Спосіб визначення кількісного вмісту дибамку методом високоефективної рідинної хроматографії

Реферат: Спосіб кількісного визначення дибамку методом ультрависокоефективної рідинної хроматографії із використанням монолітної колонки. Використовують аналітичну систему ультра-ВЕРХ із монолітною колонкою, заповненою силікагелем октадецилсилільним, як рухому фазу А використовують фосфатний буферний розчин рН 5,5, рухому фазу В ацетонітрил - для хроматографії Р; дослідження проводяться в умовах градієнтного елюювання: час (хв.)/% РФА: 0/90; 2/9035; 5/35; 9/3590; 12/90; час хроматографування 15 хв.; швидкість потоку рухомої фази 1,2 мл/хв., об'єм інжекції 50 мкл, температура колонки 25 °C; детектування за довжини хвилі 254 нм, час утримування піку основної речовини складає 8 хв. UA 118993 U (12) UA 118993 U UA 118993 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до способів хімічного аналізу, а саме до способів визначення кількісного вмісту дибамку методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та може бути використаний для контролю якості лікарських речовин. У літературі описані методи контролю кількісного вмісту діючої речовини у субстанції дибамку методами УФ-спектрофотометрії та титрування [1], однак Державна Фармакопея України (ДФУ) [2] рекомендує у цьому випадку використовувати метод ВЕРХ, як найбільш чутливим і селективним інструментальний методом аналізу. Відомий спосіб кількісного визначення дибамку [1] у біологічних рідинах методом ВЕРХ із використанням фосфатного буферного розчину. Однак запропонований метод не забезпечує належного розділення одновного піку речовини та піків, які вносяться буферним розчином рухомої фази та розчинниками, що впливає на симетрію піків та на ефективність колонки, розрахованої відносно основного піку дибамку із розчину порівняння, та вимагає доопрацювання. Як прототип вибрано відомий спосіб [3]: Для кількісного визначення дибамку використано метод зворотнофазної рідинної хроматографії. Аналіз проводили на високоефективному рідинному хроматографі фірми Waters Alliance 2690 зі спектрофотометричним детектором UVVIS 486. Умови аналізу: хроматографічна колонка Xterra® розміром 4×250 мм, заповнена сорбентом з привитою фазою октадецилсилікагель, зернения 5 мкм; рухома фаза А: ацетонітрил, дегазований фільтрацією крізь фільтр ПОР-16; рухома фаза Б: фосфатний буфер, дегазований фільтрацією крізь фільтр ПОР-16; режим елюювання - градієнтний; швидкість потоку - 1 мл/хв.; температура термостата колонки 30 °С; детектування УФ-спектрофотометр за довжини хвилі 254 нм; об'єм проби 100 мкл. До недоліків способу можна віднести умови хроматографування, які не забезпечують належного хроматографічного розділення піків основної речовини та домішок, що вносяться рухомою фазою та розчинниками, та не можуть бути використані при кількісному визначенні діючої речовини дибензиламіду малонової кислоти у субстанції дибамку. Крім того, спосіб придатний лише для кількісного визначення дибамку у біологічних матеріалах. Задача корисної моделі полягає у створенні простого способу кількісного визначення дибамку методом ВЕРХ, який би міг забезпечити вимоги ДФУ до розчину порівняння при перевірці придатності хроматографічної системи, необхідну точність та відтворюваність результатів аналізу при проведенні контролю якості. Поставлена задача вирішується шляхом кількісного визначення дибамку методом ультрависокоефективної рідинної хроматографії із використанням монолітної колонки, корисною моделлю передбачено використання аналітичної системи ВЕРХ із колонкою заповненою силікагелем октадецилсилільним для хроматографії, як рухому фазу А використовують фосфатний буферний розчин рН 5,5, рухому фазу В ацетонітрил для хроматографії Р; дослідження проводяться в умовах градієнтного елюювання: час (хв.)/%РФА: 0/90; 2/9035; 5/35; 9/3590; 12/90; час хроматографування 15 хв.; швидкість потоку рухомої фази 1,2 мл/хв., об'єм інжекції 50 мкл, температура колонки 25 °C; детектування за довжини хвилі 254 нм, час утримування піку основної речовини складає 8 хв. Усі параметри заявленого способу визначено дослідним шляхом. Пропоновані умови елюювання забезпечують придатність хроматографічної системи відповідно до вимог ДФУ: коефіцієнт симетрії піку основної речовини динамку складає 1,19, ефективність колонки складає 69643 теоретичних тарілок; відносне стандартне відхилення 5 паралельних інжекцій розчину порівняння складає 0,23. У порівнянні із прототипом корисна модель характеризується рядом переваг: по-перше, досягнуто більш кращих показників ефективності хроматографічної системи, по-друге, забезпечено краще розділення основного піку речовини та додаткових піків домішок рухомих фаз та розчинників, що забезпечує належну специфічність дослідження. Корисна модель пояснюється прикладом. Приклад 1. Фосфатний буферний розчин рН 5,5. 8,25 г калію дигідрофосфату Ρ та 2,40 г динатрію гідрофосфату Ρ вміщають у мірну колбу місткістю 1000 мл, розчиняють в 900 мл води Р, доводять рН отриманого розчину до 5,5±0,05 розчином фосфорної кислоти розведеної, доводять об'єм розчину водою до позначки, перемішують та фільтрують крізь мембранний фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Випробовуваний розчин. 50 мг (точна наважка) субстанції дибамку поміщають у мірну колбу місткістю 50 мл, додають 30 мл ацетонітрилу Р, обробляють протягом 5 хв. на ультразвуковій бані до повного розчинення та об'єм розчину доводять тим же розчинником до позначки, 1 UA 118993 U 5 10 ретельно перемішують. Фільтрують крізь мембранний фільтр з діаметром пор не більше 0,45 мкм. Розчин використовують свіжоприготованим. Розчин порівняння. 50 мг (точна наважка) РСЗ дибамку поміщають у мірну колбу місткістю 50 мл, додають 30 мл ацетонітрилу Р, обробляють протягом 5 хв. на ультразвуковій бані до повного розчинення та об'єм розчину доводять тим же розчинником до позначки, ретельно перемішують. Фільтрують крізь мембранний фільтр з діаметром пор не більше 0,45 мкм. Розчин використовують свіжоприготованим. Умови хроматографування: рідинний хроматограф Varian "ProStar" з діодно-матричним детектором. Нерухома фаза: колонка хроматографічна 150×4,6 мм, заповнена силікагелем октадецилсилільним для хроматографії Ρ Waters XBridge® С18, із розміром часток 3,5 мкм. Рухома фаза А: Фосфатний буферний розчин рН 5,5. Рухома фаза В: ацетонітрил Р. Градієнтна програма елюювання наведена в таблиці 1. Таблиця 1 Градієнтна програма елюювання Час хроматографування, хв. 0-2 2-5 5-9 9-12 12-15 15 20 25 РФ А, % 90 9035 35 3590 90 РФ В, % 10 1065 65 6510 10 Швидкість потоку рухомої фази: 1,2 мл/хв.; температура колонки: 25 °C; детектування: за довжини хвилі 254 нм; об'єм інжекції: 50 мкл. Хроматографували розчин порівняння та випробовуваний розчин поперемінно не менше 3 разів. Час хроматографування складає 15 хв. Хроматографічна система вважається придатною, якщо для розчину порівняння виконуються наступні умови: - ефективність хроматографічної колонки, розрахована за основним піком дибамку, має бути не менше 20000 теоретичних тарілок; - коефіцієнт симетрії основного піка дибамку має бути не менше 0,8 та не більше 1,5; - відносне стандартне відхилення (RSD, %), розраховане для площі основного піку повторних хроматограм, не повинен перевищувати значення (таблиця 2). Таблиця 2 Відносне стандартне відхилення Кількість паралельних інжекцій RSD, % 2 3 4 5 6 7 8 0,32 0,84 1,20 1,48 1,72 1,93 2,11 Вміст дибамку, у відсотках, обчислюють за формулою: X,%  30 S  m 0  50  P  100 S  m 0  P  S 0  m  50  100 S0  m , де S - середнє значення площ піків дибамку, розраховане з хроматограм випробовуваного розчину; S 0 - середнє значення площ піків дибамку, розраховане з хроматограм розчину порівняння; m - маса наважки субстанції, у грамах; 35 m0 - маса наважки дибамку, взятої для приготування розчину порівняння, у грамах; P - вміст основної речовини в дибамку, взятої для приготування розчину порівняння, у відсотках; Вміст C17H18N2O2 в субстанції має бути від 98,0 % до 102,0 % у перерахунку на суху речовину. Розрахунок кількісного вмісту домішок у субстанції дибамку наведена у таблиці 3. 2 UA 118993 U Таблиця 3 Розрахунок кількісного вмісту дибамку Розчин порівняння 15026022 15059815 15024491 14980890 15070072 15032258 0,2334773 0,0522 Площі піків Середнє значення RSD, % Маса наважки, г Кількісний вміст, % Випробовуваний розчин 14151076 14090159 14115252 14125995 14116786 14119854 0,155362 0,0490 99,79 Метрологічні характеристики середнього результату кількісного визначення дибамку наведені у таблиці 4. 5 Таблиця 4 Метрологічні характеристики середнього результату кількісного визначення дибамку (Р=95 %, t(P,)=2,5706)  5 10 15 20 25 x 100,07 S S2 -2 8,960•10 Sx x x ,% 0,2993 0,1222 0,6032 0,2463 0,2461 Таким чином, заявлено новий спосіб визначення кількісного вмісту 4 дибамку шляхом застосування методу ВЕРХ, який за рахунок встановлених умов градієнтного хроматографування із використанням як рухомих фаз фосфатного буферного розчину рН 5,5 та ацетонітрилу забезпечує придатність хроматографічної системи відповідно до видом ДФУ, дозволяє із високою точністю визначати кількісний вміст діючої речовини у субстанції шляхом використання порівняння площ піків дибамку, розрахованих із паралельних інжекцій випробовуваного розчину та площ піків, розрахованих із паралельних інжекцій розчину порівняння, та є перспективним для застосування в аналізі кількісного вмісту діючої речовини у субстанції дибамку. Джерела інформації: 1. Георгіянц Вікторія Акопівна. Цілеспрямований синтез протисудомних засобів в ряду арил(алкіл)амідів малонової кислоти [Текст]: дис. д-ра фармац. наук: 15.00.02 / Георгіянц Вікторія Акопівна; Національний фармацевтичний ун-т. - X., 2004. - 368 арк. 2. Державна Фармакопея України: в 3 т. / ДП УНФЦЯЛЗ. - 2-е вид. - Харків: ДП УНФЦЯЛЗ, 2015. - Т. 1. - 1128 с. 3. Визначення нового протисудомного засобу "Дибамк" у крові методом високоефективної рідинної хроматографії /В.А. Георгіянц, Н.І. Колочавіна, Н.Ю. Бевз, В.А. Ханін// Клінічна фармація. - 2004. - № 1. - С. 8-11. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб кількісного визначення дибамку методом ультрависокоефективної рідинної хроматографії із використанням монолітної колонки, який відрізняється тим, що використовують аналітичну систему ультра-ВЕРХ із монолітною колонкою, заповненою силікагелем октадецилсилільним, як рухому фазу А використовують фосфатний буферний розчин рН 5,5, рухому фазу В ацетонітрил - для хроматографії Р; дослідження проводяться в умовах градієнтного елюювання: час (хв.)/% РФА: 0/90; 2/9035; 5/35; 9/3590; 12/90; час хроматографування 15 хв.; швидкість потоку рухомої фази 1,2 мл/хв., об'єм інжекції 50 мкл, температура колонки 25 °C; детектування за довжини хвилі 254 нм, час утримування піку основної речовини складає 8 хв. 3 UA 118993 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4