./хв. 1 UA 72607 U 5 10 15 Для отримання антигену культуральну рідину концентрують до 1/100 від первинного об'єму за допомогою ПЕГ 6000. Сконцентрований в такий спосіб антиген далі ресуспендують у фосфатносольовому фізіологічному розчині, рН 7,0-7,2. Активність отриманого антигену визначають серологічним методом граничних розведень в реакції імунодифузіі (РІД) з використанням контрольних позитивної та негативної діагностичних лейкозних сироваток та стандартизованого антигену ВЛВРХ за уніфікованою методикою. 3 Активність антигену оцінюють за показниками кінцевого титру та виходу з 1 дм культуральної рідини. Результати визначення активності антигенів, отриманих з використанням поживних середовищ різного складу, наведено у таблиці 2. Таким чином, застосування запропонованого поживного середовища для культивування клітин, продукуючих антиген ВЛВРХ, з додаванням 0,5-1,0 мМ (мілімолю) натрію вальпроату, на рівні 1 пасажу підвищує активність лейкозного антигену в 1,6 разу та вихід антигену в 2 рази та може використовуватись на підприємствах по виробництву діагностичних ветеринарних препаратів у технології виготовлення препаратів для серологічної діагностики лейкозу. Таблиця 1 Поживне середовище для культивування клітин, продукуючих антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби Концентрація Строк натрію 100 % вальпроату у виповнення поживному моношару, середовищі, мМ діб Морфологія клітин і моношару І пасаж II пасаж Контроль 5-7 Типова, форма подовжена веретеноподібна, розмір і розташування у моношарі типові 0,5-1,0 5-7 Типова Типова Типова Втрата типових ознак на 5-7 добу, вакуолізація, зменшення розміру та зміна форми клітин, напластування та локальне руйнування моношару 5,0-10,0 4-6 Типова 2 V пасаж X пасаж Втрата типових ознак на 2-3 добу, вакуолізації клітин та локусне руйнування моношару Типова, наявність зон росту Втрата типових ознак на 2-3 добу, вакуолізації клітин та локусне руйнування моношару Типова, наявність зон росту Повна деградація моношару UA 72607 U Таблиця 2 Поживне середовище для культивування клітин, продукуючих антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби № пп Концентрація натрію вальпроату у поживному середовищі, мМ 1 2 0,5-1,0 мМ Контроль 3 4 0,5-1,0 мМ Контроль 5 6 0,5-1,0 мМ Контроль 7 8 0,5-1,0 мМ Контроль 9 10 0,5-1,0 мМ Контроль Кінцевий титр антигену 1 пасаж 1:6-1:8 1:5 2 пасаж 1:4 1:5 3 пасаж 1:2-1:4 1:4 4 пасаж 1:4 1:3 5 пасаж 1:2-1:3 1:3 3 Робочий титр антигену Вихід антигену/дм , тис. доз 1:2 нативний 1,99-2,00 1,00 нативний нативний 0,99-1,00 0,99 нативний нативний 0,99-1,00 0,99 нативний нативний 0,99-1,00 0,99 нативний нативний 0,91-1,00 0,99 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Поживне середовище для культивування клітин, продукуючих антиген вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що включає суміш середовищ Ігла та 199, сироватку крові ВРХ та антибіотики, яке відрізняється тим, що додатково містить натрію вальпроат при наступному співвідношенні компонентів (об. %): середовище Ігла середовище 199 сироватка крові ВРХ бензилпеніциліну натрієва 3 МО/см 3 гентаміцин, мг/см натрію вальпроат, мМ 45-50 40-45 10-15 сіль, 90-110 30-50 0,5-1,0. 10 Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3