Спосіб визначення супровідних домішок дибамку методом високоефективної рідинної хроматографії

Реферат: Спосіб визначення супровідних домішок дибамку методом високоефективної рідинної хроматографії, при якому повне хроматографічне розділення компонентів досягається виконанням при градієнтному елююванні з використанням як рухомих фаз 0,1 % розчинів трифтороцтової кислоти у воді та у ацетонітрилі, на колонці, заповненій силікагелем октадецилсилільним. Програма градієнтного елюювання: час (хв)/% РФ А: 0/90; 5/90→65; 15/65; 25/65→90; 30/90. Час хроматографування 35 хв, швидкість потоку рухомої фази 1 мл/хв, об'єм інжекції 50 мкл, температура колонки 25 °C. Детектування здійснюють за довжини хвилі 210 нм. UA 117539 U (12) UA 117539 U UA 117539 U 5 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до способів хімічного аналізу, а саме до способів визначенні супровідних домішок методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) і може бути використаний при контролю якості лікарських засобів. У літературі описано та запатентовано [1] синтез динамку (дибензиламіду малонової кислоти) відповідно до схеми: O CH2(COOEt)2 + N H NH2 2 15 20 25 30 35 40 45 50 N H 3 2 10 O . Схема синтезу цільового продукту (3) включає одну стадію, а саме - реакцію амідування діетилмалонату (1) бензиламіном (2). Опираючись на зазначену схему, домішками синтезу дибамку можуть бути вихідні продукти синтезу. Для контролю супровідних домішок дибамку у літературі описаний метод хроматографії у тонкому шарі сорбенту (ТШХ) [2] в системі розчинників н-бутанол - льодяна оцтова кислота - вода (40:10:1). Автори пропонують цей метод для визначення супровідних домішок дибамку як у субстанції, так і у капсулах дибамку. Однак метод ТШХ є менш чутливим та дозволяє лише приблизно встановити кількісний вміст домішок. Державна Фармакопея України [3] рекомендує у цьому випадку використовувати метод ВЕРХ, як найбільш чутливий і селективним інструментальний методом аналізу. Як прототипу вибрано спосіб визначення дибамку у крові методом зворотнофазної рідинної хроматографії [4]. Умови аналізу: хроматографічна колонка Xterra розміром 4 × 250 мм, заповнена сорбентом з привитою фазою октадецилсилікагель, зерення 5 мкм; рухома фаза А: ацетонітрил, дегазований фільтрацією крізь фільтр ПОР-16; рухома фаза Б: фосфатний буфер, дегазований фільтрацією крізь фільтр ПОР-16; режим елюювання -градієнтний; швидкість потоку - 1 мл/хв; температура термостата колонки 30С; детектування УФ-спектрофотометр за довжини хвилі 254 нм; об'єм проби 100 мкл. До недоліків способу можна віднести умови хроматографування, які не забезпечують належного хроматографічного розділення піків основної речовини та супровідних домішок, та не можуть бути використані при кількісному визначенні супровідних домішок. Крім цього спосіб застосовується лише для кількісного визначення дибамку у біологічних рідинах. Задача корисної моделі полягає у створенні простого способу визначення супровідних домішок у субстанції методом ВЕРХ, який би міг забезпечити повне хроматографічне розділення дибамку та супровідних домішок бензиламіну (домішка А) та діетилмалонату (домішка В) із різними гідрофільними властивостями, а також забезпечити необхідну точність та відтворюваність результатів аналізу при проведенні контролю якості. Поставлена задача вирішується тим, що кількісне визначення супровідних домішок дибамку здійснюють методом високоефективної рідинної хроматографії, згідно з корисною моделлю, повне хроматографічне розділення компонентів досягається при градієнтному елююванні з використанням як рухомих фаз 0,1 % розчини трифтороцтової кислоти у воді та у ацетонітрилі, на колонці, заповненій силікагелем октадецилсилільним; програма градієнтного елюювання: час (хв.)/% РФ А: 0/90; 5/90→65; 15/65; 25/65→90; 30/90; час хроматографування 35 хв; швидкість потоку рухомої фази 1 мл/хв, об'єм інжекції 50 мкл, температура колонки 25 °C; детектування за довжини хвилі 210 нм. Всі параметри заявленого способу визначено дослідним шляхом. Пропоновані умови хроматографування забезпечують повне розділення досліджуваних речовин. Для елюювання домішки А оптимальною є рухома фаза із вмістом ацетонітрилу близько 10 %, а для розділення піків домішки В і дибамку необхідно збільшити елююючу силу рухомої фази за рахунок збільшення вмісту ацетонітрилу до 35 %, тому запропоновано проводити розділення домішок і основної речовини при градієнтному елююванні. У вказаних умовах час утримування піку основної речовини складає близько 21,5 хв, піку домішки А близько 3,4 хв, піку домішки В - близько 17,0 хв. У порівнянні із прототипом корисна модель характеризується наступними перевагами:поперше, повне розділення піку основної речовини та супровідних домішок, по-друге, пропонується використання більш простих рухомих фаз. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. Випробовуваний розчин: 50 мг (точна наважка) субстанції дибамку поміщали у мірну колбу місткістю 25 мл, додавали 15 мл ацетонітрилу Р, обробляли протягом 5 хв на 1 UA 117539 U 5 10 15 20 ультразвуковій бані до повного розчинення та доводили об'єм розчину до позначки тим же розчинником, ретельно перемішували. Фільтрували крізь мембранний фільтр з діаметром пор не більше 0,45 мкм. Розчин порівняння (а): 1,0 мл випробовуваного розчину поміщали у мірну колбу місткістю 100 мл, доводили об'єм розчину ацетонітрилом Ρ до позначки та перемішували. Розчин порівняння (b): 5,0 мл розчину порівняння (а) поміщали у мірну колбу місткістю 50 мл, доводили об'єм розчину до позначки та перемішували. Розчин порівняння домішки А: 1 мл бензиламіну Ρ поміщали у мірну колбу місткістю 50 мл, додавали 30 мл ацетонітрилу Р, об'єм розчину доводили до позначки тим же розчинником та перемішували. Розчин порівняння домішки В: 1 мл діетилмалонату Ρ поміщали у мірну колбу місткістю 50 мл, додавали 30 мл ацетонітрилу Р, об'єм розчину доводили до позначки тим же розчинником та перемішували. Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи: 5,0 мл розчину порівняння (а), 5,0 мл розчину порівняння домішки А та 5,0 мл розчину порівняння домішки В поміщали у мірну колбу місткістю 20 мл, доводили об'єм розчином ацетонітрилу Ρ до позначки та перемішували. Усі розчини використовують свіжоприготовленими. Умови хроматографування: рідинний хроматограф Varian "ProStar" з діодно-матричним детектором. Нерухома фаза: колонка хроматографічна 150×4,6 мм, заповнена силікагелем октадецилсилільним для хроматографії Ρ Symmetry® С18, із розміром часток 3,5 мкм. Рухома фаза А: 0,1 % розчин трифтороцтової кислоти Ρ у воді Р; рухома фаза В: 0,1 % розчин трифтороцтової кислоти Ρ у ацетонітрилі Р. Градієнтна програма хроматографування наведена у таблиці 1. Таблиця 1 Градієнтна програма хроматографування Час хроматографування, хв 0-5 5-15 15-25 25-30 30-35 РФ А, % 90 90 → 65 65 65 → 90 90 РФ В, % 10 10 → 35 35 35 → 10 10 25 30 35 40 Швидкість потоку рухомої фази: 1 мл/хв; Температура колонки: 25 °C; Детектування: за довжини хвилі 210 нм; Об'єм інжекції: 50 мкл. Хроматографували розчинник (бланк-хроматограма), розчин для перевірки придатності хроматографічної системи. Для ідентифікації домішок використовували хроматограму розчину для перевірки придатності хроматографічної системи. Відносні часи утримування (час утримування дибамку близько 21,6 хв). Порядок виходу піків та відносні часи утримування: бензиламін (домішка А 0,16); діетилмалонат (домішка В - 0,79). Хроматографують розчин порівняння (b), розчин порівняння (а) та випробовуваний розчин не менше 3 разів. Хроматографічна система вважається придатною, якщо: - коефіцієнт симетрії основного піку має не менше 0,8 і не більше 1,5; - відносне стандартне відхилення (RSD, %), розраховане для площі основного піку розчину порівняння (а), не має перевищувати зазначені значення [2] (таблиця 2). Таблиця 2 Відносне стандартне відхилення Кількість паралельних інжекцій RSD, % 2 3 4 5 6 7 8 0,32 0,84 1,20 1,48 1,72 1,93 2,11 2 UA 117539 U 5 10 15 Нормування: - домішка А: площа піка не має перевищувати 1,5 площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння (b) (0,15 %); - домішка В: площа піка не має перевищувати 1,5 площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння (b) (0,15 %); - будь-яка інша домішка: площа піка не має перевищувати 1,0 площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння (b) (0,1 %); - сума домішок: сума площ усіх піків не має перевищувати 1,0 площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння (а) (1,0 %); - не враховують: піки, площа яких становить менше 0,2 площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння (b). Також не враховують піки, які за часами утримування співпадають з відповідними піками на бланк-хроматограмі. За результатами дослідження в субстанції динамку можуть бути присутні наступні домішки (таблиця 3). Таблиця Домішки субстанції дибамк O Субстанція Дибамк Домішка А 20 N H N H NH2 Бензиламін Домішка В Домішка С Домішка D O Діетилмалонат CH2(COOEt)2 Неідентифікована Неідентифікована Домішки А та В є домішками синтезу субстанції дибамку, домішки С та D - продукти розкладання субстанції. Кількісно вміст домішок визначали відносно площ піків розчину порівняння (а) та розчину порівняння (b). Розрахунок кількісного вмісту домішок у субстанції дибамку наведена у таблиці 4. Таблиця 4 Розрахунок кількісного вмісту домішок синтезу у субстанції дибамк Площі піків Середнє % домішки Одинична домішка Сума домішок Розчин порівняння (а) 24576586 24453164 24514875 1,0 Розчин порівняння (b) 2559024 2544724 2551874 0,1 Домішка А Не виявлена 0,13 Домішка В 3446191 3364557 3405374 0,13